MXene纳米颗粒Ti3C2TX与光热效应促进糖尿病小鼠创面愈合

doi:10.12307/2025.489

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (28): 6052-6060.doi: 10.12307/2025.489

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MXene纳米颗粒Ti3C2TX与光热效应促进糖尿病小鼠创面愈合

李美运1，2，刘森1，陈开元1，施灵1，宋美陈1，曹家洪1，武艳1，于晶3

1牡丹江医学院生命科学学院，黑龙江省牡丹江市 157001；2中国人民解放军南部战区总医院临床病理科，广东省广州市 510030；3牡丹江医学院附属红旗医院内分泌科，黑龙江省牡丹江市 157001

收稿日期:2024-06-07 接受日期:2024-08-14 出版日期:2025-10-08 发布日期:2024-12-07
通讯作者: 于晶，副主任医师，牡丹江医学院附属红旗医院内分泌科，黑龙江省牡丹江市 157001
作者简介:李美运，女，1996年生，辽宁省营口市人，汉族，硕士，主要从事组织损伤与修复研究。
基金资助:
牡丹江市指导性科技计划项目(HT2022JG125)，项目负责人：武艳；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(2021-KYYWF-0515)，项目负责人：于晶

MXene nanoparticles Ti3C2Tx and photothermal effect promote wound healing in diabetic mice

Li Meiyun1, 2, Liu Sen1, Chen Kaiyuan1, Shi Ling1, Song Meichen1, Cao Jiahong1, Wu Yan1, Yu Jing3

1College of Life Sciences, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157001, Heilongjiang Province, China; 2Department of Clinical Pathology, General Hospital of Southern Theater Command of People’s Liberation Army of China, Guangzhou 510030, Guangdong Province, China; 3Department of Endocrinology, Hongqi Hospital, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157001, Heilongjiang Province, China

Received:2024-06-07 Accepted:2024-08-14 Online:2025-10-08 Published:2024-12-07
Contact: Yu Jing, Associate chief physician, Department of Endocrinology, Hongqi Hospital, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157001, Heilongjiang Province, China
About author:Li Meiyun, MS, College of Life Sciences, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157001, Heilongjiang Province, China; Department of Clinical Pathology, General Hospital of Southern Theater Command of People’s Liberation Army of China, Guangzhou 510030, Guangdong Province, China
Supported by:
Mudanjiang City Guided Science and Technology Plan Project, No. HT2022JG125 (to WY); Heilongjiang Provincial Higher Education Institutions Basic Scientific Research Business Expense Research Project, No. 2021-KYYWF-0515 (to YJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

MXene纳米颗粒：MXene是一种由过渡金属碳化物、氮化物或碳氮化物构成的独特2D材料，因具有高电导率、高弹性模量、二维柔韧性以及可亲水表面，表现出优异的光学、电子和机械性能，在各种领域得到广泛研究。

MXene光热效应：MXene在接受光照射过程中会吸收光子所携带的能量，并与其晶格发生相互作用，从而引发粒子温度上升，这种机制使得MXene能够高效地将光能转化为热能，在医药、能源领域等发面发挥重要作用。

背景：MXene纳米颗粒具备出色的亲水性、生物相容性和抗菌特性，被广泛应用于创面、肿瘤、神经修复和心血管等治疗领域，目前尚不清楚MXene纳米颗粒对糖尿病创面愈合的作用。
目的：考察MXene纳米颗粒Ti3C2Tx的体外抗氧化、抗炎和光热抗菌活性，以及对糖尿病小鼠创面的修复效果。
方法：①体外实验：采用MTT法检测不同质量浓度Ti3C2Tx对小鼠成纤维细胞(NIH-3T3)的毒性作用。将NIH-3T3细胞暴露在H2O2中，采用MTT法检测不同质量浓度Ti3C2Tx对NIH-3T3细胞的保护作用。将NIH-3T3细胞暴露在H2O2中，分析光照(或不光照)处理下Ti3C2Tx(20 μg/mL)对NIH-3T3细胞活性氧生成的影响。将RAW264.7巨噬细胞分3组处理：对照组、脂多糖组与脂多糖+Ti3C2Tx组，采用实时定量PCR法检测细胞中特定基因(CD86、白细胞介素6、CD206、精氨酸酶1)的表达。将大肠杆菌(或金黄色葡萄球菌)分3组处理：对照组、Ti3C2Tx组、Ti3C2Tx光照组，利用平板菌落计数法计算细菌存活率。②体内实验：通过腹腔注射链脲佐菌素的方法构建ICR小鼠糖尿病模型，造模成功后在小鼠背部建立全层皮肤缺损创面，随机分3组干预：对照组(n=6)、Ti3C2Tx组(n=6)和Ti3C2Tx光照组(n=6)，观察创面愈合情况，干预后第7天进行创面组织CD31、CD206免疫组化染色，干预后第7，14天进行创面组织苏木精-伊红与Masson染色。将Ti3C2Tx溶液注射至ICR小鼠皮下，在光照(或非光照)后，通过血生化检测分析Ti3C2Tx对小鼠的毒性作用。

