Molecular dynamics simulation: a new direction targeting physiological mechanisms of neuronal calcium sensor-1 protein

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.018

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Physiological functions, structural fold and unfolding of neuronal calcium sensor-1 (NCS-1) have been explored in a series of experiments, and then the possible mechanism models and key factors for remaining the structural stability are raised. But many functional models cannot be verified due to the limitations of resolution of the time and space and complex protein structure. The experimental phenomena and hypothesis or models may be tested at the atom levels by molecular dynamics, and the new structure may be predicted to provide basis for model establishment and functional mechanisms.

OBJECTIVE: To overview the research process of physiological functions and mechanisms of NCS-1 using the experimental method and molecular dynamics simulations, thereby providing basis for future research.

METHODS: PubMed database was retrieved for the literatures addressing NCS-1 using the English subject term “Neuronal Calcium Sensor-1 or Neuronal Calcium Sensor1 or Neuronal Calcium Sensor 1 or NCS-1”. Finally, 72 articles were included in result analysis based on the inclusion and exclusion criteria.

RESULTS AND CONCLUSION: The theoretical models of NCS-1 in secretion regulation, dopamine D2 receptor regulation, adenosine A2A receptor regulation in hepatocytes and Ca²⁺ regulation in myocardial cytoplasm and nuclei with different stimuli are put forward. The key factors to remaining structural stability are analyzed and summarized by modular dynamics simulation in view of structure. It is recommended to combine these two methods in order to deeply understand the protein functional mechanisms, thereby pushing the in-depth study.