Bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in the treatment of diabetic cystopathy

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.024

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation has gained considerable support recently. It provides new opportunities for treating diabetic neurogenic bladder.
OBJECTIVE: To summarize the research progress in bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation in the treatment of diabetic neurogenic bladder.
METHODS: The first author retrieved Sciencedirect, PubMed, Embase, Wangfang and CNKI databases, for relevant articles of BMSCs transplantation in the treatment of diabetic neurogenic bladder, published from 2000 to 2016. The key words were “bone marrow mesenchymal stem cells, diabetic neurogenic bladder, differentiation, transplantation” in Chinese and English, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: In patients with diabetic neurogenic bladder, the transplantation of BMSCs may provide safer and longer-lasting outcomes by repairing the damaged bladder and urethra. And it can produce various bioactive substances, which will have nutritional paracrine effects on the bladder microenvironment, including anti-inflammation, promoting cell proliferation and improving cell survival. On the one hand, the BMSCs have the ability to migrate to the injury site via the blood circulation. On the other hand, BMSCs can produce various growth factors, as well as the cytokines that can inhibit the inflammatory response. While the current clinical studies are lacking, its efficacy and safety needs further verification.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Diabetes Mellitus, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Yang Ya-fei, Yang Jin, Chen Lin, Xing Sha-sha, Hu Hai-feng, Zhang Ya-mei, Wang Zi-li. Bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in the treatment of diabetic cystopathy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 802-808.

