经颅磁声电刺激对老年小鼠电压门控钠钾离子通道的影响

doi:10.12307/2023.426

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (26): 4200-4207.doi: 10.12307/2023.426

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经颅磁声电刺激对老年小鼠电压门控钠钾离子通道的影响

张帅1，2，王艺潇1，2，武健康1，2，芈金睿1，2，李子春1，2，徐桂芝1，2

1省部共建电工装备可靠性与智能化国家重点实验室，2河北省生物电磁与神经工程重点实验室(筹)，生命科学与健康工程学院，河北工业大学，天津市 300130

收稿日期:2022-03-29 接受日期:2022-06-29 出版日期:2023-09-18 发布日期:2023-01-28
通讯作者: 张帅，博士，教授，省部共建电工装备可靠性与智能化国家重点实验室，河北省生物电磁与神经工程重点实验室(筹)，生命科学与健康工程学院，河北工业大学，天津市 300130
作者简介:张帅，男，1978年生，河北省保定市人，汉族，博士，教授，主要从事生物电磁技术方向的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(51877069)，项目负责人：张帅

Effects of transcranial magneto-acousto-electrical stimulation on voltage-gated sodium and potassium channels in aged mice

Zhang Shuai1, 2, Wang Yixiao1, 2, Wu Jiankang1, 2, Mi Jinrui1, 2, Li Zichun1, 2, Xu Guizhi1, 2

1State Key Laboratory of Reliability and Intelligence of Electrical Equipment, School of Life Sciences and Health Engineering, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China; 2Tianjin Key Laboratory of Bioelectromagnetic Technology and intelligent Health, School of Life Sciences and Health Engineering, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China

Received:2022-03-29 Accepted:2022-06-29 Online:2023-09-18 Published:2023-01-28
Contact: Zhang Shuai, State Key Laboratory of Reliability and Intelligence of Electrical Equipment, School of Life Sciences and Health Engineering, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China; Tianjin Key Laboratory of Bioelectromagnetic Technology and intelligent Health, School of Life Sciences and Health Engineering, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China
About author:Zhang Shuai, PhD, Professor, State Key Laboratory of Reliability and Intelligence of Electrical Equipment, School of Life Sciences and Health Engineering, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China; Tianjin Key Laboratory of Bioelectromagnetic Technology and intelligent Health, School of Life Sciences and Health Engineering, Hebei University of Technology, Tianjin 300130, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 51877069 (to ZS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

经颅磁声电刺激：是一种新型无创的脑刺激与神经调控技术。生物组织中存在以钾离子、钠离子为主的带电离子，经颅磁声电刺激技术利用静磁场与超声波的耦合效应，使带电离子在发生偏转进而产生感应电场，在耦合场的共同作用下最终达到神经系统电生理调节的目的。
电压门控离子通道：是一类受膜内外电压梯度控制的离子通道，按照特异性通过的离子类型可分为电压门控钠离子通道、电压门控钾离子通道、电压门控钙离子通道等，电压门控钠离子通道在动作电位的上升支担任重要角色，电压门控钾离子通道在动作电位的形成过程中发挥关键作用，电压门控钙离子通道在细胞去极化和复极化过程中具有调节功能。

背景：经颅磁声电刺激是一种新型无创的神经调控技术，利用超声波与静磁场耦合作用产生的感应电场调节神经系统的放电活动，但其作用机制目前尚不清楚。
目的：探讨经颅磁声电刺激调节老年小鼠神经兴奋性变化的内在介导机制。
方法：取20只老年(15月龄)昆明小鼠，采用随机数字表法分为老年对照组(接受伪刺激)、磁场组(仅接受0.3 T的静磁场刺激)、超声组(仅接受2.6 W/cm2的超声刺激)和磁声组(接受0.3 T静磁场、2.6 W/cm2超声的耦合刺激)，每组5只，刺激2 min/d，连续刺激14 d；另将5只青年(2月龄)昆明小鼠作为青年组(接受伪刺激)。刺激结束后，采用膜片钳技术分别记录小鼠脑切片中细胞激活、失活和复活过程中相关通道的离子电流。