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Molecular Dynamics Simulation, Dopamine, Hepatocytes, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Zhu Yu-zhen, Zhang Qing-wen. Molecular dynamics simulation: a new direction targeting physiological mechanisms of neuronal calcium sensor-1 protein[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3224-3233.

Figures/Tables 4

2.1 NCS-1生理机制的实验理论模型 NCS-1在不同等级生物体内分布广泛，功能表现出多样性。随着研究的深入，逐渐发现其功能发挥的部分生理机制，并提出一些实验理论模型，现将NCS-1与靶体相互作用的生理机制实验理论模型进行梳理和总结，以期进一步加深对NCS-1功能发挥的理解。 2.1.1 NCS-1停靠在膜的生理机制理论模型 NSC-1通过其N端的14碳链，主要与高尔基体膜相连，多分布于细胞核周围；少量的NCS-1因高尔基体的胞吐、分泌作用，被带到细胞膜上或胞质内的分泌囊泡膜上[2]。当失去14碳链后，NCS-1失去空间特性，弥漫整个胞质，均匀分布；胞内游离钙离子浓度升高，不影响NCS-1亚细胞的分布。在这点上，与钙传感蛋白亚家族中的海马钙素、神经钙素等截然不同[3]。有研究指出，NCS-1在Ca2+依赖方式下上行到膜[4]。也有研究指出，N端的肉豆蔻酰化是一个脂质末端变异体，一半的脂质附属物导致了疏水性的提高，从而将蛋白质固定在膜处[5](见图1)。但通过脂质使NCS-1停靠在膜位置上的功能机制一直存在争议[6-7]。虽然NCS-1跟NCS家族其他成员一样，也具有4个EF手性位点，只有其中3个可以与Ca2+结合(见图1C中圆点)，但NCS-1又与家族中的其他成员不同，其通过结合大量的配体能够与细胞内浓度发生微小变化的Ca2+进行结合和传输，并根据环境重塑其结构[8](见图1A，B)；而且其可以在毫秒级时间内对Ca2+的变化作出反应，并将其迅速传导，对钙离子的结合具有“高亲和力，低容量”的特点[9]。当与Ca2+结合，并达到饱和状态时，可以和大量的结合物相互作用，这时会有一个大的构象变化，直到结构趋于稳定[10](见图1B)，而构象变化又使NCS-1转变到它的活性状态，从而调节细胞内的Ca2+[11]。如果没有钙和镁，只暂时存在于活性状态中的NCS-1就不能保持一个稳定的折叠结构[12]。 NCS-1在与膜接触前，N端肉豆蔻酰呈折叠状态(见图1B，C1)，并在疏水口袋内；加入Ca2+后，NCS-1构象发生改变(见图1A，B)，暴露出N端肉豆蔻酰并插入膜中(图1B，C)，N端甘氨酸通过N-肉豆蔻酰基转移酶的作用，使NCS-1停靠在膜的位置(见图1B，C2-4)；当有小分子Pik1时，含有Ca2+的NCS-1与Pik1结合，导致Pik1形状改变，促进脂质激酶LKU与Pik1的催化部分相互作用(图1B)；当缺乏配体时，蛋白C末端L3在疏水口袋内充当临时配体(见图1C3)，维持蛋白结构稳定。另外，加入Ca2+后，NCS-1蛋白的N-端肉豆蔻酰促进复合体靠近膜，在膜处使NCS-1/Pik1复合体与底物(Ptdins)结合并提高磷脂酰肌醇-激酶(Ptdins 4-P)活性。 2.1.2 NCS-1调控分泌的生理机制理论模型磷脂酰肌醇4羟激酶β能够调控酵母和哺乳动物细胞体内的从高尔基体到质膜的物质运输[15-17]，也能调控PC12细胞和胰腺ß细胞的分泌[18-19]。根据前人的研究，对NCS-1与磷脂酰肌醇4羟激酶β在不同等级生物体内，不同位置调控分泌的生理机制模型进行了归纳和分类，下面分别进行阐述，见表1。"

