扩张器周围构建自体复合皮修复原位皮肤缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (20): 3139-3143.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.005

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扩张器周围构建自体复合皮修复原位皮肤缺损

艾剑雄，何丽霞，杨任欢，牙祖蒙

重庆医科大学附属第二医院整形美容科，重庆市 400010

收稿日期:2014-02-20 出版日期:2014-05-14 发布日期:2014-05-14
通讯作者: 牙祖蒙，博士，主任医师，重庆医科大学附属第二医院美容整形科，重庆市 400010
作者简介:艾剑雄，男，1980年生，陕西省宝鸡市人，汉族，重庆医科大学在读硕士，主要从事组织移植和体表器官塑形方面的研究。
基金资助:
重庆市科委自然科学基金课题(CSTC 2007BB5315)，课题名称：体内构建自体复合皮的基础及应用研究

Constructing autologous composite skin around the expander for the repair of skin defects

Ai Jian-xiong, He Li-xia, Yang Ren-huan, Ya Zu-meng

Department of Plastic Surgery, Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China

Received:2014-02-20 Online:2014-05-14 Published:2014-05-14
Contact: Ya Zu-meng, M.D., Chief physician, Department of Plastic Surgery, Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China
About author:Ai Jian-xiong, Studying for master’s degree, Department of Plastic Surgery, Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Science and Technology Committee of Chongqing City, No. CSTC 2007BB5315

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前组织工程皮肤构建时间长，价格贵，修复效果不佳，而且抗原的消除以及疾病传播问题也没有彻底解决。在理想的组织工程皮肤诞生之前，如何利用现有的成熟技术来解决自体皮源奇缺患者的创面修复难题？
目的：观察扩张器周围构建的自体复合皮用于修复皮肤缺损创面的效果。
方法：取大耳白兔10只，于其背部中线两侧对称部位皮下各埋植一球形硅胶扩张器，待扩张器周围形成纤维包囊后，分别向其中注入原代培养的自体皮肤上皮细胞悬液(实验组)或生理盐水(对照组)，4周后取出扩张器，可见实验组形成上皮化的纤维包囊，即自体复合皮。沿扩张囊周边切除扩张器顶部皮肤及部分纤维包膜，而扩张器底面和顶部周边的纤维包囊予以保留，形成自体复合皮覆盖的创面，而对照组创面为非上皮化的纤维包囊覆盖，每日观察创面的愈合状况直至痊愈。
结果与结论：实验组创面红润洁净，分泌物少，平均愈合时间为(14.0±0.4) d，镜下可见上皮层厚而规整；对照组创面分泌物较多，平均愈合时间为(27.0±0.7) d，镜下见上皮层薄且细胞排列不规整。说明应用扩张器周围构建的自体复合皮能明显促进创面愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 组织工程, 皮肤组织构建, 扩张器, 硅胶, 纤维包囊, 上皮细胞, 自体复合皮, 兔, 皮肤缺损, 创面愈合

Abstract:

BACKGROUND: The construction of tissue engineered skin needs a long time and high price, and the repair effects are poor. Moreover, the problems such as antigen elimination and disease propagation are not thoroughly solved. How to solve the tough problem of wound surface repair in patients lacking of autologous skin using current mature technology before the occurrence of ideal tissue engineered skin.
OBJECTIVE: To investigate the effects of autologous composite skin constructed around expanders on the repair of the wound surface.
METHODS: A total of 10 rabbits were selected. Two globular silica gel expanders were embedded subcutaneously in the symmetrical sites on the back of rabbits. After the expanders were covered by fiber kystis, cell suspension of primary cultured skin epithelial cells (experimental group) or physiological saline (control group) were infused into lacuna between the expander. Four weeks later, the expanders were obtained. Experimental group presented epithelization, i.e., autologous composite skin. The skin and some fiber members on the top of the expanders were resected around the encystations. The fiber kystis on the bottom and surrounding the expanders was left to form the wound surface covered by autologous composite skin. However, the wound surface was covered by non-epithelization fiber kystis in the control group. The healing of wound surface was observed until recovered.
RESULTS AND CONCLUSION: In the experimental group, the wound surface was ruddy and pure, with less secretion; the average healing time was (14.0±0.4) days; the microscopic appearance indicated that epithelial layer was thick and regular. In the control group, there was more secretion on wound surface; the average healing time was (27.0±0.7) days; the microscopic appearance indicated that epithelial layer was thin and irregular. These results suggested that the construction of autologous composite skin around the expanders could noticeably promote the healing of wound surface.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: wound healing, epithelial cells, epidermis, burns, dilatation, tissue expansion devices, tissue engineering

中图分类号:

R318

艾剑雄，何丽霞，杨任欢，牙祖蒙. 扩张器周围构建自体复合皮修复原位皮肤缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3139-3143.

