2.1 炎性过程相关 已知包括类风湿关节炎在内的大多数疾病，Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR-4)和其受体MD-2在炎症过程中扮演了关键分子，有实验证实类风湿关节炎患者血浆来源的外泌体能够以与脂多糖相同的机制激活该受体，且比正常来源的外泌体更能增强TLR4通路的活性。更进一步的实验证实，相同的外泌体作用于脂多糖靶定位点突变的单核细胞时不能够引起炎症，也从反面证实了该外泌体能够以脂多糖相同机制激活炎症反应[8]。肿瘤坏死因子α处理后的T细胞和单核细胞分泌的胞外囊泡能够刺激成纤维样滑膜细胞(FLS)产物的分泌，如COX-2/mPGES-1/PEG2，已知环氧化酶2(COX-2)能够将花生四乙酸转化为炎性因子(PEG2)，从而引起炎症和疼痛。除了引诱出的酶类，NF-kB/AP-1/JNK等促炎核转录因子也相应增加胞外囊泡膜上的氧化膦酯(oxidized phospholipids)，对于激活炎症受体起重要作用。但有趣的是，脂多糖刺激和胞外囊泡刺激的单核细胞的基因表达谱的变化完全不同，因此推测胞外囊泡可能是扮演了解决炎症的应激预警信号分子。 先前的研究中发现，接近100%的类风湿关节炎患者中存在能够激活TLR4受体从而引起大量肿瘤坏死因子α释放的瓜氨酸化免疫复合体[9]。体外实验中，从类风湿关节炎患者的关节中获得的胞外囊泡能够引起软骨组织的炎性改变[10]。类风湿关节炎患者成纤维滑膜细胞来源的胞外囊泡包含有膜结合形式的肿瘤坏死因子α[11]，用含有肿瘤坏死因子α的胞外囊泡去刺激成纤维样滑膜细胞能够引起NF-kB的激活，而NF-kB能够促进炎症发生和滑膜组织中T细胞的凋亡。另外一项发现，胞外囊泡在类风湿关节炎炎症中扮演重要角色，在其关节积液中发现了血小板来源的胞外囊泡，而在骨关节炎患者中未发现。胶原蛋白受体中的糖蛋白VI受体，是在产生血小板胞外囊泡的过程中的关键受体。在成纤维样滑膜细胞中，血小板来源的胞外囊泡被证实具有通过白细胞介素1产生促进炎症的作用[12]。对于抗炎胞外囊泡和炎症胞外囊泡刺激平衡的破坏可能是治疗炎症的潜在机会，需要进一步研究。     Mancek-Kerer等[13]证实胞外囊泡能够有助于解决炎症问题。从类风湿关节炎患者的关节滑膜积液中分离得到胞外囊泡，通过特异性标志分子标记，证实与血浆中相比，来源于中性粒细胞/单核细胞/T细胞来源的胞外囊泡显著升高，尤其是中性粒细胞来源的胞外囊泡。与正常小鼠相比，有中性粒胞外囊泡缺陷的小鼠当遭遇关节炎症时，软骨的破坏程度是其2倍。体外实验发现，包含有ANXA-1的胞外囊泡作用于软骨组织时，能够激活代谢相关基因，可引起细胞外基质的积聚和炎性因子(IL-8/PEG-2)的释放。将包含有膜联蛋白A1(ANXA-1)的胞外囊泡注射入关节炎鼠的关节内能够引起关节软骨破坏的显著减少。通过获得性转移接受中性粒细胞的小鼠的关节内胞外囊泡增多，说明中性粒可以不通过滑模液直接传递胞外囊泡至关节内。从以上研究中不难看出，在关节炎症发生过程中，外泌体通过携带炎症因子，对疾病的病起到关键作用。 相较于类风湿关节炎，骨关节炎中外泌体的研究较少。白细胞介素1β处理过的成纤维样滑膜细胞分泌的外泌体作用于骨关节炎滑膜细胞能够上调基质金属蛋白酶13和ADAMTS-5，下调Ⅱ型胶原蛋白[14]。该研究证实在关节腔内，成纤维样滑膜细胞和滑膜细胞中间存在着一条反馈环路，从而促进炎症的发生。另外，白细胞介素1β刺激纤维细胞获得的外泌体中含有较高浓度的白细胞介素6/基质金属蛋白酶3/血管内皮生长因子[15]。当该外泌体应用于小鼠股骨软骨移植组织，可以刺激产生更多的蛋白聚糖产物，同时也可明显增强血管增生。说明外泌体在骨关节炎发病中起着传递环路的角色。 2.2  MiRNA的传递  在类风湿关节炎的发病进程中，miRNAs扮演重要角色。广为所知的2个miRNAs即miR-155和miR-146a。