2.1 自体细胞 应用组织工程技术构建半月板组织目前面临的一个主要问题是：能否构建出与正常半月板一样的组织，还是仅仅能构成具有其主要生理功能的半月板替代组织。一些研究人员提出，构建仿生的可复制的自体半月板组织，必需使用可吸收的支架材料复合可以产生纤维软骨基质的自体细胞[1-3]。但是这种构建方式存在以下几种缺陷，①如果采用这种方式患者需要接受2次手术，第1次手术提取自体半月板细胞，第2次手术将体外构建的类半月板组织植入体内；②只有从半月板外缘组织获得的半月板细胞才能够产生较多的氨基葡萄糖，所以可取的半月板组织较少，同时由于提取半月板细胞的技术尚不完善，目前的技术只能获取少量的半月板细胞[4-5]。目前细胞培养技术只能进行单层的自体半月板细胞培养，而细胞在单层培养时可能向软骨细胞分化。虽然构建组织工程半月板的技术在不断发展，一些难解决的重要问题仍然存在，最主要的难题是无法获取大量的自体半月板细胞，此外，获取的半月板细胞在单层培养时增生、分化能力明显不足，因为细胞已进入变性退化阶段或者处在年龄相关疾病阶段，所以半月板组织工程种子细胞的选择需要更广泛的来源。 2.2 同种和异种细胞  目前的共识是从损伤半月板周围区域获得足够数量健康未分化的种子细胞是非常困难甚至是不可能的，依据关节软骨自体移植获得的成功的启示，许多研究人员使用同种或异种细胞作为种子细胞构建组织工程半月板，Weinand等[6-7]将自体和同种异体的软骨细胞复合可降解支架移植修复猪的半月板桶柄样撕裂，12周后研究人员发现与对照组相比自体细胞组和同种异体细胞组的半月板均获得了良好的愈合，统计学显示2组移植细胞在促进损伤区域半月板愈合上没有显著性差异，他们的结论是使用同种异体细胞作为半月板组织工程的种子细胞是可行的。Ramallal等[8]研究表明与使用异种细胞相比，人们更支持同种异体细胞，研究人员在30只新西兰大白兔的股骨髁上制作软骨缺损的模型，缝合带有骨膜的软骨修复，对照组缺损缝隙中注入自体软骨细胞，实验组的缺损缝隙中注入培养的猪软骨细胞，24周后使用Mankin评分分析了软骨的大体变化，阿利新蓝，甲苯胺蓝染色观察软骨组织变化，结果显示：实验组约有75%的软骨缺损愈合，软骨表面不平整，对照组中约有90%的软骨缺损愈合，并且新形成的软骨表面平滑。Yan等[9]用4种不同的细胞作为种子细胞：自体软骨细胞、骨髓干细胞、成纤维细胞和人脐血干细胞与PLA支架复合后修复兔的软骨缺损模型，研究发现使用同种的骨髓干细胞修复效果较好，使用异种的脐带血干细胞不存在免疫排斥反应，揭示在这方面有必要进行更深入的研究，这些研究表明使用同种或异种细胞作为种子细胞构建组织工程半月板是可行的[10]。 2.3  人胚胎干细胞  最近，研究人员更感兴趣使用人胚胎干细胞修复组织退变和老化(比如关节软骨、半月板、椎间盘、心肌等[10-14]，通过自身分化的干细胞在组织自我更新修复中发挥着重要作用，并且能够产生细胞因子和生长因子[15]，人胚胎干细胞已经被证明是纤维软骨组织工程重要的种子细胞来源，其多向分化潜能和不受限的增殖潜能是组织工程理想种子细胞的主要特征[16]，但是使用人胚胎干细胞作为半月板组织工程种子细胞的研究仍处于早期阶段，Hoben 等[17]研究了人胚胎干细胞向纤维软骨样细胞的分化过程，观察到了特征性的分化细胞，他们将人胚胎干细胞和生长因子(转化生长因子b3、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4、骨形态发生蛋白6、PDGF-BB)和软骨细胞、纤维软骨细胞共同培养3周，检测各组细胞产生氨基葡萄糖，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型胶原的含量以及特征性表面标记物(CD105、CD44、SSEA、PDGFRa)，结果显示：转化生长因子b3 