结果与结论：①与老年对照组比较，磁声组小鼠电压门控钠通道电流峰值升高(P < 0.05)，通道电流的激活曲线向左移动，失活曲线向右移动，恢复活性时间缩短(P < 0.05)，与青年组仍有差距(P < 0.05)；磁声组小鼠电压门控钾通道电流峰值降低(P < 0.05)，瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流的激活曲线均向右移动，瞬时外向钾电流的失活曲线向左移动，瞬时外向钾电流的恢复活性时间延长(P < 0.05)，与青年组仍有差距(P < 0.05)；②结果表明，经颅磁声电刺激可以通过相关离子通道动力学特性的改变，产生激活钠离子电流并抑制钾离子电流的效果，进而提高老年小鼠的神经兴奋性，但尚不能达到青年小鼠的水平，这种神经调控技术有望为延缓衰老提供潜在的可能性。

https://orcid.org/0000-0003-4480-533X(张帅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 经颅磁声电刺激, 老年小鼠, 神经兴奋性, 电压门控型钠通道, 电压门控型钾通道

Abstract: BACKGROUND: Transcranial magneto-acousto-electrical stimulation (TMAES) is a new non-invasive neuromodulation technique, which uses the induced field generated by the coupling of ultrasound and static magnetic fields to regulate the firing activity of the nervous system, but the mechanism of its neuromodulatory effect is not yet clear.
OBJECTIVE: To explore the intrinsic mediating mechanism of TMAES regulating the changes of neural excitability in aged mice.
METHODS: Twenty aged mice were equally and randomly divided into aged control group (receiving pseudo-stimulation), magnetic field group (receiving 0.3 T static magnetic field stimulation), ultrasound group (receiving 2.6 W/cm2 ultrasound stimulation), and magneto-acoustical group (receiving 0.3 T and 2.6 W/cm2 coupling stimulation), with five mice in each group. Simulation in each group was done 2 minutes per day for 14 continuous days. Another five young mice (2 months of age) served as the young group (receiving pseudo-stimulation). Then, patch-clamp technique was used to record the ionic currents of relevant channels during cell activation, inactivation, and reactivation in brain slices of mice.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the aged control group, TMAES significantly increased the current peak value of sodium channels (P < 0.05), shifted the activation curve of voltage-gated sodium channel currents to the left, shifted the inactivation curve to the right, and shortened the reactivation time (P < 0.05). However, there was a significant difference between magneto-acoustical and young groups (P < 0.05). Compared with the aged control group, TMAES suppressed the current peaks of potassium channels, shifted the activation curves of both transient outward potassium currents and delayed rectifier potassium currents to the right, shifted the inactivation curves of transient outward potassium currents to the left, and extended the reactivation time of transient outward potassium currents. However, there was still a significant difference between magneto-acoustical and young groups (P < 0.05). All these findings indicate that TMAES can activate sodium currents and inhibit potassium currents through altering the dynamic characteristics of relevant ion channels, thereby improving the neural excitability of aged mice, but not up to the level of young mice. This neuromodulation technique is expected to provide potential possibilities for delaying aging.

Key words: transcranial magneto-acousto-electrical stimulation, aged mice, neural excitability, voltage-gated sodium channel, voltage-gated potassium channel

中图分类号:

张帅, 王艺潇, 武健康, 芈金睿, 李子春, 徐桂芝. 经颅磁声电刺激对老年小鼠电压门控钠钾离子通道的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4200-4207.

