小肠黏膜下层与滑膜间充质干细胞的组织相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.47.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (47): 8202-8208.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.47.010

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

小肠黏膜下层与滑膜间充质干细胞的组织相容性

符培亮，张雷，吴宇黎，吴海山，丛锐军，陈松，丁喆如，周琦

上海市长征医院关节外科，上海市 200003

修回日期:2013-08-28 出版日期:2013-11-19 发布日期:2013-11-19
通讯作者: 吴宇黎，副主任医师，上海市长征医院关节外科，上海市 200003 wuyuli6019@189.cn
作者简介:符培亮☆，男，1980年生，浙江省余姚市人，汉族，2009年解放军第二军医大学毕业，博士，主治医师，主要从事关节软骨修复研究。 fupeiliang@163.com 并列第一作者：张雷☆，男，1987年生，安徽省芜湖市人，汉族，解放军第二军医大学在读博士，讲师，主要从事关节软骨修复研究。 ra_eagle@hotmail.com
基金资助:
实验受“国家自然科学基金青年科学基金项目”资助，兔自体SMSCs修复重建半月板损伤的机制研究项目(81000798)*

Histocompatibility between small intestinal submucosa and synovial mesenchymal stem cells

Fu Pei-liang, Zhang Lei, Wu Yu-li, Wu Hai-shan, Cong Rui-jun, Chen Song, Ding Zhe-ru, Zhou Qi

Department of Joint Surgery, Changzheng Hospital of Shanghai, Shanghai 200003, China

Revised:2013-08-28 Online:2013-11-19 Published:2013-11-19
Contact: Wu Yu-li, Associate chief physician, Department of Joint Surgery, Changzheng Hospital of Shanghai, Shanghai 200003, China wuyuli6019@189.cn
About author:Fu Pei-liang☆, M.D., Attending physician, Department of Joint Surgery, Changzheng Hospital of Shanghai, Shanghai 200003, China fupeiliang@163.com Zhang Lei☆, Studying for doctorate, Lecturer, Department of Joint Surgery, Changzheng Hospital of Shanghai, Shanghai 200003, China ra_eagle@hotmail.com Fu Pei-liang and Zhang Lei contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 81000798*

摘要/Abstract

摘要：

背景：小肠黏膜下层有抗微生物活性、良好的生物相容性及生物力学性能，能在体内快速降解，与半月板纤维软骨细胞的胞外基质相近。
目的：观察小肠黏膜下层与滑膜间充质干细胞是否有良好的组织相容性。
方法：先后采用物理方法与化学方法处理猪小肠黏膜下层，并进行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察。制备小肠黏膜下层浸提液，行以下实验：①热源实验：在新西兰大白兔耳缘静脉注射小肠黏膜下层浸提液。②皮肤致敏实验：在新西兰大白兔背部皮内分别注射小肠黏膜下层浸提液、多聚甲醛溶液及生理盐水。③全身毒性实验：在新西兰大白兔耳缘静脉分别注射小肠黏膜下层浸提液与生理盐水。将小肠黏膜下层与成骨诱导的兔滑膜间充质干细胞共培养，以小肠黏膜下层单独培养为对照。
结果与结论：经物理处理过的小肠黏膜下层表面仍然存在小肠黏膜上皮细胞、脂肪细胞和一些其他细胞黏附；经化学方法处理后其残留的细胞数量明显减少，但主要结构和成分未被改变。小肠黏膜下层黏膜面较肌层面光滑，无细胞残留，表面纤维组织交错形成疏松的三维网状立体结构，孔隙率为80%。小肠黏膜下层是一种无毒、无刺激、无免疫原性，生物相容性很好的生物材料，与兔滑膜间充质干细胞具有良好的组织相容性。