结果与结论：①体外实验：Ti3C2Tx质量浓度在5-160 μg/mL范围内对NIH-3T3细胞无毒性作用，在质量浓度20 μg/mL时可增加NIH-3T3细胞存活率。10-80 μg/mL的Ti3C2Tx可显著提升H2O2干预下的NIH-3T3细胞存活率。Ti3C2Tx可显著抑制H2O2干预下NIH-3T3细胞活性氧的生成，光照处理可进一步提升Ti3C2Tx抑制活性氧生成的作用。Ti3C2Tx能够有效抑制由脂多糖诱导的巨噬细胞炎症，促进细胞向具有抗炎特性的M2型巨噬细胞转化。Ti3C2Tx与Ti3C2Tx光照均可显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，并且Ti3C2Tx光照的抑制效果更显著。②体内实验：创面大体与组织学分析显示，Ti3C2Tx与Ti3C2Tx光照均可促进糖尿病小鼠创面的愈合，并且Ti3C2Tx光照的促进作用更显著。免疫组化染色结果显示，Ti3C2Tx与Ti3C2Tx光照均可抑制糖尿病创面的炎症反应并促进血管的生成，并且Ti3C2Tx光照的作用更显著。血生化检测结果显示，Ti3C2Tx与光照对小鼠无明显毒性作用。③结果表明，Ti3C2Tx借助独特的光热效应能够高效地展现抗氧化、抗炎和抗菌特性，促进糖尿病小鼠创面的愈合。

https://orcid.org/0009-0007-7815-6987 (李美运)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: Ti3C2Tx, MXene纳米颗粒, 糖尿病创面, 抗氧化, 抗炎, 抗菌, 工程化创面材料

Abstract: BACKGROUND: MXene nanoparticles, due to their unique hydrophilicity, biocompatibility, and antibacterial properties, are widely used in wound, tumor, nerve repair, and cardiovascular treatments. However, it is still unclear what effect MXene nanoparticles have on diabetic wound healing.
OBJECTIVE: To investigate the in vitro antioxidant, anti-inflammatory and photothermal antibacterial properties of MXene nanoparticles Ti3C2Tx as well as their effect on wound repair in diabetic mice.
METHODS: (1) In vitro experiments: The cytotoxicity of Ti3C2Tx nanoparticles on mouse fibroblasts (NIH-3T3) at various concentrations was evaluated using the methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. NIH-3T3 cells were exposed to H2O2, and the MTT assay was used to detect the protective effects of different mass concentrations of Ti3C2Tx on NIH-3T3 cells. NIH-3T3 cells were exposed to H2O2, and the effect of Ti3C2Tx (20 μg/mL) on the generation of reactive oxygen species in NIH-3T3 cells was analyzed under illumination (or no illumination) treatment. RAW264.7 macrophages were divided into three groups: control group, lipopolysaccharide group, and lipopolysaccharide+Ti3C2Tx group. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of specific genes (CD86, interleukin 6, CD206, arginase 1) in the cells. Escherichia coli (or Staphylococcus aureus) were divided into three groups: control group, Ti3C2Tx group, and Ti3C2Tx illumination group. The bacterial survival rate was calculated by plate colony counting method. (2) In vivo experiments: Streptozotocin was administered intraperitoneally to ICR mice to induce a diabetic condition. After successful modeling, a full-thickness skin defect wound was created on the back of the mice using a circular punch. The experiment was divided into three groups: control group (n=6), Ti3C2Tx group (n=6), and Ti3C2Tx illumination group (n=6). The wound healing was observed, and CD31 and CD206 immunohistochemical staining of wound tissue was performed on day 7 after intervention. Hematoxylin-eosin staining and Masson staining of wound tissue were performed on days 7 and 14 after intervention. Ti3C2Tx solution was injected subcutaneously into ICR mice. After illumination (or non-illumination) exposure, the toxic effects of Ti3C2Tx on mice were analyzed by blood biochemical detection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiments: Ti3C2Tx showed no cytotoxicity on NIH-3T3 cells at mass concentrations ranging from 5-160 μg/mL. It increased the survival rate of NIH-3T3 cells at a mass concentration of 20 μg/mL. Ti3C2Tx at 10-80 μg/mL significantly improved the survival rate of NIH-3T3 cells under H2O2 intervention. Ti3C2Tx significantly inhibited the generation of reactive oxygen species in NIH-3T3 cells under the intervention of H2O2, and illumination treatment further enhanced the effect of Ti3C2Tx on inhibiting the generation of reactive oxygen species. Ti3C2Tx effectively inhibited macrophage inflammation induced by lipopolysaccharide and promoted the transformation of cells into M2 macrophages with anti-inflammatory properties. Both Ti3C2Tx and Ti3C2Tx illumination significantly inhibited the growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus, and the inhibitory effect of Ti3C2Tx illumination was more significant. (2) In vivo experiments: Gross and histological analyses of the wound surface showed that both Ti3C2Tx and Ti3C2Tx illumination promoted wound healing in diabetic mice, and the promotion effect of Ti3C2Tx irradiation was more significant. Immunohistochemical staining results showed that both Ti3C2Tx and Ti3C2Tx illumination inhibited the inflammatory response in diabetic wounds and promoted angiogenesis, and the effect of Ti3C2Tx illumination was more significant. Blood biochemical test results showed that Ti3C2Tx and illumination had no obvious toxic effects on mice. (3) These results indicate that Ti3C2Tx nanoparticles efficiently promote the healing of skin wounds in a diabetic mouse model through antioxidation, anti-inflammation, and antibacterial actions via photothermal effects.