Zhang Shuai, Wang Yixiao, Wu Jiankang, Mi Jinrui, Li Zichun, Xu Guizhi. Effects of transcranial magneto-acousto-electrical stimulation on voltage-gated sodium and potassium channels in aged mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(26): 4200-4207.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析 25只小鼠全部进入结果分析。
2.2 经颅磁声电刺激对电压门控钠通道的影响 INa刺激参数Ⅰ-Ⅴ变化相关结果如图1A所示。以-70 mV电压钳制细胞并给予-80 mV至+70 mV的阶梯去极化脉冲刺激(脉冲步阶为10 mV、波宽为20 ms)，记录并观察电流的变化。对同一膜电位下的电流幅值的分析表明，磁场组、超声组、磁声组、老年对照组的INa幅值显著低于青年组，磁场组、超声组和磁声组的INa幅值较老年对照组显著提高。磁声组对INa幅值的激活程度优于超声组，同时磁声组使INa最大峰值对应的电压从-30 mV变为-20 mV，在一定程度上使其电压依赖性发生改变。结果显示经颅磁声电刺激对老年个体细胞的INa产生了积极作用，但尚不能恢复至青年个体的水平。
INa的激活过程相关结果如图1B所示。以-70 mV电压钳制细胞，先施加波宽60 ms、幅值-120 mV的条件脉冲，随后给予细胞-90 mV至+10 mV的阶梯去极化测试脉冲刺激(步阶为10 mV、波宽为20 ms)，记录得到INa的稳态激活过程并绘制拟合曲线。相较于老年对照组，青年组、磁场组、超声组和磁声组的激活曲线均向左移动，磁声组的左移程度高于磁场组和超声组，但移动程度均不及青年组。 INa激活曲线的详细参数见表1，老年刺激组的半数激活电压高于青年组，超声组和磁声组显著低于老年对照组，5组斜率因子k无显著差异。结果表明，经颅磁声电刺激在一定程度上降低了INa的激活阈值，使其更易激活。

INa的失活过程相关结果如图1C所示。以-70 mV电压钳制细胞，先给予-100 mV至+10 mV的阶梯去极化条件脉冲(步阶为10 mV、波宽为100 ms)，随后施加-30 mV、波宽20 ms的测试脉冲，记录得到INa的稳态失活过程并绘制拟合曲线。相较于老年对照组，磁场组、超声组、磁声组和青年组的失活曲线均向右移动，磁声组的右移程度高于磁场组和超声组，但与青年组仍有一定差距。INa失活曲线详细参数见表2，磁场组、超声组、磁声组的半数失活电压低于青年组，超声组和磁声组的半数失活电压显著高于老年对照组。斜率因子k也随之发生改变，磁声组斜率因子k与老年对照组相比显著提高，统计结果表明经颅磁声电刺激可以延长INa开放时间。

INa的失活后再恢复活性(复活)过程相关结果如图1D所示。以-70 mV电压钳制细胞，给予幅值为-30 mV、波宽为25 ms的2个相同的条件脉冲和测试脉冲。条件脉冲和测试脉冲2个刺激间隔保持-70 mV，间隔时程为2-26 ms，以2 ms为单位递增，记录得到INa的稳态失活过程并绘制拟合曲线。相较于老年对照组，磁场组、超声组、磁声组和青年组的复活曲线均向左移动，但移动程度不及青年组。INa恢复曲线详细参数见表3，对时间常数τ的统计学分析表明，磁场组、超声组、磁声组恢复活性过程均慢于青年组，磁声组显著低于老年对照组，说明经颅磁声电刺激使INa恢复活性时间缩短。