关键词: 生物材料, 细胞外基质材料, 小肠黏膜下层, 滑膜间充质干细胞, 半月板, 组织工程, 组织相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Small intestinal submucosa is characterized as antimicrobial activity, good biocompatibility, bio-mechanical properties, and rapid degradation in vivo, similar to the extracellular matrix of meniscal fibrochondrocytes.
OBJECTIVE: To observe whether there exists a good histocompatibility between small intestinal submucosa and synovial mesenchymal stem cells.
METHODS: Small intestinal submucosa was treated with physical and chemical treatment. And hematoxylin-eosin staining and scanning electron microscopy observation were performed. Then, small intestinal submucosa extracts were prepared for the following experiments. (1) Pyrogenic test: small intestinal submucosa extracts were injected into the ear vein of New Zealand white rabbits. (2) Skin sensitization test: small intestinal submucosa extracts, paraformaldehyde solution and normal saline were respectively injected intradermally into New Zealand white rabbits. (3) General toxicity test: small intestinal submucosa extracts and normal saline were respectively injected into the ear vein of New Zealand white rabbits. Small intestinal submucosa was co-cultured with osteogenic rabbit synovial mesenchymal stem cells, and small intestinal submucosa cultured alone served as control.
RESULTS AND CONCLUSION: There were some intestinal mucosal epithelial cells, fat cells and other cells adhered onto the surface of small intestinal submucosa after physical treatment. While, the amount of residual cells decreased sharply after chemical treatment. But the main structure and the component had not been changed. The surface of small intestinal submucosa was smooth and no cells remained, and there was a three-dimension network spatial structure. The porosity was 80%. Small intestinal submucosa is a non-toxic, nonirritating, non-immunogenic biomaterial with very good biocompatibility, which has a good histocompatibility with rabbit synovial mesenchymal stem cells.

Key words: biocompatible materials, histocompatibility, bone matrix, extracellular matrix

中图分类号:

R318

符培亮，张雷，吴宇黎，吴海山，丛锐军，陈松，丁喆如，周琦. 小肠黏膜下层与滑膜间充质干细胞的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(47): 8202-8208.

Fu Pei-liang, Zhang Lei, Wu Yu-li, Wu Hai-shan, Cong Rui-jun, Chen Song, Ding Zhe-ru, Zhou Qi. Histocompatibility between small intestinal submucosa and synovial mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(47): 8202-8208.

图/表（结果） 6

2.1 小肠黏膜下层的制备及检测 大体观察：经物理方法处理后的小肠黏膜下层呈一层浅乳白色的半透明基膜，表面仍残留有脂肪组织；膜的两面表面特征不同，内层面即黏膜面较为光滑，外层面即肌层面较为粗糙，见图1。

光镜下观察：经物理方法处理过的小肠黏膜下层表面光滑，光学显微镜下细胞计数平均为(30.0±6.1)个/100倍视野，化学方法处理后细胞含量明显下降，平均为(3.0±1.1)个/100倍视野，两者比较差异有显著性意义(P=0.004)。苏木精-伊红染色光镜下观察细胞外基质中有大量胶原纤维，其主要结构和成分没有被破坏，见图2。

以上结果说明经物理方法处理后，小肠黏膜下层表面仍然存在小肠黏膜上皮细胞、脂肪细胞和一些其他细胞黏附。而经化学方法处理后并不会破坏小肠黏膜下层的结构和成分，但其残留的细胞数量大为减少，免疫原性基本得以消除。扫描电镜下观察：小肠黏膜下层黏膜面较肌层面光滑，无细胞残留，表面纤维组织交错形成疏松的三维网状立体结构，粗略估计其孔隙率为80%，见图3。

2.2 小肠黏膜下层的生物安全性评价

pH值测定：实验组pH平均值为6.5±0.5，对照组pH值为6.6±0.4，两组间差异无显著性意义(P=0.382)。

热源实验：3只兔体温升高均在0.9 ℃以内，平均(0.6±0.2) ℃，小于1.4 ℃，符合生物材料热源实验的标准要求，说明小肠黏膜下层浸提液不含有热源物质，小肠黏膜下层植入体内后不会引起致热反应，结果见表1。

皮肤致敏实验：实验组和阴性对照组在观察期内局部皮肤无红斑、水肿。阳性对照组在24 h时可见红斑、水肿，48 h红斑水肿区扩大，局部皮肤坏死，72 h有焦痂形成。实验证明小肠黏膜下层植入皮内后不会引起致敏反应。
全身毒性实验：实验组和对照组兔在观察期内活动自如，无呼吸急促、呼吸抑制等症状。解剖时未发现腹腔内容物粘连。苏木精-伊红染色肝、肾组织切片无炎性细胞浸润及组织细胞坏死，见图4。

实验组：小肠黏膜下层加入滑膜间充质干细胞再经细胞因子诱导培养2周后的组织切片苏木精-伊红染色光镜观察显示，小肠黏膜下层结构内部具有较多的细胞黏附生长于其疏松多孔结构间，培养细胞的活性在小肠黏膜下层结构内部保持良好，见图5A；扫描电镜可以更进一步清晰地观察到培养细胞黏附生长于小肠黏膜下层多孔结构内部疏松的多孔结构间，并且细胞的生长活性保持良好，细胞间通过突起相互连接或伸出伪足贴附于支架孔壁上，见图6A。
对照组：小肠黏膜下层单独培养2周后的组织切片检查显示，小肠黏膜下层结构内部具有疏松的多孔结构，并且能够在组织培养2周的情况下保持这种多孔结构，见图5B；扫描电镜检查可以清晰地看到胶原纤维束样结构纵横交错，形成疏松三维网状结构，束与束之间存在大量微孔结构，见图6B。