NCS-1在内耳调控运输和分泌的机制模型：Petko等[20]提出了斑马鱼内耳信号传导的途径并提出一个模型见图2[20]。NCS-1和ARF1能激活磷脂酰肌醇4羟激酶β，但NCS-1和ARF1直接相互作用能抑制磷脂酰肌醇4羟激酶β的酶活性[21-22]，NCS-1和ARF1对磷脂酰肌醇4羟激酶β双向的激活/抑制可能参与了个体内耳的发育过程[20]。DAN、骨形态发生蛋白4和透明质酸是分泌分子，在半规管形成中起到重要的作用[23-27]，可能通过NCS-1/ ARF1/磷脂酰肌醇4羟激酶β这个路径调控其分泌[20]。如图2所示，在内耳中，NCS-1、ARF1和磷脂酰肌醇4羟激酶β形成了一个小的相互作用网络，这3种蛋白形成半规管调控靶蛋白分子DAN和透明质酸分泌(HAS)，共分成两条途径调控分泌，一条是DAN通过顶端质膜参与骨形态发生蛋白4的分泌，另一条HAS通过基底外侧质膜调控透明质酸的分泌。 NCS-1在高糖刺激下调控分泌的机制模型：NCS-1和磷脂酰肌醇4羟激酶在胰腺ß细胞中给予糖刺激后能够调控分泌[15]。如图3所示，高糖能够提高ATP/ADP的比率，而提高的ATP/ADP会导致膜去极化，促使细胞质中的Ca2+浓度提高；而提高的ATP/ADP和Ca2+浓度能够刺激磷脂酰肌醇4羟激酶β的活性，分别通过磷脂酰肌醇4羟激酶β和磷脂酰肌醇4羟激酶 5-激酶形成PI(4)P和PI(4,5)P2，这两者能够加强Ca2+依赖激活蛋白的分泌(CAPS)，从而增强胰岛素分泌。 NCS-1调控质膜或突触囊泡分泌的机制模型：NCS-1蛋白在PC12细胞中有广泛的分布，部分分布在细胞质中，部分在囊泡和管状结构中。形态学和生化结果表明，NCS-1可能除了与突触样小囊泡有关外，还与质膜有关[28]。这种分布可能跟NCS-1蛋白在质膜通道和受体的功能有关[29]，尤其是与门控Ca2+通道有关[30-32]；NCS-1可能在质膜和囊泡膜的新陈代谢和磷酸肌醇(InsP3)中起到重要的作用[28]。磷脂家族在质膜中参与信号转导和囊泡形成、分泌面高尔基体网络和核内体[33]。在酵母中，NCS-1的同源体以复合体形式存在，并激活磷脂酰肌醇4羟激酶(PtdIns4K)[19]，而且在真核细胞中NCS-1与PtdIns4K直接相互作用[34]。在脊椎动物的PC12细胞中，NCS-1在不影响PtdIns的情况下，明显提高了PtdIns(4)P 和PtdIns(4，5)P2的水平，促进Ins(1，4，5)P3的增多，从而与G蛋白偶联受体(GPCRs)的兴奋剂UTP进行反应。NCS-1可能促进质膜或其他细胞器中PtdIns4K的激活和更新，提高PtdIns的新陈代谢和合成，增加信号分子肌醇1，4，5，-三磷酸(Ins(1，4，5)P3)，通过肌醇1，4，5，-三磷酸受体(InsP3R)增加影响细胞内Ca2+信号和胞外分泌。图4A所示，NCS-1结合到位于质膜或突触囊泡的PtdIns4K，并增加其活性，这就提高PtdIns(4)P和PtdIns(4，5)P2(PIP2)在局部位置的水平，其充当了磷脂酶C的底物，导致肌醇三磷酸Ins(1，4，5)P3(IP3)和二脂酰甘油的增加；通过Ins(1，4，5)P3受体和CCE，增加的Ins(1，4，5)P3(IP3)会诱发Ca2+的反应，从而加强分泌反应。但NCS-1和PtdIns4K相互作用的动力学机制尚不完全清楚[28]，需要从更微观的角度深入研究。图4B对哺乳动物的中枢神经系统突触后的Frq调节长时程抑制和长时程增强的机制进行了研究[35]，并提出模型。图4B左图中，当亲代谢性谷氨酸盐受体(mGluR)激活后，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)充当了磷脂酶C的底物，引起肌醇三磷酸Ins(1,4,5)P3(IP3)和二脂酰甘油的增加，导致内质网(ER)释放Ca2+。Frq和蛋白激酶C相互作用蛋白1(PICK1)与从内部钙离子储存器ER中释放出来的Ca2+结合，Frq可能与PICK1形成复合物和蛋白激酶(PKC)，这就引起α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)的磷酸化和内化，导致长时程抑制[36]；图4B右图中，Frq结合Ca2+后，结合到G偶联蛋白受体激酶2(GRK2)，抑制多巴胺D2受体(D2R)的磷酸化，提高D2R的表面表达，导致长时程增强[37]。