Key words: Ti3C2Tx, MXene nanoparticle, diabetic wound, antioxidation, anti-inflammation, antibacterial, engineered wound material

中图分类号:

李美运, 刘森, 陈开元, 施灵, 宋美陈, 曹家洪, 武艳, 于晶. MXene纳米颗粒Ti3C2TX与光热效应促进糖尿病小鼠创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(28): 6052-6060.

Li Meiyun, Liu Sen, Chen Kaiyuan, Shi Ling, Song Meichen, Cao Jiahong, Wu Yan, Yu Jing. MXene nanoparticles Ti3C2Tx and photothermal effect promote wound healing in diabetic mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(28): 6052-6060.

图/表（结果） 7

2.1 Ti3C2Tx的细胞毒性作用采用NIH-3T3细胞作为模型细胞，系统评估了Ti3C2Tx的生物相容性。MTT检测结果显示，在0-160 μg/mL质量浓度范围内，Ti3C2Tx对NIH-3T3细胞无毒性作用，并且20 μg/mL Ti3C2Tx可显著提升NIH-3T3细胞存活率，见图1A。
2.2 Ti3C2Tx对氧化应激条件下NIH-3T3细胞的保护作用实验探索了Ti3C2Tx在氧化应激环境下对细胞的保护作用。MTT检测结果显示，H2O2组NIH-3T3细胞存活率明显低于对照组(P < 0.000 1)；相较于H2O2组，10，20，40，80 μg/mL Ti3C2Tx可显著提升NIH-3T3细胞存活率(P < 0.000 1)，并且20 μg/mL Ti3C2Tx 的提升作用最显著，见图1B。
采用二氢乙锭作为荧光探针，用于精确检测细胞内的活性氧水平，结果见图1C，D所示。经过H2O2处理后，NIH-3T3细胞内产生了高强度的活性氧荧光信号，这与细胞内活性氧水平显著增高的趋势紧密相关，这一实验结果提供了关于氧化应激状态下细胞内活性氧变化情况的直观证据。与H2O2组相比，Ti3C2Tx组、Ti3C2Tx光照组活性氧荧光信号明显减弱，并且Ti3C2Tx光照组活性氧荧光信号减弱更显著，表明Ti3C2Tx结合808 nm近红外光可有效降低H2O2诱导的细胞内活性氧生成。

2.3 Ti3C2Tx的体外抗炎作用通常情况下，在炎症反应中巨噬细胞会表现为促炎基因表达的上调，而抗炎基因表达则会相应下调，因此，通过监测这些基因表达的变化能够更准确地了解Ti3C2Tx对炎症反应的调控作用。如图2所示，与对照组比较，脂多糖组CD86、白细胞介素6 mRNA表达升高(P < 0.001，P < 0.01)，CD206、精氨酸酶1 mRNA表达降低(P < 0.05，P < 0.001)；与脂多糖组比较，脂多糖+Ti3C2Tx组CD86、白细胞介素6 mRNA表达降低(P < 0.05)，CD206、精氨酸酶1 mRNA表达升高(P < 0.01，P < 0.001)。