参考文献

[1] 吴海山,徐青镭.膝半月板外科与组织工程学重建[M].上海: 第二军医大学出版社, 1999.
[2] Allman AJ,McPherson TB,Badylak SF,et al.Xenogeneic extracellular matrix grafts elicit a TH2-restricted immune response. Transplantation.2001; 71(11): 1631-1640.
[3] Sarikaya A,Record R,Wu CC,et al.Antimicrobial activity associated with extracellular matrices. Tissue Eng.2002;8(1): 63-71.
[4] Grimes M, Pembroke JT, McGloughlin T. The effect of choice of sterilisation method on the biocompatibility and biodegradability of SIS (small intestinal submucosa). Biomed Mater Eng.2005;15(1-2): 65-71.
[5] Roeder R,Wolfe J,Lianakis N,et al.Compliance, elastic modulus, and burst pressure of small-intestine submucosa (SIS) small-diameter vascular grafts. Boimed Mater Res. 1999;47: 65-70.
[6] Cook JL,Fox DB,Malaviya P,et al.Evaluation of small intestinal submucosa grafts for meniscal regeneration in a clinically relevant posterior meniscectomy model in dogs.J Knee Surg. 2006;19(3):159-167.
[7] 祝云利,荆鑫,缪志和,等.纤维软骨细胞－胶原复合物修复半月板损伤的实验研究[J].解放军医学杂志,2002,27(1): 20-21.
[8] 徐青镭,万年宇,吴海山,等.兔骨髓干细胞向软骨细胞分化用于半月板组织工程重建[J].中国临床康复,2003,7(6): 912-913.
[9] Kobayashi M,Chang YS,Oka M.A two year in vivo study of polyvinyl alcohol-hydrogel (PVA-H) artificial meniscus. Biomaterials.2005;26: 3243-3248.
[10] Bejjani GK,Zabramski J,Durasis Study Group.Safety and efficacy of the porcine small intestinal submucosa dural substitute: results of a prospective multicenter study and literature review. J Neurosurg.2007; 106(6): 1028-1033.
[11] Lawrence BJ,Maase EL,Lin HK,et al.Multilayer composite scaffolds with mechanical properties similar to small intestinal submucosa. J Biomed Mater Res A.2009;88(3): 634-643.
[12] Roeder RA,Lantz GC,Geddes LA.Mechanical remodeling of small-intestine submucosa small-diameter vascular grafts-a preliminary report. Biomed Instrum Technol.2001;35(2): 110-120.
[13] Hadlock TA,Sundback CA,Huntar DA,et al.A new artificial nerve graft containing rolled Schwann cell monolayers. Microsurgery.2001;21(3): 96-101.
[14] Keskin M,Kelly CP,Moreira-Gonzalez A,et al.Repairing critical-sized rat calvarial defects with a periosteal cell-seeded small intestinal submucosal layer. Plast Reconstr Surg.2008; 122(2): 400-409.
[15] Welch JA,Montgomery RD,Lenz SD,et al.Evaluation of small-intestinal submucosa implants for repair of meniscal defects in dogs. Am J Vet Res. 2002;63(3): 427-431.
[16] Prilbitkin EA,Ambro BT,Bloeden E,et al.Rabbit ear cartilage regeneration with a small intestinal submucosa graft. Laryngoscope.2004;114(9 Pt 2 Suppl 102):1-19.
[17] Murphy KD,Mushkudiani IA,Kao D,et al.Successful incorporation of tissue-engineered porcine small-intestinal submucosa as substitute flexor tendon graft is mediated by elevated TGF-beta1 expression in the rabbit. J Hand Surg Am.2008;33(7): 1168-1178.
[18] Derwin K,Androjna C,Spencer E,et al.Porcine small intestine submucosa as a flexor tendon graft. Clin Orthop Relat Res. 2004;423: 245-252.
[19] Musahl V,Abramowitch SD,Gilbert TW,et al.The use of porcine small intestinal submucosa to enhance the healing of the medial collateral ligament--a functional tissue engineering study in rabbits. J Orthop Res. 2004;22(1): 214-220.
[20] Dejardin LM,Arnoczky SP,Ewers BJ,et al.Tissue-engineered rotator cuff tendon using porcine small intestine submucosa: histologic and mechanical evaluation in dogs. Am J Sports Med.200l;29(2):175-184.
[21] Aiken SW,Badylak SF,Toombs JP,et al.Small intestinal submucosa as an intra-articular ligamentous graft material: A pilot study in dogs. Vet Comp Orthoped Traumatol.1994;7: 124-136.
[22] Nihsen ES,Johnson CE,Hiles MC,et a1.Bioactivity of small intestinal submucosa and oxidized regenerated cellulose/collagen. Adv Skin Wound Care. 2008;21(10): 479-486.
[23] Suckow MA,voytik-Harbin SL,Terril LA,et al.Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J Invest Surg. 1999;12: 277-287.
[24] Cook JL,Tomlinson JL,Arnoczky SP,et al.Kinetic study of the replacement of porcine small intestinal submucosa grafts and the regeneration of meniscal-like tissue in large avascular meniscal defects in dogs. Tissue Eng.2001;7(3): 321-334.
[25] Rosen M,Ponsky J,Petras R,et al.Small intestinal submucosa as a bioscaffold for biliary tract regeneration. Surgery.2002; 132(3): 480-486.
[26] Record RD,Hillegonds D,Simmons C,et al.In vivo degradation of 14C-labeled small intestinal submucosa(SIS) when used for urinary bladder repair. Biomaterials.2001;22(19): 2653-2659.
[27] Hodde JP,Record RD,Liang HA,et al.Vascular endothelial growth factor in porcine-derived extracellular matrix. Endothelium. 2001;8(1): 11-24.
[28] Voytik-Harbin SL,Brightman AO,Kraine MR,et al.Identification of extractable growth factors from small intestinal submucosa. J Cell Biochem. 1997;67(4): 478-491.
[29] Mcpherson TB,Stephen F.Characterization of fibronectin derived from porcine small intestinal submucosa. Tissue Eng. 1998;4(1): 75-83.
[30] Hodde J,Hiles M. Bioactive FGF-2 in sterilized extracellular matrix. Wounds. 2001;13(5): 195-201.
[31] Abraham GA,Murray J,Billiar K,et al.Evaluation of the porcine intestinal collagen layer as a biomaterial.J Biomed Mater Res. 2000;51(3): 442-452.