另外，NCS-1作为神经传递的中介，对Cavs和分泌进行双重调节。图5A中，实线描述了NCS-1对分泌和Cavs通道的影响。其中，带加号的箭头表明活性提高；带减号的箭头表明活性降低。NCS-1通过磷脂酰肌醇4羟激酶Ⅲß的活性和PIP2水平的提高能够加强分泌，导致调节内部Ca2+储备释放的IP3提高。Ca2+水平的提高将会提高囊泡的运动，从而促使囊泡与质膜融合；另外，质膜中的PIP2本身也能够促进囊泡的融合和运动，PIP2还具有稳定Cavs通道(N-type)的功能，并通过NCS-1提高磷脂酰肌醇4羟激酶Ⅲß的活性和PIP2水平而加强这一功能。NCS-1能够通过嘌呤GPCR抑制通路的信号，从而抑制Cavs(P/Q-type)。数据表明，PTX敏感的G蛋白和Src样激酶也参与到NCS-1抑制P/Q-type Cavs过程中，但NCS-1抑制P/Q-type Cavs的具体机制还不清楚[38]。图5B显示了Frq调节突触囊泡和致密中心囊泡分泌的机制模型。图5B(1)中，Frq结合Ca2+直接或者通过Ca2+依赖激活蛋白(CAPS)调控Ca2+信号，从而调控突触囊泡的分泌[31-32，39]。图5B(2)中Frq结合Ca2+并激活磷脂酰肌醇4羟激酶ß，从而加强磷脂酰肌醇4磷酸盐(PIP)和磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)水平[4，21-22，28，40-44]。磷酸肌醇(PIP和PIP2)水平提高，能够促进致密中心囊泡的分泌。 2.1.3 NCS-1调控多巴胺D2受体的生理机制模型多巴胺是哺乳动物脑内其中一种重要的神经递质。研究显示，多巴胺释放引起的神经反应在很多生理功能中起到作用，包括动作控制、情绪、认知、神经内分泌的控制、参与奖赏活动等。为了执行对多巴胺释放的各种反应，脑内有4条主要的多巴胺能通路：中脑缘通路，中脑皮质通路，黑质纹状体通路，结状漏斗形通路[45]。由多巴胺神经递质产生的多种功能不仅依赖于4条主要的神经通路，而且在这些通路内，不同的信号由不同的多巴胺受体传输。到目前为止，5个已知的多巴胺受体(DR)亚型有D1、D2、D3、D4和D5。5个受体亚型是7次横跨细胞膜的G蛋白偶联受体(GPCRs)，分为两个多巴胺受体家族，D1家族样受体包括D1和D5两个亚型，D2家族样受体包括D2、D3及D4[46]。其中多巴胺D2受体包含415个氨基酸，由8个外显子与7个内含子组成，属于G蛋白偶联受体家族，其肽链7次跨越细胞膜，N端在胞外，C端在胞内。多巴胺D2受体通过细胞质内C端尾部16个氨基酸与NCS-1结合，可能影响多巴胺D2受体内化，并控制多巴胺D2受体表面表达[47]。如图6A所示，多巴胺通过D2R发挥作用，受到G蛋白Gi的抑制从而引起腺苷酸环化酶的抑制；D2R通过G蛋白偶联受体激酶进行磷酸化，磷酸化了的D2R在核内体里(endosome)通过细胞的内吞作用而内化，进行脱敏。在这一过程中，NCS-1的作用见图6B，含有Ca2+的NCS-1通过与D2R受体C端尾部和G蛋白偶联受体激酶结合，抑制D2R受体的磷酸化，导致D2R非但没有内在化反而保持在细胞表面；而NCS-1/D2R相互作用的抑制允许D2R受体脱敏[48]。图7更清晰地显示出NCS-1与D2R受体相互作用的生理机制。多巴胺释放通过D2R受体发挥作用，D2R通过G蛋白偶联受体激酶2进行磷酸化，从而导致D2R内在化，刺激腺苷酸环化酶的活性，使基因表达调控物质AMP不断生成腺苷-3’，5’-环化一磷酸cAMP(见图7A)；当NCS-1通过G蛋白偶联受体激酶2抑制D2R的磷酸化，D2R继续传导信号，但抑制腺苷酸环化酶的活性(见图7B)。当D2R受到G蛋白Gi的抑制引起腺苷酸环化酶抑制的情况下，即使NCS-1单体结合到D2R上，Ca2+储存器也不受D2R活动的影响(见图8A)；当D2R通过Gi抑制腺苷酸环化酶的活性时，内质网的Ca2+储存器释放Ca2+，引起细胞内Ca2+水平提高会促进NCS-1二聚体结合到D2R上(见图8B)；当细胞内Ca2+水平下降到NCS-1二聚体形成的阈值以下，G蛋白偶联受体激酶2使D2R磷酸化，从而使激活的D2R内在化(见图8C)。 