最近发现树突细胞释放且被免疫细胞摄取的胞外囊泡中包含有miR-155和miR-146a[16]。骨关节炎患者和正常人比，骨关节炎患者成纤维样滑膜细胞中的miRNA-155升高明显，并且抑制miR-155导致体内肿瘤坏死因子α产物的下降。该基因能够被肿瘤坏死因子α和脂多糖激活[17]，miRNA敲除的小鼠能够抵抗炎症的进展，而过表达的小鼠出现炎性因子的增多。过表达miRNA-155能够抑制受炎性刺激后基质金属蛋白酶13产物的释放[18]。类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞中的MiRNA-146a是上调的，在小鼠体内实验中，miRNA-146a可以被肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β上调。miRNA-146a的过表达抑制白细胞介素6和白细胞介素8的分泌，并且下调白细胞介素1受体相关激酶1 (IRAK1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)[19-21]。MiR-146a能够降低树突细胞中炎性基因的表达，而miR-155的作用却与之相反。先给予miR-155敲基因小鼠以脂多糖刺激，然后再注射含有miR-155的胞外囊泡，发现与对照组相比，小鼠炎症增强，肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的水平升高，并且在所有的免疫细胞中均可以检测到miR-155。同样的实验在miR-146a敲基因小鼠中进行，同样发现炎症以高水平出现，不同的是肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的水平出现降低。该发现揭示了一条重要的炎性相关信号通路[22]。所有的免疫细胞中均可检测到miR-146a，这也证实了这条免疫调控炎性通路的重要性。更进一步，包含有miR-146a和miR-155的胞外囊泡在炎症调控中的存在证明了抗原呈递细胞(树突状细胞)和成纤维样滑膜细胞的相互联系。 白细胞介素1β刺激成纤维样滑膜细胞获得的外泌体被测得含有大量miRNA的表达序列。当用白细胞介素1β刺激细胞时，发现了340个miRNAs被上调，而在外泌体中只有11个miRNAs上调，这也说明被打包进外泌体中的miRNAs是被选择过的[23]。然而有趣的是，39个miRNAs被发现下调，而在细胞中仅有24个下调。11个上调的miRNAs中只有5个在细胞中也出现上调，包括：miR-500B/ miR-4454/ miR-720/ miR-199B/ miR-3154.其中miR-4454、miR-720和miR-199B是被广泛研究的miRNA。MiR-199B在软骨形成的过程中明显增多，而在间充质干细胞衰老的过程中明显减少[5]。MiR-4454受肿瘤坏死因子α的刺激而增多，并且是NF-KB的靶目 标[24]。miR-720可以促进细胞的迁移，但与骨骼的研究尚有限。通过PCR实验发现骨关节炎患者的胞外囊泡内的miR-200C升高了2.5倍，该miRNA已被证实能够随着氧化应激的发生而上调，并且作用于ZEB1，抑制其转录作用。而ZEB1，作为转录因子，在承认关节软骨的维持上起着关键作用，并且在关节软骨内有着高水平的表达。缺少Zeb1的小鼠会出现严重的骨骼肌肉缺陷，因为该转录因子已知参与了骨的形成[25]。并且ZEB1能够已知Ⅱ型胶原蛋白启动子，降低Ⅱ型胶原蛋白转录水平。 外泌体携带Wnt5a和Wnt5b，通过激活YAP转化Wnt信号通路和增强软骨细胞的增殖和迁移，同时明显降低细胞外基质的分泌。高表达miR-140-5p通过RalA阻断该过程。在体外SMSC-140-Exos增强非典型鳞状细胞的增殖和迁移，而不影响细胞外基质的分泌。在体内，SMSC-140-Exos能够成功降低兔模型的关节炎程度[26]。