引言

组织工程修复半月板的基本思路，是将在体外增殖到一定数量级的种子细胞种植于有一定生物活性的支架材料上，经过三维立体培养形成细胞-支架复合物，植入体内，修复缺损半月板，经过一段时间后，支架材料逐渐被降解吸收，同时种子细胞不断增殖并分泌基质，最终形成新的半月板组织^[1]。

虽然在前期实验中成功完成了兔滑膜间充质干细胞向软骨细胞谱系的分化，但并没有获得纤维软骨细胞的终期表现型。由于进入软骨细胞分化谱系的滑膜间充质干细胞最终分化形成纤维软骨细胞受体内微环境、细胞因子及局部生物力学刺激等多种因素的影响，难以在体外培养条件下通过模拟体内环境的方法实现，因此作者设想将滑膜间充质干细胞在体外条件下经细胞因子诱导进入软骨细胞分化谱系后，选择合适的支架载体复合培养后，再将其转入体内，使之在体内生理环境下最终分化形成纤维软骨细胞，合成并分泌基质，形成半月板组织。

目前可供选择的支架材料主要包括天然生物材料和人工合成生物材料两大类。小肠黏膜下层是一种天然细胞外基质类生物衍生材料，由一层致密的结缔组织构成，没有血管，不含细胞，无免疫原性^[2]，而且还具有抗微生物活性^[3]，良好的生物相容性和生物力学性能^[4]，也能在体内快速降解，其主要含有胶原、氨基多搪及糖蛋白等成分，胶原约占其干质量的40%^[5-10]，与半月板纤维软骨细胞的胞外基质相近。

因此实验设计思路为首先制备猪小肠黏膜下层，然后检测其生物安全性，最后以小肠黏膜下层为支架材料，以经转化生长因子β3、骨形成蛋白2、地塞米松诱导进入软骨细胞分化谱系的滑膜间充质干细胞为种子细胞，观察细胞在支架上的生长、增殖情况，检测细胞和小肠黏膜下层的组织相容性，评价小肠黏膜下层作为功能细胞载体的可行性。