Figures/Tables 1

2.1 BMSCs及糖尿病神经源性膀胱的概述 BMSCs是从骨髓组织中衍生出的一类多能间充质干细胞，起源于中胚层，但具有跨系和跨胚层分化的能力[1]。适当诱导条件下，BMSCs不仅可分化为向包括造血支持细胞、成骨细胞、骨骼肌在内的等中胚层细胞，同时可不受局限向外胚层的心肌细胞、血管内皮细胞等分化[2]。正因为其可塑性，因此，研究者通常将BMSCs作为再生医学的基础手段之一。作为较原始的细胞，BMSCs的免疫原性较弱，与其他来源的间充质干细胞相比，具有免疫排斥反应少、培育周期短、易于扩增和保存等特点。但不足之处在于，目前尚无可特异识别BMSCs的表面标记物，目前鉴定主要与造血干细胞比较，以及通过形态结构功能特性而确定，大部分的间充质干细胞或类间充质干细胞样细胞的表达表面标志物包括CD44和CD71、CD73、CD90，CD105、STRO-1，不表达造血系细胞标记性抗原如CD34、CD45等[3]。Imamura等[4]研究可证明，BMSCs能重建受损的膀胱平滑肌肌层机构，治疗膀胱功能障碍。同时，间充质干细胞能够分泌不同种类的细胞因子，具有免疫调节，保护细胞，促进细胞存活等作用[5]。由于其具有的多潜能分化能力，并且增殖同时保持未分化状态和旁分泌作用[6]，BMSCs被认为是组织工程领域的重要种子细胞材料来源之一。有数据表明，80%以上的中老年糖尿病患者可罹患糖尿病神经源性膀胱，发病率高于糖尿病神经病变及糖尿病肾病[7]。即使是长期口服降糖药的患者，也不能阻止糖尿病相关慢性并发症的出现[8]。传统意义上来说，糖尿病神经源性膀胱主要是由于糖尿病患者的自主神经病变引起，患者会出现包括膀胱过度活动症、排尿困难及尿潴留等为主要表现的下尿路症状[9]。在早期代偿阶段，糖尿病神经源性膀胱的病理组织改变主要集中于高血糖所致的周围神经病变，表现为代谢紊乱、神经细胞变形、胆碱活性降低等。随着研究的深入，相关研究表明，后期糖尿病神经源性膀胱收缩乏力可能与逼尿肌细胞凋亡及收缩相关分子不足等肌源性改变有关[10]。值得一提的是，糖尿病神经源性膀胱患者临床表现常因患者个体差异及病程时间长短而不同，此外，常见的伴发疾病，如良性前列腺增生、压力性尿失禁和尿路感染常可能掩盖糖尿病神经源性膀胱。据报道，糖尿病神经源性膀胱可发生在糖尿病早期[11]，由糖尿病引起的典型膀胱功能障碍仅在仔细询问患者病史或尿流动力学测试中发现。目前为止，临床上对于糖尿病神经源性膀胱的治疗仍以对症处理，以保护肾脏功能为主，如间歇性清洁导尿，辅助以药物治疗。近年来，国内外学者在神经源性膀胱尿道功能障碍的治疗方面也有很多进展，相关学者仍在不断探索及开展新技术，如A型肉毒毒素膀胱壁注射或膀胱起搏器植入也取得了一定效果，但以上方法都是挽救性治疗，不能从根本上解决问题。 2.2 BMSCs治疗糖尿病神经性膀胱的机制膀胱主要功能为贮尿和排尿，糖尿病神经源性膀胱患者整个病理过程中常不仅仅表现为单一储尿或排尿功能障碍问题，代偿及失代偿阶段均会影响到膀胱和尿道括约肌之间的准确协调。尿道平滑肌是由交感、副交感神经支配，发生糖尿病神经系统病变时，势必导致尿道括约肌收缩或松弛功能损害。另外，膀胱逼尿肌自身的肌源性功能异常也是发病机制之一，其病理改变表现为逼尿肌形态、功能改变和能量代谢异常等[12]。近年来，随着对干细胞有关特性的研究不断深入，干细胞移植在治疗糖尿病神经源性膀胱已取得进展，被认为是有望促进受损泌尿系统功能恢复的手段之一。研究发现，移植的细胞不仅可替代变形或退化的细胞，也可释放相应的生长因子促进其存活及生长。移植的细胞类型包括：尿源性干细胞、BMSCs、胚胎干细胞、脂肪源性干细胞等[13]。而BMSCs因易于分离和获取，技术要求相对低，体外扩增数倍后仍能保持其分化能力，具有自我复制和定向分化的能力，所以研究最为广泛。BMSCs治疗机制可概括为迁移、分化及旁分泌作用。 2.2.1 BMSCs迁移及其归巢机制一系列研究表明，系统移植间充质干细胞后，能迁移至受损或患病组织，从而获得临床受益[14-15]，在脑缺血、肺损伤和心肌梗死等已得到验证[16]。BMSCs的迁移和归巢是由复杂的分子机制所调控，包括趋化因子、旁分泌因子、细胞膜受体、细胞内信号转导分子等。