NCS-1与多巴胺D2受体相互作用调节突触可塑性和记忆的机制模型见图9。NCS-1通过抑制G蛋白偶联受体激酶G蛋白偶联受体激酶2(G2)，导致D2R磷酸化，提高了D2R在膜表面的表达，阻止D2R内在化。在电刺激或者行为刺激下，D2R导致更高的Ca2+反应，可能是提高记忆形成的机制[50](见图9A)。NCS-1调控D2R表面表达，这一过程受到D2R/NCS-1相互作用肽DNIP的阻碍；D2R的活性是突触可塑性加强所必需的，这一过程受到L-741-626的阻碍；G蛋白ß和Y信号也能加强突触可塑性，这一过程受到焦口酚酞(Gallein)的阻碍(见图9B)。 NCS-1与D2R在齿状回调控好奇和多种记忆的生理机制模型[37]，见图10。来自感觉中枢(sensorium)的多种信息都在内嗅皮质(EC)加以整合和投射到齿状回(DG)中，NCS-1降低了LTP的感应阈值，加强了内嗅皮质-齿状回的LTP，促进快速获取和空间记忆；单形式信息可能通过內嗅皮质直接投射到海马(CA)CA1和CA3中；负责探索和好奇行为在齿状回出现，以及通过內嗅皮质和/或海马三突触回路(CA3-CA1-Sub)投射到伏隔核(NA)；在NA和腹侧被盖区(VTA)之间的双向信号传送导致饲养行为(rearing)。而饲养行为反过来会导致更丰富的感觉，这可能是一个正反馈通路；由恐惧驱使的饲养行为在杏仁核(A)中出现，在图10模型中这一行为未与其他脑区发生联系。 2.1.4 肝细胞内NCS-1与腺苷A2A受体作用的生理机制模型腺苷A2A受体可以与钙调蛋白和NCS-1相互作用[51]。发光供体氧化底质腔肠素H发出荧光，当供体和受体之间的距离约为4.4 nm时，其可以转为荧光受体(YFP)[52]。图11中比较了人胚肾HEK193T细胞共表达A2A融合到海肾萤光素酶(Rluc)和CaM中，NCS-1融合到YFP中(A-C)。当CaM-YFP表达增加时，CaM和A2A有特定的相互作用(见图11A)；当A2A-Rluc数量一定，NCS-1-YFP共表达数量的增加时，NCS-1与A2A有特定的相互作用(见图11B)；在Ca2+依赖模式下，NCS-1与A2A二聚体相互作用，并调控腺苷A2A受体的信号(见图11C)。 2.1.5 NCS-1调控不同刺激下心肌细胞质和细胞核Ca2+的生理机制模型 Nakao等[53]对NCS-1调控不同刺激下心肌细胞质和细胞核Ca2+的生理机制模型进行了推测(见图12)。在电刺激下，通过Ca2+诱导的Ca2+释放RyR依赖机制，细胞质的Ca2+从肌质网(SR)释放出来，细胞质Ca2+([Ca2+]Cyt)不断扩散到细胞核中，细胞核Ca2+([Ca2+]Nuc)增加。增加的细胞质Ca2+导致肌肉收缩，细胞核可能不断缓冲细胞质内不断增加的Ca2+(见图12A)；另外，受体刺激可能通过IP3R与NCS-1相互作用，优先增加细胞核Ca2+；受体刺激诱导增加细胞质内的Ca2+可能加强基因转录，导致心肌肥大(见图12B)。而NCS-1在受体刺激调控细胞质内的Ca2+中与IP3R相互作用而起到重要的作用。根据实验研究结果提出蛋白可能的生理机制模型，对深入理解蛋白功能的发挥有很好的启发作用和参考价值，但在现有实验条件下，这些生理机制模型虽已提出，但尚无法进行更为深入的研究，更无从得以验证和确认，导致研究暂时无法继续向纵深方向推进。 2.2 NCS-1生理机制的结构特征结构决定功能，NCS-1生理功能的正常发挥依赖于结构的完整性和稳定性。对蛋白结构变化引起生理功能改变的观察，实验上多利用荧光技术、核磁共振和化学位移等方法和手段，得出一定的结果和结论，而且通过分子动力学模拟的方法，对实验结果和结论作进一步的深入研究和探讨，不仅对目前存在的矛盾和争论有一定的解释，而且还给出了蛋白结构中更加微观的机制变化，为实验研究提供新的视角和启示。 2.2.1 NCS-1R102Q突变导致结构的变化引起生理功能改变在自闭症患者基因测序中识别出组成NCS-1 190个氨基酸中，第102个氨基酸精氨酸ARG102突变成谷氨酰胺Glu102(R102Q)[54]。