材料方法

设计：支架-细胞组织相容性实验。

时间及地点：于2012年3至8月在解放军第二军医大学组织胚胎学教研室实验室完成。

材料：

猪空肠：由上海大场生猪屠宰场厂提供。

实验动物：新西兰大白兔，购自中国科学院斯莱克实验动物中心，由解放军第二军医大学实验动物中心SPF级动物房饲养。

主要器材和设备：自动温控CO₂培养箱(Heraeus 5060/BB16)、超净台(苏州净化设备厂)、低速离心机(Thermo公司)、手术器械(长征医院手术室提供)、倒置相差显微镜及摄影装置(NikonTMS显微镜和HFX-DX显微摄影系统)、电子显微镜(Hitachi S-520)、超低温冰箱(Forma Scientific Inc.)、液氮罐(Forma Scientific Inc.)、超纯水制备系统(Labconco Water PRO^TMPS)、微量加样器(吉尔森公司)、病理切片机(LEICA公司)、一次性培养瓶、培养皿及培养板(Geriner或Corning公司)、10 mL/5 mL一次性吸管(Corning公司)、冻存管离心管：(Geriner或Corning公司)、程序降温盒(Nalgen公司)。

用于小肠黏膜下层制备及其安全性检测的主要试剂：叠氮化钠(NaN₃)、氢氧化钠(NaOH)、无水乙醇(C₂H₆O)、过氧乙酸(C₂H₄O₃)、乙二胺四乙酸(EDTA)、盐酸(HCl)，以上均来自日初生物科技有限公司。Mayer苏木精液：将苏木精1 g溶于1 000 mL热蒸馏水，再加入钾明矾 50 g。1%伊红溶液：将伊红1 g溶于1 000 mL蒸馏水。

用于滑膜间充质干细胞与小肠黏膜下层组织相容性实验的主要试剂：胎牛血清、DMEM完全培养基、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(1×PBS)，以上均购自Hyclone公司。细胞冻存液、0.25% 胰蛋白酶/0.02% EDTA，以上均来自GibcolBRL公司。

实验方法：

小肠黏膜下层的制备及检测：①物理方法处理^[7]：取 2 h内宰杀的新鲜猪空肠，反复用清水冲洗后置于冰袋中送至实验室。挑选管腔粗细均匀、管壁无破损、无淋巴节附着的部分，切成长20 cm左右的小片段。猪小肠主要由4层结构，由里到外依次为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层。首先用手术刀片分离出黏膜层边缘，由于黏膜下层组织较为疏松，所以可以将黏膜层基本完整的与黏膜下层分离。然后用裹有纱布的血管钳以磨挫的方法将浆膜层和肌层去除。自来水清洗干净后，见小肠黏膜下为一层浅乳白色的半透明基膜，但表面仍残留有少量的脂肪组织。经过物理方法处理过的小肠黏膜下层仍需要进一步化学处理以去除其内残留的细胞。②化学方法处理(Abraham法)^[11]：将物理方法处理后的小肠黏膜下层浸泡在含100 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH的混合溶液中(pH值11)浸泡16 h。取出后用去离子水冲洗干净，置于含1 mmol/L HCl和1 mmol/L NaCl的混合溶液(pH值0.5)中浸泡6-8 h。取出后用去离子水冲洗干净，置于含1 mmol/L NaCl的PBS中浸泡16 h。取出后用去离子水冲洗干净，在PBS (pH值7.4)中浸泡2 h。取出后用去离子水冲洗。③杀菌：在含1%过氧乙酸的体积分数20%乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.05%叠氮化钠的PBS清洗2 h。程序性降温到-80 ℃，冻干后真空包装。⁶⁰Co γ射线25-35 kGy照射消毒。④残留细胞计数：分别对上述经物理和化学处理后的小肠黏膜下层取多个样本，在光学显微镜下进行残留细胞计数。⑤小肠黏膜下层的苏木精-伊红染色组织学观察：取小肠黏膜下层放入40 g/L多聚甲醛中固定48 h，石蜡包埋，常规切片，脱蜡至水。将切片经蒸馏水浸洗后，浸入Mayer苏木精液中。取出切片，用自来水轻轻冲洗，待细胞返蓝色后，用体积分数70%酸性乙醇溶液进行分色，再用自来水冲洗约10 min。蒸馏水洗后，浸入1%伊红染液染色5-10 min。用蒸馏水洗去浮色后，经体积分数70%酸性乙醇分色，然后经体积分数80%，90%，95%和100%乙醇脱水。二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下观察。⑥小肠黏膜下层超微结构的扫描电镜观察：固定及脱水。将小肠黏膜下层样品装入样品盒中入HCP-2临界点干燥仪中干燥约2 h，取双面胶将已干燥的样品粘贴于样品台上，将样品放入IB-3型离子溅射仪中喷金3 min，扫描电镜观察。