趋化因子：早在2004年，已有学者研究发现，BMSCs迁移与受损组织释放的细胞因子有关，可感受相应刺激后表现为对受伤组织强烈的趋向，从本身所处的骨髓微环境迁移至血液循环中，再转移到特异性受损组织的位点。与此同时，内源性BMSCs在炎症后受伤时被激活动员，在血液循环的数量会增加，并通过相应激活机制直接指向特定组织。BMSCs指向和植入受损组织的位点这一过程，需要能够感受远处受损组织释放的信号分子。实验证实，许多趋化因子受体与BMSCs归巢至患病区域密切相关，BMSCs自身表达了一系列趋化因子受体，如CXCR4、CXCR5、CXCR7和CCR1、CCR7、CCR9等[17]，此外可感应一系列趋化因子，从而迁移，如CXCL-12[18]、CXCL-16[19]和CCL15等[20]。另外，BMSCs可表达与生长激素受体、TOLL样受体(TLR)、黏附因子移动有关的细胞表面标志物和受体[21]，可诱导BMSCs移动。Wang等[22]研究发现激活素B是转化生长因子β超家族成员，能参与调控多种细胞生物学活性，包括细胞的增殖、分化和凋亡，其中激活素能够B介导BMSCs通过RhoA/Rho激酶信号转导通路参与转化生长因子β介导的定向迁移。旁分泌因子：当有新生的结缔组织时，比如在伤口愈合或瘢痕形成，通过结缔组织介导的信号传导BMSCs迁移移植，有助于组织的再生。恶性肿瘤细胞也会促使结缔组织的形成，来促进肿瘤的生长和发展。Dwyer等[23]曾尝试整合BMSCs能够归巢及躲避宿主免疫原性的特性，来作为基因治疗的系统转运工具。实验证实原发性乳腺癌释放的单核细胞趋化蛋白1能刺激BMSCs迁移至肿瘤靶点，发挥靶向治疗作用。Fontanella等[24]在骨肉瘤和肝癌细胞同BMSCs共培养模型中发现，BMSCs能通过促进上调CXCR4的表达参与到肿瘤细胞的远处转移过程，加入CXCR4拮抗剂后，激活AKT/ERK信号通路，抑制BMSCs与肿瘤细胞的交互作用，从而抑制细胞增殖、转移，以及对肿瘤细胞增殖和转移有关键作用的转录调节基因的表达。细胞膜受体：细胞膜受体是细胞表面的一种或一类分子，能识别、结合专一的生物活性物质，生成的复合物能激活和启动一系列物理化学变化，从而导致该物质的最终生物效应。其中以激素受体在介导BMSCs转移方面研究较多。Gallo等[25]将加入唑来膦酸后的BMSCs与未经处理过的BMSCs与雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞共培养后，发现处理组能够通过显著抑制AKT/MAPK通路，减弱BMSCs转移能力。Luo等[26]研究胰岛素样生长因子基因选择性剪切后产生的一种剪切变异体，称为力生长因子后，发现力生长因子对大鼠BMSCs的增殖作用没有明显影响，但能够通过上调大鼠BMSCs的CXCR4水平，激活SDF-1/CXCR4-ERK1/2信号通路，改变其机械性能来诱导其发生迁移。细胞内信号转导分子：细胞信号转导是指细胞通过胞膜或胞内受体感受信息分子的刺激，经细胞内信号转导系统转换，影响细胞生物学功能的过程，主要包括膜受体或胞内受体介导的信号转导途径。其中成纤维细胞活化蛋白是一种细胞表面膜丝氨酸肽酶，属于II型丝氨酸蛋白酶家族，在胚胎发育过程中就能表达在组织重建位点。Chung等[27]发现在共培养模型中，成纤维细胞活化蛋白表达水平下降后，BMSCs迁移受损，加用RhoA选择性抑制剂后迁移能力恢复。提示成纤维细胞活化蛋白可能通过抑制细胞内RhoA相关GTP酶促进BMSCs迁移。同样，Ryan等[28]研究发现BMSCs中的MCP-1能将信号转导至G蛋白偶联受体，激活PI3K/Akt、PAK和ERK信号通路，促进BMSCs发生迁移。这一机制的揭示有助于更好地研究BMSCs的归巢和定向迁移特性。 2.2.2 分化在很大程度上，BMSCs的治疗潜力来自于其分化能力，这一特性被广泛运用于细胞治疗及基因治疗中。国内外关于BMSCs具有多向分化潜能的特性已有相关报道。闫磊等[29]研究发现体外联合应用GLP-l、Extentin-4、尼克酰胺等细胞因子采用三阶段诱导方案，可显著提高胰岛素细胞诱导分化率并能促进胰岛素细胞的成熟和胰岛素的释放。将体外分离培养的BMSCs经尾静脉注射后，其在糖尿病模型大鼠体内可迁移至胰腺组织中并具有分化为胰岛素分泌细胞的可能性。Estrada等[30]利用自体骨髓干细胞可分化为胰岛素样细胞，改善胰岛功能的特点，联合高压氧治疗25例2型糖尿病，经1年随访观察到胰岛功能得到改善且减少了外源性胰岛素用量。因此，来自于骨髓的间充质干细胞具有分化为胰岛素样细胞并替代胰岛β细胞降低血糖，减少并发症发生的潜力。