2.3 经颅磁声电刺激对瞬时外向钾通道的影响 IA刺激参数Ⅰ-Ⅴ变化相关结果如图2A所示。以-100 mV电压钳制细胞，给予-50 mV至+90 mV的阶梯去极化脉冲刺激(步阶为10 mV、波宽为200 ms)，记录并观察电流的变化。对同一膜电位下电流幅值的分析表明，相较于青年组，磁场组、超声组、磁声组和老年对照组IA幅值显著升高，磁场组、超声组、磁声组IA幅值较老年对照组显著降低。相较于其他刺激组，磁声组中IA峰电流的抑制程度最显著。随着膜电位的去极化程度增强，膜上K+通透性也随之降低。结果显示，经颅磁声电刺激降低了老年个体的IA幅值，但不能恢复至青年个体的水平。
IA的激活过程相关结果如图2B所示。以-100 mV电压钳制细胞，先施加幅值-110 mV波宽400 ms的条件脉冲，随后给予细胞-50 mV至+90 mV的阶梯去极化测试脉冲刺激(步阶为10 mV、波宽为150 ms)，记录得到IA的稳态激活过程并绘制拟合曲线。相较于老年对照组，磁场组、超声组、磁声组和青年组的激活曲线均明显向右移动，且磁声组右移程度最接近青年组，即刺激使Kv通道的激活过程发生在膜电位更高处。IA激活曲线详细参数见表4，磁场组、超声组、磁声组的半数激活电压均低于青年组，且磁声组与青年组间有显著差异，磁声组、超声组显著性高于老年对照组。对斜率因子而言，磁声组与老年对照组存在显著差异，因此，经颅磁声电刺激使IA激活过程中的阈值电压升高进而不易被激活。

IA的失活过程相关结果如图2C所示。以-100 mV电压钳制细胞，先给予-110 mV至+10 mV的阶梯去极化条件脉冲(步阶为10 mV、波宽为80 ms)，随后施加幅值+50 mV波宽80 ms的测试脉冲，记录得到IA的稳态失活过程并绘制拟合曲线。相较于老年对照组，青年组、磁场组、超声组、磁声组的失活曲线均明显向负压方向移动，其中磁声组的左移程度显著高于磁场组和超声组，但磁场组、超声组、磁声组均不及青年组水平。IA失活曲线详细参数见表5，磁场组、超声组、磁声组的半数失活电压均高于青年组，且磁声组与青年组比较具有显著差异，磁声组和超声组的统计结果显著低于老年对照组。磁场组、超声组、磁声组的斜率因子相比老年对照组呈增大趋势，整个通道开放过程明显加快，因此经颅磁声电刺激使IA更易失活。

IA的复活过程相关结果如图2D所示。以-100 mV钳制细胞，给予细胞+50 mV波宽80 ms的两个相同的条件脉冲与测试脉冲。条件脉冲与测试脉冲2个刺激间隔保持在-100 mV，间隔时程1-256 ms，记录得到IA的稳态复活过程并绘制拟合曲线。相较于老年对照组，青年组与磁场组、超声组、磁声组的复活曲线均明显右移，但磁场组、超声组、磁声组的移动程度未达青年组水平。IA复活曲线详细参数见表3，磁声组复活所需时间显著低于青年组，磁声组和超声组显著高于老年对照组，表明经颅磁声电刺激作用后使IA失活后再次打开需要更长的时间。

2.4 经颅磁声电刺激对延迟整流钾通道的影响 IK刺激参数Ⅰ-Ⅴ变化相关结果如图3A所示。以-50 mV钳制细胞，给予细胞-50 mV至+90 mV的阶梯去极化脉冲刺激(步阶为10 mV、波宽300 ms)，记录并观察电流的变化。对同一膜电位下电流幅值的分析表明，相较于老年对照组，磁场组、超声组、磁声组以电压依赖的方式抑制了IK幅值，其中磁声组抑制IK峰电流的效果最显著。对比图1A可以看出，激发出IK电流峰值的膜电位高于IA。从统计学角度分析得出，在不同刺激模式下，产生显著性差异的IK膜电位最小值(+30 mV)低于相应的IA膜电位最小值(+40 mV)，造成该现象的原因可能是瞬时外向钾通道的开放时间早于延迟整流钾通道。整体结果表明，经颅磁声电刺激可以降低老年个体细胞的IK峰值，但在该种参数下尚不能恢复至青年个体水平。
IK的激活过程变化相关结果如图3B所示。以-50 mV电位钳制细胞，先施加-110 mV波宽400 ms的条件脉冲，随后给予细胞-50 mV至+90 mV的阶梯去极化测试脉冲刺激(步阶为10 mV、波宽为150 ms)，记录得到IK的稳态激活过程并绘制拟合曲线。相较于老年对照组，磁场组、超声组、磁声组和青年组的激活曲线均向右移动，在一定程度上加速了复极化过程。IK激活曲线详细参数见表6，磁场组、超声组、磁声组的半数激活电压低于青年组，磁声组和超声组显著性低于青年组，磁声组和超声组显著高于老年对照组。各组间斜率因子无显著差异，但超声组和磁声组的斜率因子较接近青年组。综合分析结果可表明，经颅磁声电刺激通过增大激活阈值电压使IK通道不易被激活。