和骨形态发生蛋白4组出现了阳性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原结节，氨基葡萄糖和胶原的含量分别增加6.7和4.8倍，与此相比与纤维软骨细胞共同培养组胶原的含量增加了9.8倍，研究最后指出：人胚胎干细胞是合适的半月板组织工程种子细胞。 2.4 成体干细胞 长骨骨髓间充质来源的骨髓干细胞具有多项分化潜能[18-21]，大量的研究发现骨髓间充质干细胞主要有以下2个特点：首先，间充质干细胞能像多种中胚层来源的组织分化(例如，软骨、骨、韧带、肌肉、脂肪、皮肤和其他结缔组织) 因此其可以用作间质来源组织的种子细胞其次，间充质干细胞分泌大量不同的免疫调节分子，通过旁分泌营养调节有助于促进创伤组织的愈合过程，许多研究观察了骨髓间质细胞在局部组织中的迁徙、分化、和增值情况，可以复合无细胞支架移植或者经过生长因子作用后移植(比如表皮细胞生长因子)，这2种方法都可以激活骨髓间质细胞的活性[22-24]，另一种策略是局部应用自体间充质干细胞来治疗创伤、退变、组织缺损。因为风险较小花费较低，许多外科医生应用骨髓干细胞移植来促进骨折愈合。同样也用骨髓干细胞促进撕裂半月板组织的愈合，一些主要技术包括先造出血管通道，血管通道主要通过在半月板组织上钻孔和刺孔完成。这可以使血液和骨髓干细胞进入损坏的无血供的半月板组织，其他修复技术使用有血供的滑膜组织和纤维蛋白血凝块，依据的原理是一样的，目前这些技术的研究结果存在一定的冲突[25-27]。移植单层或修饰的自体间充质干细胞是基于间充质干细胞组织工程技术的另一种方法，2005年Izuta等[28]，首次使用绿色荧光蛋白标记的转基因的大鼠骨髓间充质干细胞移植，骨髓间充质干细胞分离后单层培养，移植到无血供区半月板缺损的位置，8周后发现骨髓间充质干细胞能够在半月板缺损区域存活并且增值分化，分泌大量的细胞外基质，加速了无血供区半月板组织的愈合。 同样，有研究报道将自体骨髓间充质干细胞注射修复半月板损伤部位促进其愈合，研究人员也已证实使用间充质干细胞作为种子细胞复合支架材料构建组织工程半月板是一种可行的方法[29-30]，有研究揭示未分化的间充质干细胞具有更强的促进组织愈合的潜能，Zellner等[31]比较了应用自体间充质干细胞和PRP修复兔半月板损伤圆形缺损模型，移植12周后研究人员发现没有经过预先培养的自体间充质干细胞分化为类半月板细胞并修复了半月板组织。 毋庸质疑的是体外培养有明显的优缺点，这种原始的培养细胞的优点是细胞数量增加迅速，主要缺点有培养过程中细胞容易感染，移植前可能会减弱细胞的分化能力，另一种缺点是没有广泛报道的移植后细胞基因变异和细胞呈肿瘤样异常增生[31-32]。培养具有基本功能的本体组织，与自体组织具有良好的结合，并且能长期保持细胞的活力和半月板的功能，是组织工程种子细胞领域存在的机遇与挑战。   2.5 组织工程半月板的理化刺激 2.5.1 组织工程半月板的生化刺激 多种生化刺激已经应用于半月板组织工程研究。生长因子是组织工程中最突出的用于刺激膝关节半月板的生化刺激因素，其对于半月板细胞增殖，特别是碱性成纤维细胞生长因子可以引起一系列强烈的反应。