在糖尿病所致泌尿系统并发症中，同样有研究证明，采用BMSCs能够改善膀胱病情严重程度，有望能够控制病情变化甚至恢复部分膀胱功能。实验发现，从骨髓中分离的间质干细胞，通过加入平滑肌条件培养基可诱导分化成平滑肌细胞，在体外可传代生长，表达平滑肌特异性蛋白标志物α-肌动蛋白、肌钙结合蛋白和平滑肌肌球蛋白[31]。另外，Hirota等[32]将BMSCs经体外诱导分化为有收缩功能的平滑肌细胞，用5羟色胺增强BMSCs向平滑肌细胞分化的潜能，为治疗糖尿病神经源性膀胱提供了可能性。陈亮等[33]采用体外非接触式共培养模型，将BMSCs接种在尿路上皮细胞培养液，同时添加表皮生长因子，成功诱导出典型“铺路石”样结构并表达特异性标志物角蛋白AE1/AE3的尿路上皮细胞。另外，几项相关研究已经表明，从胚胎、骨髓、脂肪组织等分离出的间充质干细胞可分化成膀胱平滑肌细胞，同时脂肪干细胞和BMSCs可分化成泌尿道上皮细胞[34-35]。迄今为止，将干细胞成功分化成平滑肌运用于修复和再生膀胱功能已有相关研究[36]。体外分化是利用组织工程重建的重要一步，平滑肌再生主要是通过旁分泌因子或注射干细胞直接分化成新的平滑肌组织。另外，细胞表面受体、配体及已分化和未分化细胞之间短程作用分子的相互作用，对于细胞分化也有显著作用[37]。在影响BMSCs分化能力的信号转导及分子机制上，研究也在取得不断突破，Aikawa等[38]在2015年时证明了高迁移率族蛋白1 能激活血小板衍生生长因子受体α阳性的BMSCs进入血液循环并积聚在SDF-1α阳性的炎性组织中。这些数据说明在病理条件下，慢性炎症刺激改变了BMSCs的特性，如自我更新或定向分化的能力。而Aikawa及其团队最新研究发现同链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型相比，敲除掉晚期糖基化终末产物受体的大鼠模型，其BMSCs数量有所上调，显著转录因子Nanog 和Oct-4的表达增加，加强了BMSCs的全能性和分化能力的调控维持[39]，这提示晚期糖基化终末产物受体通过激活MAPK/NFκB信号通路抑制BMSCs的分化。 2.2.3 旁分泌作用传统观点认为，BMCSs在受损膀胱微环境内定向分化为功能性平滑肌细胞是其发挥修复作用主要机制。随着对BMCSs修复机制研究的深入，发现BMSCs可分泌多种对组织修复有益的生物活性因子[40]，包括肝生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子等。旁分泌作用包括通过移植BMSCs直接旁分泌释放细胞因子和生长因子或通过刺激邻近细胞间接释放[41]。Jo等[42]将受损的嗅觉神经上皮细胞移植BMSCs后，观察到除嗅神经标记蛋白增加外，神经生长因子和脑源性神经营养因子也是高表达。Shichinohe等[43]构建了小鼠脑缺血模型后，将神经元与BMSCs共培养后，用荧光原位杂交技术检测到神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达。这些生物活性因子不仅改善神经元受损症状，并且对脑组织有一定的保护作用。而在糖尿病干细胞移植治疗中，Yoshimatsu 等[44]将小鼠胰岛同BMSCs共培养后分析其形态学改变、基因表达及胰岛素分泌功能，发现尽管小鼠血糖水平没有显著下降，但BMSCs分泌的血管内皮生长因子可促进新生血管形成，达到抗炎和减缓糖尿病及其并发症进程的效应。Cantinieaux 等[45]在脊髓损伤模型中证实，在体外培养BMSCs的条件培养基能调节中枢系统微环境，促进神经轴突细胞再生和功能恢复，激活巨噬细胞，促进血管生成。在体内模型，通过注射BMSCs能促进运动恢复，达到组织保护作用。据此推断，移植后短期膀胱功能受益可能是BMSCs促进了内生性修复过程，通过抗凋亡、抗炎和促进增殖和存活等效应改善器官功能，而不是仅仅依靠平滑肌细胞的再生，旁分泌作用则可能是其修复作用的基础[46]。在神经源性膀胱模型中，有研究通过荟萃分析发现，通过静脉注射BMSCs能够改善下尿路功能，尿动力指标如最大排尿压，非有效排尿收缩及残余尿量均有不同程度改善，进一步证实BMSCs在组织修复及功能重建的有效性。在近几年研究中，干细胞生物学研究已将注意力集中在干细胞的旁分泌、自分泌和生长因子的作用。