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引言

联合国人口基金会的数据表明，全世界有9%的人年龄超过65岁[1]，脑老化是判别老龄化最重要的生理依据，在老化过程中伴随阿尔茨海默病、帕金森病等一系列神经退行性疾病的发生[2]。海马区是老年群体中最容易受到影响的区域[3]，通常表现为海马区神经元兴奋性降低[4]。脑部在发育过程中保持着神经可塑性，认知干预、运动干预等非药物干预手段可改善脑老化程度[5]。神经调控技术作为开展神经科学研究的基本手段，在“健康中国2030”的战略背景下越来越受到关注。
经颅磁声电刺激作为一种新型无创的神经调控技术，利用静磁场与超声波的耦合效应在神经组织中产生感应电流，进而调节相应脑区的神经电生理活动[6]。NORTON提出在静磁场下施加超声产生感应电流，可达到刺激皮质组织的效果[7]。YUAN等[8-10]基于霍奇金-赫胥黎模型、欣德马什-罗斯模型，分别讨论经颅磁声电刺激中不同刺激参数对神经元同步化、放电节律以及频率适应性的影响。刘世坤等[11-14]通过开展动物实验得出结论，经颅磁声电刺激具备高分辨率和安全可靠的特性，同时能有效提高突触可塑性和学习记忆能力。张帅等[6，15]从多角度证明了经颅磁声电刺激调节神经放电活动的有效性，通过仿真模型发现经颅磁声电刺激采用低频率的超声能显著提高神经集群的兴奋性，通过开展动物实验发现该技术可促进神经集群中的信息传递并增强脑功能的连接特性[16-17]。以往的研究证明了经颅磁声电刺激是一种安全有效的神经调控技术，但其对老年个体的作用效果及规律尚待开展研究。
膜片钳技术常用于开展离子通道的相关研究[18]，急性分离脑片中的细胞最为接近生理状态，将二者结合开展研究已成为神经工程领域中的热点[19]。钠钾离子通道参与触发神经冲动、调节突触可塑性等过程[20]，是神经电活动的基础，其中电压门控钠通道是产生动作电位和传导电流的重要因素[21]，在动作电位的上升支发挥作用。电压门控钾通道(voltage-gated sodium channels，Kv)主要对动作电位的复极化过程产生影响[22]，根据生理特性方面的差异，可将电压门控钾通道电流分为瞬时外向钾通道电流(transient outward potassium current，IA)和延迟整流钾通道电流(delayed rectifier potassium current，IK)。IA在动作电位的产生及细胞放电频率等方面具有显著的作用，IK的幅值与动作电位幅度和频率密切相关[23]。离子通道的功能障碍会引发一系列疾病[24]，且其相关动力学特性受外界因素影响，因此离子通道的作用机制有待进一步阐明。
啮齿类动物已被广泛应用于老化相关的实验研究领域[25]。此次实验以不同年龄的昆明小鼠为研究对象，采用全细胞膜片钳技术分别记录了海马CA1区锥体细胞的电压门控钠通道电流(voltage-gated sodium current，INa)、IA和IK，通过比较静磁场刺激、超声刺激和磁声电刺激下通道电流峰值与电压的关系以及通道动力学特性的变化，探究经颅磁声电刺激调节神经兴奋性的内在介导机制，有望为延缓衰老提供潜在的可能性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计不同刺激模式下的急性离体脑片细胞膜片钳实
验，多组间比较采用One-Way ANOVA分析，两两比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年4月至2021年11月在河北工业大学电生理实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 20只老年昆明小鼠(15月龄)[26]、5只青年昆明小鼠(2月龄)，SPF级，雄性，购自北京华阜康生物科技有限公司，动物许可证号SCXK(京)2020-0004。实验用鼠均单笼饲养于适宜温度(25±1) ℃和湿度(30%-40%)的屏障环境中，12 h光照与黑暗交替循环，期间保证小鼠的食物来源。实验将5只青年昆明小鼠作为青年组；将20只老年昆明小鼠采用随机数字表法分为老年对照组、磁场组、超声组和磁声组，每组5只。动物实验经河北工业大学生物医学伦理委员会批准(批准号：HEBUTaCUC2020014)。
1.3.2 实验仪器切片机(VT1200S，Leica)；呼吸麻醉机(R580S，RWD)；射频功率放大器(Model 150A100C，AR)；单臂脑立体定位仪(KOPF，上海任谊生物科技有限公司)；准直器(自制锥形树脂胶模具)；示波器(TDS3014，Tektronix)；高斯计(475 DSP，Lake Shore)；永磁体(自制钕铁硼)；渗透压测定仪(SMC 30C-1，天津天河分析仪器有限公司)；红外显微镜(U-TV1X-2，Olympus)；微电极拉制仪(MP285，Sutter Instruments)；医用超声耦合剂(TM-100，天津市西苑寺制作所)；超声换能器(P20FG，汕头超声电子有限公司)；任意波形发生器(33500B Series，KEYSIGHT)；膜片钳信号放大器(EPC 10，HEKA)。