通过这些研究可以发现，关节炎发病过程中外泌体内包含有大量的miRNAs，而在病理变化过程中，外泌体内miRNAs的上调与下调与组织内的变化是不完全一致的，证实该过程是经过生物选择性的，具有一定的生物学意义，通过对该差异的彻底的透析，能够为解决关节炎的发病起到至关重要的作用。 2.3 对软骨细胞及细胞外机制(细胞外基质)的影响  软骨细胞及胞外基质对于关节软骨都是至关重要的。细胞外基质具有低细胞浓度特点，有利于组织的功能形态，从而起到维持关节软骨的作用。细胞外基质充满了胶原蛋白Ⅱ和蛋白多糖，尤其是聚集蛋白多糖。软骨细胞提供聚集蛋白多糖合成，并缓慢的形成关节软骨。在正常的关节软骨中，细胞外基质的合成和破坏存在着一个平衡，以此维持着关节软骨的完整。肿瘤坏死因子α处理后的单核和T细胞来源的外泌体能够引起成纤维样滑膜细胞释放大量产物，包括基质金属蛋白酶1、3、9、13。基质金属蛋白酶，尤其是基质金属蛋白酶13，能够分解蛋白聚糖，例如多聚蛋白糖和胶原蛋白，是类风湿关节炎过程中重要的软骨破坏机制[27-29]。但是阻断肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β受体不能缓解成纤维样滑膜细胞的应答，证明外泌体引起的炎症与肿瘤坏死因子α引起的炎症的细胞外基质破坏不尽相同[27]。类风湿关节炎来源的成纤维样滑膜细胞分泌的外泌体包含有大量的ADAMTS-5[30]，这也证实纤维组织释放的外泌体能够直接的破坏关节组织，并且更进一步导致关节损伤。内皮细胞来源的外泌体携带基质金属蛋白酶2、9、14，提示引起毛细血管破坏的外泌体对于液体积聚/肿胀和细胞蛋白的关节腔到血液系统的转移有关。Hexosaminidase D和B-glucuronidase是与多聚蛋白糖相同的酶类，能在类风湿关节炎和骨关节炎患者的关节积液中的外泌体中检测到[31-32]。骨关节炎和类风湿关节炎患者外泌体中获得的B-glucuronidase有酶活性，之前它被看作一个保守基因，但在外泌体中的定位证实其对于调控细胞外基质有重要作用。 在骨关节炎患者的关节中，细胞外基质的平衡被打破。基质金属蛋白酶是一大类家族蛋白，与细胞外基质的破坏相关，尤其是基质金属蛋白酶13[33-34]。基质金属蛋白酶13缺失的小鼠能够抵抗胶原蛋白和多聚蛋白聚糖的破坏，从而减轻关节的磨损。外泌体作为不同的组织和细胞之间交流的信号分子，代表了重要的调控过 程[35-36]。当白细胞介素1β处理的滑膜细胞来源的外泌体作用于成纤维样滑膜细胞时，发现与对照组相比，基质金属蛋白酶13的产量出现3倍的升高。另外，白细胞介素1β/肿瘤坏死因子α/环氧化酶2也出现不同程度的明显升高，证明外泌体在骨关节炎的炎性成分中扮有重要角色[37]。骨关节炎的病理过程较复杂，细胞外基质的合成不能弥补骨结构的损失[38]，从而导致临床症状的出现，例如疼痛、骨擦感、骨赘形成和关节间隙变窄。该平衡被破坏的原因是复杂的，尚需进一步研究。 2.4 免疫相关外泌体对关节炎的治疗作用 最近发现，免疫抑制树突状细胞中来源的外泌体具有与树突状细胞相似的内容物和免疫抑制的效果。且已证实免疫抑制树突状细胞及外周血中获得的外泌体具有抑制炎症的作用，因此目前来看其在治疗类风湿关节炎方面安全有效果。转染慢病毒表达白细胞介素10或被重组白细胞介素10处理过的树突状细胞被证实具有抗炎和抑制鼠胶原诱导性关节炎的功能。该树突状细胞分泌的外泌体也被发现具有免疫抑制的作用，其能够在混合的淋巴细胞反应中降低T细胞的增殖。被KLH抗体免疫后的小鼠，局部注射树突状细胞(被转染慢病毒表达白细胞介素10或被重组白细胞介素10处理过)及其来源的外泌体，均能够明显降低KLH所引发的迟发性过敏反应(DTH)。胶原诱导性关节炎模型小鼠给予一定量的该外泌体注射能够有效减慢病情进展，而相反直接注射重组小鼠白细胞介素10则没有效果[39]。同样，在与树突状细胞/白细胞介素10细胞对比中，外泌体对迟发性过敏反应和胶原诱导性关节炎模型的效果仍是更有利的。