小肠黏膜下层的生物安全性评价：

小肠黏膜下层浸提液的制备：根据GB/T16886相关标准，按6 cm²/mL浸提比例计算，将小肠黏膜下层浸泡在生理盐水中于37 ℃恒温箱中静置72 h，取上清液置入无菌瓶中备用(12 h内用完)。

浸提液pH值测定：实验组将浸提液置于干净离心管中，用pH计进行测量。同时以浸提媒质生理盐水作对照。每个样品连续测3次，取其平均pH值。

热源实验：取3月龄健康新西兰大白兔3只，雌雄不拘，体质量(1.2±0.2) kg，安静状态下于注射前3，2，1 h用肛温计测其体温，取平均值视为正常体温，然后自耳缘静脉注入新鲜制备的小肠黏膜下层浸提液 2 mL/kg，使用肛温计于注射后1，2，3 h测其体温，取其最高值减去正常体温即为该兔体温升高值。升高值在1.4 ℃以下可认为浸提液中不含热源物质，符合热源规定要求。

皮肤致敏实验：取6月龄健康新西兰大白兔6只，雌雄不拘，体质量(2.1±0.3) kg，随机分成实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组2只，背部脱毛后分别于皮内注射小肠黏膜下层浸提液、40 g/L多聚甲醛溶液和生理盐水各0.2 mL。于注射后即刻、24，48，72 h观察注射点局部皮肤有无红斑和水肿情况。

全身毒性实验：取6月龄健康新西兰大白兔4只，雌雄不拘，体质量(2.1±0.3)kg，随机分为实验组和对照组，每组2只，分别于耳缘静脉注射小肠黏膜下层浸提液和生理盐水各2 mL，观察有无骚动、呼吸抑制和呼吸急促等不良反应。1周后处死，取其肝肾组织标本， 40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察其细胞结构变化。

滑膜间充质干细胞与小肠黏膜下层的组织相容性实验：实验组取先期预实验中制备的第3代滑膜间充质干细胞。按3´10⁴/孔的密度接种于6孔培养板上，每孔加入2 cm×2 cm大小的小肠黏膜下层，添加转化生长因子3 10 ng、骨形成蛋白2 500 ng、地塞米松10^-7mol/L，刺激使滑膜间充质干细胞进入软骨分化谱系；另取同样大小的小肠黏膜下层支架放入6孔培养板内培养，不放入上述细胞和细胞因子，作为对照组；所用培养基为高糖DMEM培养液，隔日换液。培养2周后，分别将实验组及对照组标本取出，行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察分析形态学特点。苏木精-伊红染色及扫描电镜标本制备方法同上。

主要观察指标：①猪小肠黏膜下层的组织学观察结果。②猪小肠黏膜下层的安全性。③猪小肠黏膜下层与滑膜间充质干细胞的组织相容性。

统计学分析：所得数据用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用配对t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

支架是提供细胞黏附、增殖和分化的基础，也是维持组织三维空间结构，允许新生组织生成的支撑物。理想的支架材料应具备以下6个条件：①良好的组织相容性：材料应对种子细胞和邻近组织无免疫原性。②具有三维立体结构：材料必须是高度多孔的(孔隙率为75%以上、类似泡沫状)，从而具有很大的内表面积，有利于细胞的迁入和贴附，以及细胞营养成分的渗入和细胞代谢产物的排出。③生物可降解性和降解率：材料应是可吸收的，在组织形成过程中逐渐分解，从而不影响新生成组织的结构和功能。降解率应与组织生长率相近似。④良好的细胞界面：材料应具有良好的表面活性，有利于细胞的贴附，并为细胞在其表面生长、增殖、分泌基质提供良好的微环境。⑤可塑性和机械强度：材料可被加工成所需要的形状，并有一定的机械强度，在植入体内后的一定时间内仍可保持其形状，从而使新形成的组织具有一定的外形。⑥易于消毒和保存等。

目前可供选择作为半月板组织工程常用的支架材料，包括天然生物材料和人工合成生物材料。天然材料主要包括透明质酸、纤维蛋白和胶原^[6-8]，人工合成材料则有聚乙烯醇-水凝胶^[9]、糖胺聚糖、聚磷酸钙、聚乳酸、聚乙酸、聚乳酸/羟基乙酸聚合物等多种。