2.4 Ti3C2Tx的体外抗菌作用选取了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为模型菌，深入研究了Ti3C2Tx纳米颗粒在光照条件下的抗菌效果。如图3所示，与对照组相比，Ti3C2Tx组细菌菌落数量呈现出明显的下降趋势；与Ti3C2Tx组相比，Ti3C2Tx光照组细菌菌落数量呈现出明显的下降趋势，结果揭示了光照在提升Ti3C2Tx抗菌性能方面具有重要作用。

2.5 Ti3C2Tx对糖尿病小鼠创面愈合的影响
2.5.1 实验动物数量分析糖尿病创面造模18只小鼠全部进入结果分析。
2.5.2 各组糖尿病小鼠创面宏观愈合情况观察图4A展示了不同时间点下各组创面的愈合进度。图4B模拟了干预后第0，7和14天的场面愈合图。实验结果显示，随着干预时间的延长，各组创面愈合率升高，Ti3C2Tx组干预后第7，14天的创面愈合率高于对照组(P < 0.001，P < 0.05)，Ti3C2Tx光照组干预后第7，14天的创面愈合率高于Ti3C2Tx组(P < 0.001，P < 0.01)，见图4C。

2.5.3 各组糖尿病小鼠创面组织学染色分析通过组织学染色分析来评价各组创面愈合效果，并测量创面长度，结果见图5。苏木精-伊红染色结果显示，干预后第7天，各组创面长度有显著差异，其中对照组创面长度最长，Ti3C2Tx光照组创面长度最短；干预后第14天，各组创面长度进一步缩短，与对照组相比较，Ti3C2Tx组和Ti3C2Tx光照组创面愈合更快，其中愈合效果最好的是Ti3C2Tx光照组，并且在Ti3C2Tx光照组组织样本中观察到了较多的皮肤附属器，而相比之下，其他组别中几乎未见或仅见少量皮肤附属器。此外，通过Masson染色进一步分析发现，干预后第7天，各组创面均产生了大量的胶原纤维，其中以Ti3C2Tx光照组胶原纤维最为丰富。结果提示，Ti3C2Tx的光照处理不仅促进了创面愈合，还刺激了皮肤附属器的生成，为创面的快速修复提供了有力支持。

2.5.4 各组糖尿病小鼠创面新生血管表达和体内抗炎作用干预后第7天，通过CD31免疫组化染色分析创面区域血管形成情况，CD206免疫组化染色分析创面区域炎症情况，结果见图6。结果显示，Ti3C2Tx组CD31、CD206阳性表达多于对照组(P < 0.05，P < 0.01)，Ti3C2Tx光照组CD31、CD206阳性表达多于Ti3C2Tx组(P < 0.05)。

2.6 Ti3C2Tx 小鼠体内毒性分析结果结果显示，各组小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性及尿素氮、肌酐水平比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图7，说明Ti3C2Tx对小鼠无毒性作用。