尽管没有彻底的研究，但外泌体的抑制效果并不仅仅是缘于白细胞介素10的传递。而有MHC缺陷的外泌体不能抑制迟发性过敏反应说明其是MHC依赖性的。另外B7-1/2(CD80和CD86)对IL-10-BMDC-exosomes的抑制效果是肯定的[40]。因此可猜测，白细胞介素10的处理使DC-exosomes含有不同的成分，从而更具有免疫抑制性。有研究证实树突状细胞能够表达Th2因子白细胞介素4，对于小鼠胶原诱导性关节炎有治疗效果[41-42]。将经过慢病毒转染表达白细胞介素4的未成熟的骨髓来源树突状细胞(BMDC)注射入胶原诱导性关节炎模型小鼠中能够明显抑制疾病的进展。注射含有白细胞介素4的树突状细胞的治疗效果要明显强于重复注射合成白细胞介素4或直接注射adenoviral IL-4与DC/IL-4免疫抑制效果类似，其来源的外泌体也被证实能够降低胶原诱导性关节炎的严重程度，抑制迟发性过敏反应反应。进一步发现，给小鼠静脉注射树突状细胞/白细胞介素4-外泌体可以发现其迁移到脾脏、肝脏中并且与CD11C+ DCs/F4/80+巨噬细胞进行反应。取经过处理的小鼠的脾脏细胞注射入迟发性过敏反应模型小鼠肿胀的爪子中，可以明显减轻其肿胀程度，表明树突状细胞/白细胞介素4来源的外泌体能够直接或间接的修改内源性APCs和T细胞的功能[43]。 除了免疫抑制树突状细胞来源的外泌体，其他来源的抑制性外泌体也有治疗关节炎症疾病的潜能。许多组织或体液中获得的外泌体已经被证实有免疫调节和免疫耐受功能。例如，血小板或外周血来源的外泌体能够引起T细胞信号缺陷，从而减轻胎儿的免疫炎症反    应[44-45]。将初次接受病原体受体的小鼠血清中的外泌体注射入小鼠体内能够引起特异性的抗体耐受[46]。另外，变态性花粉过敏性哮喘小鼠的肺泡灌洗液中分离的外泌体能够预防抗原特异性的气道反应[47]。并且，在体外实验中，人乳汁中分泌的外泌体能够增加调控T细胞的数目，抑制效应T细胞的激活[48]。从特定的体液，尤其是外周血浆或血清中获得的外泌体已被证实能够降低关节的炎症。 血浆来源外泌体已经证实，正常小鼠和抗体免疫小鼠血浆来源的外泌体均含有特定的表面蛋白标志物，包括MHCⅠ、MHCⅡ、CD11b、CD71、FasL、CD86。经过KLH抗体免疫的小鼠血浆中获得的外泌体对小鼠局部注射后，能够对KLH导致的迟发性过敏反应应答反应起到免疫抑制的效果[49]。该效果是抗原特异性的，因为另外一种对照抗体处理后的小鼠来源的外泌体并不能引起免疫抑制反应。MHCⅡ+外泌体对于该抑制效果起到关键作用，将所有外泌体中MHCⅡ+的除掉，则该效果就不存在了。另外，该抑制效果是有时间依赖性的，免疫第14天的小鼠获得外泌体才有该效果。该研究说明用自体血浆来源的外泌体作为抑制抗原特异性炎症反应的治疗剂是非常有潜力的。将全血与CrS04-glass beads共同孵育一小段时间，可以得到抗炎因子产物[50]，包括IL-1Ra/IL-4/IL-10以及生长因子胰岛素样生长因子1。该增强抗炎分子的方法已经应用于临床治疗，包括骨关节炎、类风湿关节炎、脊柱病，是有效且安全     的[51-52]。有报道对于传统疗法不敏感的类风湿关节炎患者，关节注射外泌体具有较好疗效，包括降低多关节疼痛，降低血中炎性分子。非典型鳞状细胞来源的外泌体的治疗作用被证实是安全的，从而为其他炎性和自身免疫病的治疗提供借鉴。 目前外泌体在细胞之间的调控作用是通过何种方式进行运转的尚未完全清楚，只知与细胞的特异性识别有关。已知外泌体表面携带有不同的黏附分子，例如整合素αvβ3/αvβ5/ICAM1/LFA1，有助于其与免疫细胞的接触与反应[53-54]。且发现胞外囊泡在激活幼稚T细胞的过程中，MHCⅡ与ICAM1是必不可少的。最近的许多文献表明，外泌体与吞噬体类似[55-58]，胞饮也是一种可能的机制，一旦进入细胞，胞外囊泡既能与核小体进行融合，也可以被溶酶体降解。一旦被融合，其蛋白就能够被转移至其他部位从而进行流转[59]。"