Ai Jian-xiong, He Li-xia, Yang Ren-huan, Ya Zu-meng. Constructing autologous composite skin around the expander for the repair of skin defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3139-3143.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

材料方法

设计：自体对照动物实验。

时间及地点：于2009年11月在重庆医科大学动物实验中心完成。

材料：

实验动物：健康4周龄大耳白兔10只清洁级，雌雄不限，体质量0.5-1.0 kg，由重庆医科大学实验动物中心提供。

实验中对动物的处置符合2006年国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中标准。

特殊定制扩张器：购自上海威宁医疗器材公司。该特殊定置扩张器是在普通硅胶扩张器上改造，增加一个通入纤维包囊和扩张器之间的注射管道和注射壶，扩张容量为10 mL(图1)。

扩张器周围构建字体复合皮实验用试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
速眠新Ⅱ	沈阳兽用制药厂，中国
一次性培养瓶50 cm²(TC-Treated)	Corning公司，美国
DMEM/F12(1∶1) 培养液，胎牛血清，0.25% EDTA/胰蛋白酶	Gibco公司，美国
恒温培养箱	Thermo 公司，美国
AIR TECH超净工作台	苏净集团，中国
鼠抗人角细胞广谱角蛋白单克隆(AE1/AE3)抗体，DAB显色液	中杉金桥公司，中国
PBS，DISPASEⅡ中性蛋白酶	Gibco公司，美国
光学显微镜，倒置显微镜IX-70	OLYMPUS公司，日本

方法：

兔上皮细胞培养：速眠新Ⅱ 0.2 mL/kg肌肉注射，全身麻醉后置于超净工作台，消毒后，于颈部取大小约 2 cm×3 cm皮条放入PBS中清洗。加入0.25%中性蛋白酶Ⅱ分离表皮，EDTA/胰蛋白酶消化。将制成的单细胞悬液200目滤网过滤后接种于培养瓶中，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。置于恒温孵育箱。3 d换液1次，4 d后，细胞生长、增殖至70%-80%融合时予以1∶2传代继续培养。在培养过程中采用差异酶消化法纯化培养出上皮细胞。

表皮细胞培养和鉴定由同组另外的实验人员完成，结果将另文详细报道，为同一课题的前半部分，本文不再赘述。

上皮细胞鉴定：培养10 d后，对培养瓶内的细胞进行抗AE1/AE3(1∶150)ABC法免疫组化检测。用质量浓度 40 g/L多聚甲醛固定后，PBS漂洗，体积分数3%的过氧化氢孵育，加一抗4 ℃过夜，加二抗37 ℃孵育30 min，PBS漂洗，加三抗37 ℃孵育30 min。DAB显色。阳性染色为棕黄色。

埋置扩张器：在取皮时将10 mL特制的球形扩张器埋置于实验兔的背中线两侧对称部位皮下，两个注射壶均埋置于皮下，埋置时通过注射壶A向扩张囊内注入生理盐水10 mL将之充盈，严密缝合伤口，注意无菌技术，确保扩张器囊周围无菌。以后若想扩大扩张囊则在伤口愈合后再注入生理盐水。

上皮细胞接种：扩张器埋入2周后，将培养的上皮细胞从培养瓶中分离，用生理盐水制成1 mL的10×10⁹ L^-1细胞悬液，通过注射壶B口注入扩张器与纤维包囊间的腔隙。对照组注入等量生理盐水。

自体复合皮形成的观察：于接种2，3周切取纤维包囊组织块，用甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片后行苏木精-伊红染色，光镜下观察上皮细胞生长及其与纤维包囊之间的结合情况。对照组同样切取包膜光镜观察。

创面制备和修复：接种4周后取出扩张器，剪去顶部被扩展的皮肤，范围为超过扩张器直径约1.0 cm，同时保留顶部周围宽约1.0 cm的复合皮皮瓣和底部的复合皮，皮肤缺损缘与皮瓣边缘间断缝合，作为皮肤缺损区域的修复组织，空白组同此法。观察创面愈合时间。
创面观察：分别于创面修复0，3，7，14，28 d对两组创面照相，并切取复合皮创面行苏木精-伊红染色，光镜下观察上皮细胞在不同阶段的生长状况，包括与纤维包囊之间的结合和表皮细胞增殖的情况。

主要观察指标：实验组与对照组兔创面的愈合时间及愈合情况。

统计学分析：结果用x(_)±s表示，实验组和对照组比较用t 检验分析，以P < 0.05为显著性差异标准，采用SPSS 12.0软件包进行数据统计。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