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引言

2021-12-06，根据国际糖尿病联盟(IDF)发布的第10版《全球糖尿病地图》，糖尿病总人数预计到2030年将增至6.43亿(占全球人口11.3%)，到2045年将增至7.83亿(占全球人口12.2%)。研究发现，高达25%的糖尿病患者终生遭受慢性创面不愈合的风险，许多糖尿病患者不得不接受截肢手术以治疗足部溃疡[1]。因此，如何有效地修复糖尿病创面已成为创面修复领域迫切需要解决的问题[2]。伤口愈合是一个复杂和互动的过程，涉及止血、炎症、增殖和组织重塑多个阶段[3]。在糖尿病创面愈合过程中，长期存在的高糖、高脂环境能够激活多元醇代谢通路、己糖胺通路及非酶促糖基化反应等多种代谢途径，这些代谢途径的激活会导致细胞内环境紊乱，从而使得创面无法通过正常有序的修复过程及时愈合。糖尿病创面的主要表现为氧化应激水平上升、炎症消退延迟、细菌滋生、血管新生及基质沉积减少等，多重因素导致创面经久不愈[4-6]。因此，迫切需要开发一种抗氧化、抗炎、抗感染的多模式治疗策略来促进糖尿病创面的重建。
近年来，2D材料如石墨烯及其衍生物、过渡金属二硫属化物、黑磷、MXene、金属有机骨架和六方氮化硼等，由于具备独特的平面结构且易于表面改性，展现出优异的热性能、光学性能和载流子迁移率等特点，广泛应用于光疗、催化、传感器、能量储存、能量传输等领域[7]。在这些2D纳米片中，MXene纳米颗粒作为一种新型的二维材料，由过渡金属碳化物、氮化物或碳氮化物构成，其通式为Mn+1AXn，这里面的M代表过渡金属，诸如Sc、Ti、Zr、Cr和Mo等，A通常代表第三主族和第四主族化学元素，诸如Al、Si、P、Ga、Ge、As等，而X则代表C或N元素[8]。MXene纳米颗粒中的Ti3C2Tx具有较高的生物相容性、优越的亲水性、电导率和强近红外吸收的光热效应[9-10]，目前大多数研究主要将光热疗法应用于肿瘤治疗方面[11-12]，但也有研究探索了Ti3C2Tx在抗菌方面的潜力[13-14]。LIU等[15]开发了一种一步机械剥离方法用于快速制备高浓度的Ti3C2Tx，这种涉及机械力的合成途径赋予Ti3C2Tx具有许多不规则的锋利边缘，产生独特的纳米刀效应，可以成功破坏细菌细胞壁，表现出良好的抗菌活性。除此之外，MXene纳米颗粒也能够通过强大的抗氧化、抗炎和血管生成活性来增强组织再生[16]，在治疗心肌梗死和神经修复方面发挥巨大优势[17-18]。目前尚不清楚MXene纳米颗粒是否可通过抗氧化、抗炎及抗感染等功效来促进糖尿病创面的愈合。因此，此次实验首先考察了MXene纳米颗粒Ti3C2Tx在体外实验中的抗氧化、抗炎和光热抗菌活性，通过光热治疗评估Ti3C2Tx对糖尿病小鼠皮肤创面的修复效果，从而为这一治疗方法在糖尿病创面研究领域提供坚实的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验和体内动物实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2023年3月至2024年4月在牡丹江医学院医药研究中心科研共享平台完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞成纤维细胞NIH-3T3(源自balb/c系小鼠胚胎细胞株)和RAW264.7巨噬细胞(源自Abelson小鼠白血病病毒诱导的肿瘤)均购自上海酶研生物科技有限公司。
1.3.2 实验动物雄性ICR小鼠36只，SPF级，七八周龄，体质量25-30 g，用于创建糖尿病创面模型，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(黑)2019-003。小鼠饲养于温度 (22±2) ℃、相对湿度(65±10)%、光照/黑暗每12 h交替循环、干净通风的实验动物房中，饲养期间自由进食水。
动物实验已获得牡丹江医学院动物伦理委员会批准(批准号：20240221-43)，并严格遵守国家关于动物保护的相关规定。所有实验所用动物在进行手术前均已实施麻醉，均采取了所有可能的措施以确保将动物的疼痛、不适及死亡风险降至最低。