1.4 实验方法
1.4.1 刺激实施过程将小鼠放在通有4%异氟烷的箱体中进行气麻，然后将其固定于脑立体定位仪上，剃除头皮毛发以减少超声波在传递过程中的衰减，并根据脑图谱将超声换能器和准直器聚焦于小鼠海马区(ML：1.5 mm；AP：2 mm；DV：2 mm)。
改用0.5%浓度的异氟烷通过呼吸面罩维持小鼠的浅麻醉状态。实验方案参考先前的实验研究[16]，预先在小鼠头部两侧固定永磁体以提供水平方向为0.3 T的静磁场；利用任意波形发生器和射频功率发放大器将超声参数设置为[27-29]：基波频率0.5 MHz，脉冲重复频率1 kHz，脉冲长度0.5 ms，脉冲持续时间400 ms，计算所得超声在小鼠颅内产生的平均脉冲时间强度为2.6 W/cm2。磁场组仅接受0.3 T的磁刺激，超声组仅接受2.6 W/cm2的超声刺激，磁声组小鼠同时接受0.3 T磁、2.6W/cm2超声的耦合刺激，青年组和老年对照组在相同环境下去除磁场和超声。刺激2 min/d，刺激实验持续14 d。
1.4.2 膜片钳实验溶液配制[30]
切片液的成分：CaCl2 1 mmol/L、MgCl2 6 mmol/L、NaHCO3 26 mmol/L、KCl 2.5mmol/L、葡萄糖11 mmol/L、蔗糖220 mmol/L、NaH2PO2 1.625 mmol/L，用NaOH调节pH值至7.4，渗透压调整为300-305 mOsm。
人工脑脊液的成分：NaCl 124 mmol/L、CaCl2 2 mmol/L、MgCl2 2 mmol/L、KCl 3 mmol/L、NaHCO3 26 mmol/L、葡萄糖11 mmol/L、NaH2PO4 1.625 mmol/L、HEPES 5 mmol/L，用NaOH将pH值调至7.4，渗透压调整为310-320 mOsm，室温30 ℃下持续通入体积分数95%O2和体积分数5%CO2的混合气体使之饱和。
INa记录外液成分： KCl 3 mmol/L、NaCl 130 mmol/L、MgCl2 2 mmol/L、CaCl2 2 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、TEA-Cl 25 mmol/L、4-AP 3 mmol/L、CdCl2 0.2 mmol/L，用KOH调节pH值至7.4。
INa记录电极内液成分： CsCl 140 mmol/L、Mg-ATP 2 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、MgCl2 2 mmol/L、HEPES 10mmol/L，用CsOH调节pH值至7.2。
IA与IK记录细胞外液成分：KCl 5 mmol/L、CdCl2 0.2 mmol/L、CaCl2 2 mmol/L、MgCl2 1 mmol/L、NaCl 130 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、TTX 0.001 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L。记录IA时加入终浓度为25 mmol/L的TEA-Cl，记录IK时加入终浓度为3 mmol/L的4-AP，用NaOH调节pH值至7.4。
IA与IK记录电极内液成分：MgCl2 2 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、KCl 140 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Mg-ATP 2 mmol/L，用KOH调节pH值至7.2。
1.4.3 急性分离脑片的制备在刺激实验结束后的第2天，将小鼠麻醉后快速断头取脑(操作时间控制在1 min以内)。鼠脑完全浸入持续通氧的切片液，在冰水混合的溶液中恢复一二分钟，切片机切取五六片海马区脑组织(厚度300 μm)，室温下(30 ℃)在氧饱和的人工脑脊液中孵育45 min。
1.4.4 全细胞脑片膜片钳将孵育完成的脑片转移至膜片钳平台上的脑片记录槽内，经PatchMaster软件检测并采集信号。在低倍镜下找到目标海马CA1区，切换到高倍水镜下找到轮廓清晰、层数较浅的锥体细胞，安装预先灌装电极内液的玻璃微电极，依次在倒置显微镜下进行高阻封接、补偿电容、破膜等操作，最后进行全细胞膜片钳记录。
1.5 主要观察指标各组小鼠细胞膜电位、电流峰值的改变，不同刺激模式下INa和IA的激活、失活和复活动力学特性参数，以及IK的激活动力学特性参数。
1.6 统计学分析实验数据处理后，采用origin软件(OriginLab，美国)绘图，采用SPSS 26.0软件(IBM，美国)进行统计学分析，多组间采用One-Way ANOVA分析方法，青年组与磁声组之间比较采用t检验分析方法。统计结果以x±s的方式呈现，检验水准为0.05。统计学方法已经河北工业大学生物统计学专家审核。