R102Q突变对蛋白结构既有远距离的影响，也有局部的改变，尤其是螺旋H6、H9和C端尾部L3，但R102Q突变引起结构改变有两种冲突的机制解释。一项核磁共振实验研究表明，R102Q突变影响NCS-1蛋白的结构，尤其提高了C端尾部构象交换的范围[55]；但另一项高分辨率核磁共振结构和化学位移测量研究表明，R102Q突变降低了C端尾部L3的活动[1]。对R102Q突变和C端尾部活动的描述通常能够反映蛋白的基本特性[56-57]。为从原子-分子层面，对NCS-1R102Q突变导致蛋白结构的变化有更微观的解释，有研究采用分子动力学的方法，发现R102Q突变导致某些盐桥的改变[8，58-59](见图13)，对蛋白结构柔性的改变和L3在疏水口袋中的位置起到重要的作用，该研究结果与实验上观察到的R102Q突变降低了C端尾部L3的活动结果一致[1]，可能会阻碍人类NCS-1蛋白与其配体的结合，影响其功能的发挥；并从蛋白结构的视角，为与R102Q突变有关的自闭症疾病提供原子水平的解释，为实验研究提供参考和启示。 2.2.2 C端尾部对NCS-1蛋白生理功能发挥的影响NCS-1通过疏水口袋中的结合位点与配体结合，发挥其功能。在NCS-1复合体中，疏水口袋中的结合位点被Pik1片段和聚乙二醇分子占据[10，60-62]，对蛋白结构起到稳定作用[1]；当缺乏配体的时候，C端尾部L3充当配体直接与疏水口袋中的位点结合，维持蛋白结构稳定[1]；当配体到达疏水口袋时，L3会让出疏水口袋，使其与配体结合[1，8，63]。NCS-1能够调节多巴胺D2/D3受体[64]，D2受体的C端能结合到NCS-1的疏水口袋中[47，65]，而且NCS-1的C端尾部对D2受体的结合具有重要的作用[47]。实验结果显示，去掉L3会导致NCS-1整体结构不稳定[1]，但在原子层面上，C端尾部对NCS-1构象影响的详细机制还不清楚。作者采用分子动力学模拟的方法，首次对人类野生型和截去C端尾部L3突变体NCS-1在水溶液的结构特征进行分析，结果显示，截去L3，NCS-1蛋白保持了二级结构，但提高了C段和远端N段的结构柔性，验证了实验结果；并且观察到截去L3削弱了N段和C段氨基酸之间的联系(见图14)；破坏了蛋白盐桥网络，导致蛋白整个结构和疏水口袋同时膨胀[66]。分子动力学模拟从微观的视角表明，L3对NCS-1构象动力学起到重要的作用，截去L3引起结构的变化可能会影响与配体的相互作用，进而影响其生理功能的发挥。 2.2.3 温度升高影响NCS-1生理功能发挥 NCS-1是调控动物对温度变化做出相应反应的重要因素之一。温度对人类机体影响的分子机制还不完全清楚，但国内外学者对线虫的趋温性做了较多的研究[67]。某些温度感受器对微小的温度波动(<0.01 ℃)很敏感，这些感受器通过适应，对大幅度室温变化保持一定的敏感性。在AFD神经元中，鸟苷酸环化酶受体(GCY-8)、磷酸二酯酶(PDE-2)和NCS-1调控线虫的趋温性[68]。在径向温度梯度中，线虫沿着等温线，朝培养温度移动，线虫的这种学习和记忆是NCS-1通过Ca2+信号调整的[69-70]。最近，调控线虫温度依赖性运动的关键因素被识别出来。研究表明，线虫运动的改变是由NCS-1引起的，尤其是完全暴露于水的疏水口袋的完整性起到重要的作用[71]，但其详细细节和微观机制尚不清楚。线虫和人类NCS-1的氨基酸序列相似性为75.4%，但温度改变是否影响人类NCS-1的结构尚不清楚。假设温度升高会影响人蛋白C端尾部L3在疏水口袋的位置，采用分子动力学模拟的方法，比较人类NCS-1在正常体温和极限体温下的构象变化，确定温度变化是否影响C端尾部L3在疏水口袋中的位置[72]。结果表明，人类NCS-1对溶液温度非常敏感。温度升高，L3从蜷缩状态转为伸展状态，更多地占据疏水口袋，可能会遮挡住疏水口袋内的结合位点，阻碍其与配体结合，影响蛋白功能的正常发挥。其中，氨基酸之间的联系及其路径改变是引起蛋白构象变化的主要原因(见图15)。从原子-分子层面，一方面验证了实验上观察到的结果，另一方面从更微观的视角提出实验上观察到现象的关键性因素，深刻揭示了温度变化对人类NCS-1关键结构的影响，为实验研究提供新的视角和启示。"

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