1.3.3 菌种、药物与试剂 Ti3C2Tx购于江苏先丰纳米；胰酶消化液、活死细胞染色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白胨、酵母提取物均购自英国Oxoid公司；琼脂粉购自德国Biofroxx公司；甲醛购自辽宁泉瑞试剂有限公司；透明剂购自上海雷根生物科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；H2O2、脂多糖均购自上海懋康生物科技有限公司；活性氧荧光探针(二氢乙锭)购自北京索莱宝科技有限公司；CD31和CD206抗体均购自美国Affinity公司；所有引物均购自上海生工生物工程公司；RNA提取试剂盒购自美国Omega公司；RNA反转录试剂盒购自瑞士Roche公司；异氟烷购自深圳瑞沃德公司；链脲佐菌素和Masson试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均购自湖南丰晖生物科技有限公司。
1.3.4 实验仪器 CO2培养箱(Forma)购自美国Thermo Fisher公司；酶标仪(Spectra Max M2)购自美国Molecular Devices公司；荧光显微镜(DMI8)购于德国Leica公司；生物组织脱水机(HS-1000)购自华速科技有限公司；荧光定量PCR仪(StepOne)购自美国ABI公司；Nanodrop (2000)购自美国Thermo Fisher Scientific；808 nm激光器(FC-808-5000-MM)购自上海熙隆广电科技有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 Ti3C2Tx的细胞毒性在含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养NIH-3T3细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育。将NIH-3T3细胞接种到96孔板中，细胞密度为3×103/孔，培养24 h后弃去孔中培养基，分别加入质量浓度0 (对照，加入含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基)，5，10，20，40，80和160 μg/mL Ti3C2Tx溶液(溶剂为含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基)，同时设置空白组(仅加入含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，无细胞)，每孔100 μL，每组3个复孔。继续孵育24 h后，每孔加入100 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h，再加入二甲基亚砜进行反应，使用酶标仪在490 nm处测量吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组A490-空白组A490)/(对照组A490-空白组A490)×100%。
1.4.2 Ti3C2Tx对氧化应激条件下NIH-3T3细胞的保护作用将NIH-3T3细胞接种于96孔板中，细胞密度为3×103/孔，观察细胞贴壁后分组处理：对照组不进行任何处理，H2O2组加入600 μmol/L H2O2[19]，实验组在加入600 μmol/L H2O2的基础上再分别加入5，10，20，40，80 μg/mL Ti3C2Tx，同时设置空白组(仅加入含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，无细胞)，每组设置3个复孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育。孵育24 h后，采用MTT法检测细胞吸光度值，计算细胞存活率，方法同上。
为了进一步验证Ti3C2Tx的抗氧化作用，用二氢乙锭作为活性氧敏感的荧光探针分析细胞内活性氧的产生。将NIH-3T3细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×105/孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育。孵育24 h后分4组处理：对照组不进行任何处理，H2O2组加入600 μmol/L H2O2，Ti3C2Tx组加入20 μg/mL Ti3C2Tx，Ti3C2Tx光照组加入20 μg/mL Ti3C2Tx后进行光照处理(808 nm近红外光，0.75 W/cm2，照射15 min)，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育。孵育24 h后洗涤细胞，加入 10 μmol/L二氢乙锭孵育30 min，置于荧光显微镜下观察并拍照，使用Image J软件分析荧光强度。