讨论

实验通过比较老年小鼠与青年小鼠间通道动力学方面的差异，提示了经颅磁声电刺激对老年小鼠神经兴奋性的调控效果可能优于静磁场刺激和超声刺激。实验结果显示，海马CA1区锥体细胞相关电特性在老年小鼠和青年小鼠中显现出明显的不同，在同一膜电位下，老年小鼠INa的幅值显著低于青年小鼠，且IA和IK的幅值显著高于青年小鼠，在施加刺激后INa的幅值升高、IA和IK的幅值降低，两种通道的电流幅值变化均趋向于缩小老年小鼠与青年小鼠间的差距，这可能意味着经颅磁声电刺激对电压门控钠、钾通道的开闭特性产生了影响。在对INa的分析中，经颅磁声电刺激以电压依赖的方式显著提升了电流幅值，半数激活电压呈下降趋势，激活曲线向膜电位极化方向移动，半数失活电压呈上升趋势，失活曲线向膜电位去极化方向移动，故经颅磁声电刺激可以延长整个激活过程；而INa的复活曲线向左移动，时间常数显著性减小，即该技术可显著缩短钠通道恢复活性的时间。在对IA和IK的分析中，因IK通道具备延迟激活、缓慢失活甚至在短时间内不失活的属性，故仅考虑IK的激活过程。经颅磁声电刺激以电压依赖性的方式显著抑制了IA和IK的幅值，IA和IK的半数激活电压呈上升趋势，激活曲线均向正压方向移动从而更不易被激活，IA的半数失活电压呈下降趋势，失活曲线向膜电位极化方向移动；而IA的复活曲线明显右移，时间常数显著性增大，即该技术可显著延长钾通道恢复活性的时间。已有研究证实了钠通道的快速失活机制可防止神经细胞持续性放电[31]，因年龄增长而沉积的β淀粉样蛋白会抑制海马神经元中IA的失活[32]，在此基础上结合青年小鼠与老年小鼠动力学特性曲线的移动规律，经颅磁声电刺激在一定程度上恢复了由年龄增长引起的通道动力学特性改变，对改善老年小鼠生理状态具有一定的积极作用。
离子通道的激活和失活过程引起膜内外离子浓度差异，产生的电势差影响动作电位的发放。动作电位的发放受年龄因素影响，该特点遵循电压门控钠、钾通道的开放与关闭[33]。激活和失活过程拟合曲线斜率的大小与离子通道开放或关闭的速度呈正相关，即斜率大代表着速度快，斜率小代表着速度慢[34]。课题组先前研究基于动作电位这一神经兴奋性的基本特征，从发放频率、幅值、上升支时程等指标衡量了电压门控钾通道的动力学特性，进而分析了经颅磁声电刺激对神经兴奋性的影响[35]。目前对电压门控钠通道的研究主要集中于利用重复经颅磁刺激技术，动作电位上升支的最大斜率与膜电位的去极化程度呈正相关[33]，而且在去极化过程中钠离子通道的开闭速度越快，动作电位的达峰时间则越短[36]。与重复经颅磁刺激相比，经颅磁声电刺激在空间分辨率和穿透深度等方面具备更佳的神经调控效果[37]。上述关于电压门控钠、钾通道动力学特性的变化趋势与此次实验结果相似，因此推测经颅磁声电刺激提高神经兴奋性的机制可能为：经颅磁声电刺激促使Na+内流并激活了INa，阻碍K+外流并抑制了IA和IK，而Na+内流过程的促进增强了动作电位的兴奋性，K+外流过程的受阻提高了细胞内的电位水平，使得细胞的兴奋性维持在较高状态。