讨论

为解决大面积烧伤、严重创伤的治疗问题，整合现有的技术，在体内构建一种类似皮肤的自体复合皮实为一种有效的选择。皮样囊肿、表皮样囊肿形成和生长的机制给作者在体内构建自体表皮以启示，且国内外的文献报道也提供了可行的依据^[4-5]。1975年Rheinwald等^[6]和Green等^[7]首次报道人体上皮细胞在体外培养获得成功。其后，体外培养的自体上皮细胞膜片作为一种永久性的生物覆盖物被应用于烧伤创面。硅胶囊扩张器植入体内，由于机体的自我保护机制，于其周围会形成一层纤维包膜。国内外学者对其研究较多，其中在李江等^[8]的组织学观察中，重新对其进行描述，通过苏木精-伊红染色后显示切片上仅见3层结构，而用维多利亚蓝(Victoria blue)特殊染色后发现另有一层弹力纤维。他借助电镜及光镜将发育期的扩张包膜从浅面到底面分为4层：①细胞层：该层主要含成纤维细胞、炎性细胞、多核巨细胞，还有少量网状纤维及胶原纤维。②细胞纤维层：此层由大量的胶原纤维组成，同时含有成纤维细胞、毛细血管及发育良好的小动脉及小静脉以及少量网状纤维。胶原纤维平行排列，其中Ⅰ型胶原纤维丝呈细波纹样。若用特殊染色方法，在小血管中可以找到典型的血管弹力膜。③弹力层：其由弹力纤维紧密排列而成，纤维呈平行排列并与细胞纤维层中的纤维成垂直状，内含少量胶原纤维。④纤维板层：其内存在致密的胶原纤维，有少量细长的纤维细胞分布其中。胶原纤维又可分为两层，表层的纤维呈铁丝网状或螺旋状；内层的纤维平行分布，且与弹力层纤维的走行方向一致。Kostakoglu^[9]亦做过相似研究，得出结论与李江的大致相同。李江等^[8]又依据包膜的各自特征将其列为两型：成熟型扩张包膜与发育型的扩张包膜。因扩张包膜的结构特点，且其中存在成肌纤维细胞(MF)，发生同步收缩现象^[10]，经研究证明发育型的扩张包膜收缩率较低^[8]。杨宇^[11]通过构建动物模型，对扩张包膜的血运状况进行研究后发现，扩张包膜内血管丰富，发育良好，相互之间构成密集的网络状连接，与底部组织的血管网亦联系紧密。

从扩张包膜的组织学结构特点可以看出，其内含大量的胶原纤维和血管，具备一定的抗张性，可作为优良的自体组织移植物。Tsai^[12]在临床应用时将扩张包膜切除后转移于创面，皮瓣全部成活，显示其存活能力极强。Isenberg^[13]在进行唇部凹陷矫形术时，将扩张包膜移植于患者唇部，术后随访，1年后移植物体积仍未见明显缩小，显示其可作为永久的创面移植物来使用。安波等^[14]在临床应用中将切取的皮肤移植在扩张包膜上，皮肤存活良好。许涛等^[15-16]研究硅胶所致纤维包膜时发现，移去硅凝胶后包膜有部分吸收，原位的纤维包膜吸收较多，但移植到别处的包膜则较少出现吸收，若将其切成碎片，其吸收更少。据此可以看出埋置硅凝胶后所形成的纤维包膜可作为优良的自体移植物。

Krimmel等^[17]构建以尺侧上动脉为营养血管的黏膜瓣，用于修复口腔内的缺损时，切取口腔粘膜并将粘膜侧贴于硅胶片上，一同移植于皮下，在近3个月时将其取出时可见粘膜上皮细胞沿硅胶片向四周爬行，且与底部组织结合牢固。焦向阳等^[18]以大鼠为研究对象，于其皮下埋置软组织扩张器，2周后皮肤切开，将培养好的角质细胞注入扩张囊和纤维包膜之间的间隙内，3周后可见纤维包膜表面出现上皮化，可进行颊部洞穿型缺损的修复重建。以上表明以纤维包膜为载体构建自体复合皮是一种理想而可行的方法。这次实验中，作者首次对扩张器进行了改造，即在传统扩张囊壁上增加一个通道，可将上皮细胞悬液经此通道直接注入扩张囊和纤维包囊之间的间隙。如此可反复注入细胞悬液或其它可加速包膜上皮化的物质；且可多次构建并切取复合皮用于创面修复。

本实验在体外培养扩增自体皮肤表皮细胞，注入扩张器与纤维包囊间的腔隙内，2周后可见表皮细胞在纤维包囊表面呈层状生长，光镜下类似于假复层鳞状上皮。随后的创面修复结果显示：实验组创面愈合比对照组显著提前，创面洁净、红润有弹性，感染概率低。理论上可多次在同一部位构建并切取复合皮修复创面，制造的皮源量大，操作简单、费用低廉、不存在相容性差的问题等。如果在细胞培养过程中及注入扩张包膜与扩张囊间隙后各加入表皮生长因子等^[19]，表皮细胞量的扩增速度和上皮化速度都会加快，复合皮构建周期可进一步缩短。人体很多部位可进行扩张器埋置，如皮下、组织间隙等，临床应用空间很大。整个扩张器周围的复合皮可全部作为移植物，复合皮面积较大，取皮后可重复制备，因此皮源的供应量会很大。

然而最理想的皮肤替代物应当是具有正常皮肤的特征与功能^[20]，作者这次实验没能使其具有正常皮肤的生理功能，今后有望通过皮肤干细胞研究使其定向分化成不同的皮肤附属器来解决这一问题^[21-23]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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