1.4.3 Ti3C2Tx的体外抗炎作用将RAW264.7巨噬细胞接种于6孔板中，细胞密度为5×105/孔，待细胞贴壁稳定后分3组处理：对照组不进行任何处理，脂多糖组加入1 μg/mL脂多糖，脂多糖+Ti3C2Tx组同时加入1 μg/mL脂多糖与20 μg/mL Ti3C2Tx，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育。孵育24 h后，用PBS洗涤细胞以去除残余的培养基和刺激物。根据RNA提取试剂盒说明书提取细胞内的RNA，测量RNA的浓度和质量，确保样本的纯度和完整性。将每个样本的总RNA通过反转录反应转录成cDNA，作为实时定量PCR的模板。在实时定量PCR反应中，选用β-actin作为内源性参照基因进行归一化处理，以消除不同样本间可能存在的RNA质量和数量差异。根据ΔΔ-CT方法计算目的基因相对于对照组的表达水平。具体的引物序列详见表1。

1.4.4 Ti3C2Tx的光热杀菌作用在5 mL LB培养基中分别接种5 μL大肠杆菌(革兰阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰阳性菌)，并于37 ℃下连续摇动孵育过夜；第2天用LB培养基稀释至 1×107 CFU。取1 mL细菌稀释液分别加入5 mL EP管内，对照组不进行任何处理，Ti3C2Tx组加入20 μg/mL Ti3C2Tx，Ti3C2Tx光照组加入20 μg/mL Ti3C2Tx后进行光照处理(808 nm近红外光，0.75 W/cm2，照射15 min)，振荡均匀后放入37 ℃恒温摇床(200 r/min)中孵育2 h；将各组细菌悬液进行1 000倍的稀释处理，然后取30 μL稀释液，使用涂布器将菌液均匀地涂抹在琼脂平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。培养结束后取出平板，拍摄图像并进行菌落计数分析。每个样本的实验均重复3次，以确保结果的准确性。
1.4.5 Ti3C2Tx修复糖尿病创面
糖尿病创面模型的建立：18只ICR小鼠禁食12-16 h后，第1天腹腔注射链脲佐菌素100 mg/kg，之后则按照50 mg/kg的剂量连续注射2 d。1周后监测血糖水平，随机血糖水平≥16.7 mmol/L的小鼠视为糖尿病造模成功。造模成功后，剃除小鼠背部毛发，异氟烷吸入麻醉后，使用直径为6 mm的圆形打孔器在每只小鼠背部制造2个全层皮肤缺损创面，随机分3组干预：对照组(n=6)每个创面滴加0.1 mL的PBS，Ti3C2Tx组(n=6)每个创面滴加 0.1 mL Ti3C2Tx溶液(20 μg/mL)，Ti3C2Tx光照组(n=6)每个创面滴加 0.1 mL Ti3C2Tx溶液(20 μg/mL)后进行光照处理(808 nm近红外光，0.75 W/cm2，照射15 min)，每天干预1次。
创面宏观愈合评估：干预后第0，7，14天，分别利用数码相机拍摄并记录创面愈合状况。使用Image J软件对每个观察时间点的创面闭合区域进行精确测量，计算创面愈合率。创面愈合率(%)=(初始创面面积-特定时间创面面积) /初始创面面积×100%。
创面组织形态学变化：干预后第7，14天，每组随机选取3只小鼠，异氟烷吸入麻醉后取创面组织，利用Image J软件精确计算创面长度。为了确保组织结构的完整性，将组织样本置于40 g/L甲醛溶液中固定48 h，随后进行脱水处理、石蜡包埋、切片，切片厚度均为5 μm，利用苏木精-伊红、Masson染色全面评估创面组织的病理学特征。
创面组织CD31和CD206免疫组化染色：取干预后第7天的创面组织切片，常规脱蜡至水，在高温抗原修复后滴染一抗溶液[ CD31(稀释比1 ∶ 200)、CD206(稀释比1 ∶ 100)]，置于4 ℃冰箱内孵育过夜。12 h后用PBS洗涤3次，分别加入稀释比1∶ 1 000的二抗溶液室温孵育1 h，在显微镜下进行DAB显色，苏木精复染，脱水后用中性树脂封固，置于显微镜下观察CD31和CD206表达情况，棕色为阳性反应物。使用Image J软件分析CD31和CD206阳性表达面积比例。
1.4.6 Ti3C2Tx对小鼠的毒性作用选用7周龄、体质量在25-30 g区间的ICR小鼠18只，随机分成3组干预：使用1 mL注射器在对照组(n=6)小鼠背部皮下注射100 μL PBS，在Ti3C2Tx组(n=6)小鼠皮下注射100 μL Ti3C2Tx溶液(20 μg/mL)，在Ti3C2Tx光照组(n=6)小鼠皮下注射100 μL Ti3C2Tx溶液(20 μg/mL)后进行光照处理(808 nm近红外光，0.75 W/cm2，照射15 min)。皮下注射24 h后异氟烷吸入麻醉小鼠，经眼球取血后放于离心管中，2 500 r/min离心15 min后取血清，利用生化分析仪测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性及尿素氮、肌酐水平。
1.5 主要观察指标 Ti3C2Tx的体外生物相容性、抗氧化、抗炎以及抗菌性能，以及Ti3C2Tx对糖尿病小鼠创面愈合的作用。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析及相关图片的绘制。来自多个单个实验的数据用x±s表示，应用单因素方差分析进行统计分析，多组比较使用的是One Way ANOVA检验，Tukey多重检验方法比较各组之间差异，P < 0.05认为差异有显著意义。该文统计学方法已经牡丹江医学院生物统计学专家审核。