BMCSs分泌的外泌体作为一种直径为30-100 nm的分泌到胞外的亚细胞双层膜囊泡，不包含其细胞来源的DNA片段，但含有母细胞相似蛋白质、RNA、脂质等细胞活性物质，在细胞间信息交换、传递生物活性成分及促进血管新生发挥着重要作用[47]。有研究发现，应用BMSCs来源的外泌体治疗糖尿病相关并发症，可达到接近直接移植BMSCs相类似的效果，提示外泌体可能是治疗受损组织的主要治疗因素，将母细胞来源生物活性物质如细胞因子和生长因子传递给受损细胞[48]。 BMCSs的分泌机制包括局部系统炎症反应及局部组织再生的刺激。间充质干细胞自身无法直接或完全替代受损组织，但它们可分泌生长因子或细胞因子，有助于减少纤维化[49]。它们在受损器官减少纤维化过程中发挥主要作用，这意味着旁分泌作用在受损器官的恢复中通过减少纤维化而不是细胞重组发挥更关键作用[50]。例如由间充质干细胞分泌的肝生长因子，在促进新生血管生成、组织重建中起着重要作用，并作为有效的抗纤维化剂存在[51]。除了抗纤维化机制，BMSCs可为局部缺血组织提供抗氧化的化学物质、自由基清除剂和热休克蛋白[52]。BMSCs具有抗凋亡防御和抗瘢痕化作用及促新生血管形成的影响。间充质干细胞有全身和局部免疫调节性能，包括T细胞和B细胞增殖的抑制[53]。干细胞也可通过在受损组织中分泌细胞因子和趋化因子，激活内源性干细胞和祖细胞。 2.3 BMSCs在糖尿病神经性膀胱治疗中的作用糖尿病神经性膀胱是糖尿病引起的常见泌尿系统并发症，病理基础是糖尿病膀胱、尿道交感通路异常，膀胱、尿道组织中神经生长因子、神经生长因子受体(p75NTR)的表达降低，尿道组织中α1肾上腺素受体兴奋性增强，造成尿道收缩或松弛功能受损，出现尿潴留、尿失禁及尿意消失且有不同程度的尿路感染及肾功能衰竭。 BMSCs移植可修复受损组织、抑制炎症反应及对免疫系统的调制作用，使其应用于治疗多种疾病，其治疗糖尿病神经源性膀胱的有效性在动物模型和随机对照临床试验中已被充分证明。Zhu等[54]将转染了神经生长因子的BMSCs通过膀胱壁注入糖尿病神经源性膀胱模型大鼠，BMSCs能够长期存活并稳定表达神经生长因子，改善膀胱微环境，分泌营养因子，继而改善膀胱功能。在糖尿病神经源性膀胱出现膀胱功能障碍时，移植的BMSCs通过增殖和分化为平滑肌细胞修复膀胱及尿道功能，同时可合成多种生长因子，对膀胱内局部微环境产生营养性旁分泌作用，包括抗炎、促进增殖和存活等，有效治疗糖尿病神经源性膀胱。一方面，BMSCs凭借向损伤部位趋化的能力，通过血液循环迁移到受损部位参与修复；另一方面，BMSCs合成多种生长因子及具有可抑制炎性应答的细胞因子。Nishijima等[55]通过实验证实，依靠移植BMSCs分化成平滑肌样细胞可改善膀胱收缩功能。另外，BMSCs和各种生物支架相结合，可用于膀胱组织工程材料，如Yudintceva等[56]在膀胱部分切除后的兔模型中，将外源性BMSCs种植到丝纤维蛋白人工合成支架，研究发现这种生物支架具有良好的机械性能，能作为膀胱失代偿后的合理替代物，使膀胱组织再生和功能重建成为可能。Sharma等[57]将转染绿色荧光蛋白的BMSCs复合小肠黏膜下层脱细胞基质的支架，用于行40%-50%膀胱切除术后猿膀胱的修复重建，以模拟灵长类动物膀胱扩大成形术。术后10周免疫荧光提示移植物修复区内BMSCs大部分存活并处于明显增殖状态，免疫组织化学可见明显的新生血管长入和膀胱平滑肌再生，尿动力结果表明膀胱功能部分恢复，展示了BMSCs在膀胱修复重建中的巨大潜力。 2.4 BMSCs的移植途径 BMSCs在再生医学领域已显示出良好的应用前景。目前可供选择的BMSCs移植途径主要有尾静脉、膀胱壁、膀胱颈等。Dong等[58]发现经尾静脉脉移植尿来源干细胞后能显著抑制心肌、肾小球及逼尿肌的纤维化和细胞凋亡水平，可减少糖尿病相关并发症发生。印苏培等[59]建立大鼠逼尿肌无力模型，将BMSCs通过膀胱壁注射，分化并构建膀胱修复的细胞和支架，提高逼尿肌收缩能力，改善逼尿肌凋亡，促进平滑肌再生，恢复部分逼尿肌功能。Carr等[60]发现将BMSCs注射入无胸腺膀胱颈8周后，细胞仍存活并可分化为功能性肌细胞，改善膀胱及尿道平滑肌的机构和功能。目前为止，对于BMSCs的最佳移植途径未有定论，每种途径都有各自的优点和局限性，因此在具体移植途径选择上应根据糖尿病神经源性膀胱的不同病理生理阶段、移植干细胞类型及数量等因素，结合尿流动力学以及双侧肾功能进行综合考虑，以期达到最佳治疗效果。"

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