小肠黏膜下层是天然细胞外基质类生物衍生材料，近年较多用于修复组织缺损研究。目前小肠黏膜下层主要由猪小肠黏膜制备，具有无免疫原性^[2]、抗微生物活性^[3]，能促进组织再生等特性^[10-11]，且其来源广泛、制备简单、价格低廉，已被成功用于如血管^[12]、神经^[13]、骨^[14]、软骨^[15-16]、肌腱^[17-18]、韧带等多种组织工程的支架材料^[19]。小肠黏膜下层主要含有胶原、糖胺聚糖、糖蛋白等成分，胶原主要由Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白构成，此外还含有少量Ⅵ、Ⅴ型胶原，胶原成分约占其干质量的40%^[5]。糖氨聚糖主要包括透明质酸、硫酸肝素、硫酸乙酞肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等^[20-21]。小肠黏膜下层的这些特点与半月板软骨细胞的胞外基质相近，因此作者尝试选择小肠黏膜下层作为组织工程修复半月板功能细胞的支架载体。

此外，小肠黏膜下层还含有多种生长因子^[22]，主要包括成纤维细胞生成因子、转化生长因子和血管内皮生长因子等^[23-25]。成纤维细胞生成因子2能促进软骨细胞、血管内皮细胞的增殖，转化生长因子β能调节多种基质蛋白的转录，包括胶原、纤维结合素、糖胺聚糖、基质降解蛋白酶及其抑制物等，最终导致基质蛋白的积聚和增加。血管内皮生长因子能刺激毛细血管内皮细胞的增殖和形成，并创造其他血管再生长入的条件。因此这些细胞因子对组织修复重建及细胞生长有着重要的作用，能够诱导细胞迅速浸润，促使细胞尽早黏附、维持表型、形成集落，并且能刺激细胞分泌胶原等，且具有良好的生物相容性^[4]，又具有适当的机械特性，能承受周围组织压力，为再生细胞提供足够的生长空间，迅速诱导细胞浸润、刺激新生血管生成和宿主细胞的长入和分化，最后逐渐完全降解^[26]，产生的再生组织在结构和功能上均与原有组织相似^[27]。国外研究还证实经过物理和化学处理过程的小肠黏膜下层仍然含有这些生长因子^[28-30]。Abraham方法是最常用的不会破坏小肠黏膜下层生物学活性的处理方法，因此在这次实验中严格按照Abraham方法对猪小肠黏膜下层进行处理^[31]。

在实验中发现经物理处理过的小肠黏膜下层呈一层浅乳白色的半透明基膜，光镜下观察表面仍然存在小肠黏膜上皮细胞、脂肪细胞和一些其他细胞黏附。而光镜下观察经化学方法处理后的小肠黏膜下层其残留的细胞数量大为减少，苏木精-伊红染色有大量的以胶原纤维为主的细胞外基质，其主要结构和基质成分没有被破坏。扫描电镜下观察小肠黏膜下层黏膜面较肌层面光滑，无细胞残留，表面纤维组织交错形成疏松的三维网状立体结构，粗略估计其孔隙率为80%，符合上述理想支架材料应具备的6个条件。

生物相容性是指生命体对非活性材料产生反应的一种性能，一般是指生物材料与宿主之间的相容性，对支架材料进行生物相容性评价是组织工程的一个重要方面。目前常用的有体内法和体外法两种方法。根据中国GB/T 16886制定的医疗器械生物学评价的相关方法和标准，对小肠黏膜下层的生物相容性进行相关的实验，内容包括pH值测定、热源实验、皮肤致敏实验与全身毒性实验。实验中小肠黏膜下层浸提液pH测定值为6.5±0.5，与生理盐水接近，符合体内生理环境的要求。热源实验显示静脉注射小肠黏膜下层后，体温升高均小于1.4 ℃，在允许范围之内，说明小肠黏膜下层进入血液后不会产生热源物质。局部皮内注射小肠黏膜下层没有引起红斑、水肿等不良反应，说明其不会引起致敏反应。全身毒性实验结果表明静脉注射小肠黏膜下层后大白兔没有发生毒性反应，组织切片显示肝、肾组织细胞及其结构无明显破坏。因此认为小肠黏膜下层是一种无毒、无刺激、无免疫原性，生物相容性很好的生物材料，可以作为半月板组织工程支架植入体内。

实验中以小肠黏膜下层为支架，以滑膜间充质干细胞为种子细胞，观察了细胞在支架上的生长、增殖情况，结果发现在小肠黏膜下层加入滑膜间充质干细胞培养2周后，组织切片光镜下检查显示，小肠黏膜下层结构内部具有较多的细胞黏附生长于其疏松的多孔结构间，培养细胞的活性在小肠黏膜下层结构内部保持良好；扫描电镜检查可以更进一步清晰地观察到培养细胞黏附生长于小肠黏膜下层多孔结构内部疏松的多孔结构间，并且细胞的生长活性保持良好，细胞间通过突起相互连接或伸出伪足贴附于支架孔壁上。