讨论

皮肤创面的愈合是一个复杂且连续的动态过程，涉及到多种细胞的协同作用、多种因素的调控以及适宜的微环境。糖尿病创面难愈的主要因素包括氧化应激障碍、持续的炎症反应及感染等[20-22]，因此，同时实现抗氧化、抗炎和抗菌的一体化治疗效果对促进糖尿病创面愈合具有重要作用。如前文所述，MXene纳米颗粒拥有一系列优异特性，故以往研究中大多学者利用其本身特性研发出各种可穿戴传感器及各种抗菌材料[23]。在众多材料体系中，大多数MXene常常仅被视为单一的抗菌剂而融入材料中[24]，而MXene独特的光热效应往往只被用来辅助抗菌治疗或杀灭肿瘤，这使得MXene的光热治疗领域受限。除了抗菌作用外，MXene纳米颗粒还表现出明显的抗氧化性和抗炎性[16，25]，这也为作者探讨MXene纳米颗粒Ti3C2Tx在改善糖尿病创面微环境中的作用提供了新的研究方向。此次实验从抗氧化、抗炎和抗菌3个方面分别考察MXene纳米颗粒Ti3C2Tx及其光热性能在改善糖尿病创面微环境中的作用。
在生物体进行有氧代谢的过程中会自然生成一系列具有特定活性的物质，统称为活性氧，其涵盖多种类型，如羟基自由基、超氧化物及过氧化氢等。这些自由基对于细胞而言是一把双刃剑，在正常生理状态下，它们参与到多种细胞功能中，但一旦产生过多或超过细胞的抗氧化防御能力，就会触发氧化应激反应，导致细胞内的关键大分子物质受到氧化损伤，这种损伤若长期累积，可能引发多种疾病[26]。这一点与糖尿病难愈性创面的发展和恶化有着密切的关联[27]。因此，修复创面、抑制氧化应激并清除过度表达的活性氧至关重要。值得庆幸的是，Ti3C2Tx纳米片上的自身基团具有清除活性氧的能力，可以有效减少氧化应激[28]。此次实验发现Ti3C2Tx具备显著的活性氧清除能力，能有效减轻因氧化应激而产生的细胞损伤，提高成纤维细胞在氧化应激环境中的存活率。因此，Ti3C2Tx可作为一种有效的活性氧清除剂，帮助细胞维持氧化还原平衡，减轻氧化应激反应，这一发现为开发新型抗氧化剂或药物提供了新的思路。
糖尿病创面的特殊微环境使巨噬细胞长期处于M1表型，受表观遗传的调控及多种细胞因子调节，M1无法向M2型极化，这导致糖尿病创面持续处于炎症正反馈循环的状态，阻止后续重建步骤的启动[29]。因此，促进M2型巨噬细胞极化也是恢复糖尿病创面修复的必要途径[30]。在大鼠胫骨前肌缺损修复实验中发现，MXene可以通过抗炎和抗氧化途径调节细胞微环境，从而促进血管生成、肌肉纤维形成和骨骼肌再生[31]。此次实验结果显示，经Ti3C2Tx干预后，巨噬细胞中促炎因子(如CD86、白细胞介素6)的表达水平显著降低，而抗炎因子(如CD206、精氨酸酶1)的表达水平则显著上升，说明Ti3C2Tx能够有效抑制由脂多糖诱导的巨噬细胞炎症，并促进细胞向具有抗炎特性的M2型巨噬细胞转化，为Ti3C2Tx在抗炎治疗中的应用提供了新的实验依据。
高糖血液是细菌良好的生长环境，因此，预防创面感染至关重要[32]。MXene的抗菌机制主要包括以下3点[33-34]：MXene具有锋利的边缘，可直接插入细菌胞膜造成物理破坏；MXene也通过产生氧化应激或电荷转移，造成微生物的化学损伤；MXene还可通过光热效应对细菌实现高效杀除。FENG等[35]通过原位硫化空心花形碘氧化铋(BiOI)制备了三维异质BiOI@Bi2S3/MXene纳米复合材料，当这种材料受到808 nm激光的照射时展现出了卓越的光热疗法和光动力疗法的联合抗菌效果，该纳米复合材料对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效率分别高达99.7%和99.8%，显示出其在抗菌领域的巨大潜力。
此次实验结果显示，Ti3C2Tx纳米颗粒可以发挥光热效应有效降低细菌增殖。糖尿病小鼠创面修复实验结果显示，经过Ti3C2Tx纳米颗粒光热治疗的实验组创面愈合率更高，创面长度明显缩短，胶原沉积和皮肤附属器的生成也最为丰富。特别是在修复增殖期的第7天，通过免疫组化染色分析发现，Ti3C2Tx光照组中CD206抗炎因子表达水平最高，表明Ti3C2Tx的应用可能有助于减少炎症期创面巨噬细胞的浸润，从而顺利促进炎症期向增殖期的过渡，加速创面的愈合过程。由于糖尿病患者长期的高血糖水平微血管受到损害，无法提供足够的营养和氧气，导致创面修复所需的细胞生长和迁移受阻，因此，血管生成对于糖尿病患者的创面修复具有不可忽视的重要性[36]。糖尿病小鼠创面修复实验结果显示，Ti3C2Tx可以显著促进CD31的表达，这也有利于促进糖尿病小鼠的创面修复。
综上所述，Ti3C2Tx借助独特的光热效应能够高效地展现抗氧化、抗炎和抗菌特性，可促进糖尿病小鼠创面的愈合。该研究有助于推动Ti3C2Tx在糖尿病创面治疗中的应用，使其成为理想的糖尿病伤口修复材料。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

MXene纳米颗粒Ti3C2TX与光热效应促进糖尿病小鼠创面愈合

MXene nanoparticles Ti3C2Tx and photothermal effect promote wound healing in diabetic mice

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