高频磁刺激可以通过影响离子的跨膜转运提高CA1区锥体神经元兴奋性[35]。此次实验磁场组中的部分动力学参数改变不显著，在统计学上可视为不影响相关特性，其原因可能是永磁体提供的静磁场强度较低。结合行为学测试与蛋白质免疫印迹分析的评估方法，超声刺激已被证实可以安全地对老年小鼠进行神经调控[31]，同时超声也被证明可以使细胞膜上的机械门控离子通道发生构象改变[38]，此次实验结果表明，超声刺激可能通过改变离子通道动力学特性进而提高神经兴奋性。这类研究的开展有利于深入探究经颅磁声电刺激改善细胞兴奋性水平的可行性与安全性。因脑片中所钳制的细胞个体差异性较大，存在细胞活性不同、细胞封接程度不一致等因素，不排除有刺激外的因素导致产生差异，后续实验可采用增加样本数量、重复实验次数等方法避免其他因素对实验结果产生影响。除此之外，将进一步优化实验方案，在刺激结束后的不同天数分别开展离子通道电流、免疫蛋白表达和细胞数量及形态等方面的检测，以探究经颅磁声电刺激是否可以持续影响离子通道的活性，并逐步确定最佳刺激参数以获得更好的调控效果。而电压门控钙离子通道在细胞去极化和复极化过程体现调节功能[39]，同时钙离子作为神经传导的重要信使[40]，其流动与神经元放电活动密切相关，故在今后有必要开展对电压门控钙通道的检测及基于钙稳态对神经兴奋性和突触效率的探究。
综上所述，经颅磁声电刺激通过激活INa并抑制IA与IK的方式改变了离子通道动力学特性，但对老年小鼠的调控效果与青年小鼠相比仍有一定差距；同时该技术通过调节动作电位传导的过程，在一定程度上减轻了老年小鼠神经兴奋性水平的退化程度，这种缓解作用可能是相关电压门控离子通道的相互作用导致的，由此推断经颅磁声电刺激有望为延缓衰老提供潜在的可能性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

经颅磁声电刺激对老年小鼠电压门控钠钾离子通道的影响

Effects of transcranial magneto-acousto-electrical stimulation on voltage-gated sodium and potassium channels in aged mice

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