文章快阅

延伸阅读

目前可供选择作为半月板组织工程常用的支架材料，包括天然生物材料和人工合成生物材料。天然材料主要包括透明质酸、纤维蛋白和胶原，人工合成材料则有聚乙烯醇-水凝胶、糖胺聚糖、聚磷酸钙、聚乳酸、聚乙酸、聚乳酸／羟基乙酸聚合物等多种。

小肠黏膜下层是天然细胞外基质类生物衍生材料，近年较多用于修复组织缺损研究。目前小肠黏膜下层主要由猪小肠黏膜制备，具有无免疫原性、抗微生物活性，能促进组织再生等特性，且其来源广泛、制备简单、价格低廉，已被成功用于如血管、神经、骨、软骨、肌腱、韧带等多种组织工程的支架材料。小肠黏膜下层主要含有胶原、糖胺聚糖、糖蛋白等成分，胶原主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，此外还含有少量VI、V型胶原，胶原成分约占其干质量的40%。糖氨聚糖主要包括透明质酸、硫酸肝素、硫酸乙酞肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等。小肠黏膜下层的这些特点与半月板软骨细胞的胞外基质相近，因此作者尝试选择小肠黏膜下层作为组织工程修复半月板功能细胞的支架载体。

此外，小肠黏膜下层还含有多种生长因子，主要包括成纤维细胞生成因子、转化生长因子和血管内皮生长因子等。成纤维细胞生成因子2能促进软骨细胞、血管内皮细胞的增殖，转化生长因子β能调节多种基质蛋白的转录，包括胶原、纤维结合素、糖胺聚糖、基质降解蛋白酶及其抑制物等，最终导致基质蛋白的积聚和增加。血管内皮生长因子能刺激毛细血管内皮细胞的增殖和形成，并创造其他血管再生长入的条件。因此这些细胞因子对组织修复重建及细胞生长有着重要的作用，能够诱导细胞迅速浸润，促使细胞尽早黏附、维持表型、形成集落，并且能刺激细胞分泌胶原等，且具有良好的生物相容性，又具有适当的机械特性，能承受周围组织压力，为再生细胞提供足够的生长空间，迅速诱导细胞浸润、刺激新生血管生成和宿主细胞的长入和分化，最后逐渐完全降解，产生的再生组织在结构和功能上均与原有组织相似。国外研究还证实经过物理和化学处理过程的小肠黏膜下层仍然含有这些生长因子。Abraham方法是最常用的不会破坏小肠黏膜下层生物学活性的处理方法，因此在本次实验中严格按照Abraham方法对猪小肠黏膜下层进行处理。

小肠黏膜下层与滑膜间充质干细胞的组织相容性

Histocompatibility between small intestinal submucosa and synovial mesenchymal stem cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	赵维彪, 何子微, 李季, 李毅. 3D打印导板在以SuperPATH技术行老年髋关节置换中的应用价值：回顾性研究和文献检索证据分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1324-1330.
[2]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[3]	王刚, 李东辉, 白志明. 长段输尿管损伤替代治疗的方法、材料及修复重建的演变历程[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1299-1305.
[4]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[5]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.
[6]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[7]	高扬, 白胜超, 陈圣菊, 王瑞元, 李俊平. 运动诱导骨骼肌损伤对结蛋白聚集体的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1243-1248.
[8]	陈娟, 张婷, 武一丹, 卢岩, 欧阳昭连. 组织工程热点子领域中国基础研究实力分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1267-1271.
[9]	陈伟, 邹刚, 刘毅. LARS韧带在前交叉韧带重建中的临床应用与关注热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1287-1292.
[10]	张圣敏, 刘超. 生物支架材料诱导脂肪来源干细胞成骨分化的最新热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1107-1116.
[11]	王田田, 王建忠. 骨髓间充质干细胞治疗早期股骨头坏死的应用与前景 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1117-1122.
[12]	林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.
[13]	岑妍慧, 夏猛, 贾微, 罗伟生, 林江, 陈松林, 陈炜, 刘鹏, 黎明星, 李景云, 李曼莉, 艾丁丁, 蒋云霞. 黄芩素能下调诱捕受体3表达抑制肝癌干细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1023-1029.
[14]	谢飞, 李晏乐, 林新晓, 胡海威, 桑志成, 孙永生, 蒋科卫, 程桯, 温冠楠, 温建民, 孙卫东. 机械应力对拇外翻足截骨端成纤维细胞外泌体的调控机制 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1089-1093.
[15]	刘群, 孙东东, 高丽兰, 何志江, 孙明林. 经皮椎体后凸成形后再发骨折相关因素的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(6): 976-984.