一组研究包括九种生长因子(表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子a、PDGF-AB、酸性成纤维细胞生长因子、转化生长因子b1、PDGF-AA、胰岛素样生长因子1和神经生长因子)刺激单层半月板细胞的扩散，结果显示碱性成纤维细胞生长因子、PDGF-AB、表皮细胞生长因子和TGF促进细胞核扩散明显，其中成纤维细胞生长因子的作用最为明显，同时这4种生长因子也可促进胶原合成并增加半月板细胞数量[33]。 另一项研究比较了单层半月板细胞扩在不同组织区域的扩散情况(内/中/外)。当PDGF-AB、肝细胞生长因子HGF和骨形态发生蛋白2被应用到培养的半月板细胞时，DNA合成增加了3倍，而胰岛素样生长因子1没有这样的效果。值得注意的是：不同地区的细胞反应不同，骨形态发生蛋白2略强影响到中间地带的半月板细胞，HGF对半月板内侧区的细胞影响稍强[34]。PDGF-AB和肝细胞生长因子刺激迁移细胞从3个地区的半月板转移出来， 表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白2等提升细胞迁移只有在特定区域的半月板中进行(分别是在外部和内部，中产和内心，外层和中层)。除了扩散和迁移， 生长因子在半月板组织工程的另一个主要功能就是刺激基质合成[35]。 目前的研究一再证明了基质合成会促进半月板细胞合成蛋白质，因为很大程度上，细胞外基质带来的机械性能是构成膝关节半月板的主要功能。早期研究显示当应用转化生长因子b1刺激时，单层半月板细胞的蛋白合成会增加，并且只有在单层培养的半月板细胞中，细胞增殖增加。此外，支架和单层研究进行比较时，转化生长因子b1、胰岛素样生长因子 1、碱性成纤维细胞生长因子、PDGF-AB会刺激生产更多的胶原蛋白。这种蛋白质的基本作用是帮助软骨的润滑[36]。 生长因子可能是一个潜在影响调节基质收缩的因素，关节软骨细胞和成纤维细胞在他们周围的基质中发挥作用。连续的组织结构可能会受益于控制收缩，因为细胞外基质压实和对齐会导致各向异性和更大的机械性能。事实上，抑制纤维细胞介导的收缩可以破坏肌腱力学的发展性能。然而，使用控制收缩的生物物理的方法来调节软骨的发展的文献是相对稀少的。转化生长因子b1和PDGF被记录为由半月板细胞收缩时生长因子参与基质形成的纤维细胞及关节软骨细胞[37]。碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1 诱发关节软骨细胞介导的收缩[38]。继续探索这个话题可能会有重要发现。 表型纤维软骨细胞维护和分化是生长因子在半月板组织工程中的另一个重要的应用；尽管该领域的研究较少，已有研究将半月板细胞表型在添加碱性成纤维细胞生长因子单层和添加碱性成纤维细胞生长因子三维立体培养，结果显示三维培养的半月板细胞胶原蛋白Ⅱ和糖胺聚糖的表达比单层培养高200倍[39]。软骨素酶ABC(C-ABC)是另一个已经应用于软骨组织工程的生化刺激。这种酶从蛋白多糖链劈开硫酸软骨素和皮肤素，但是却不会影响胶原纤维。有人认为他可以引起的肿胀压力之间的动态平衡，证实蛋白聚糖和胶原蛋白的抑制强度网络的存在[40]。 软骨素酶可能促进胶原网络对齐和密度增加， 引起高度组织拉伸性能。其他研究可能关注非传统的生长因子，如血清衍生代理溶血磷脂酸。溶血磷脂酸自然存在于哺乳动物中，其血清浓度从1-5 mmol/L，并作为一个发病因素已被广泛的研究。其他的代理可能来源于富血小板血浆，这被证明能增加半月板在单层细胞培养基质沉积和扩散[41]。 尽管纤维软骨是一个特别重要的软组织，研究其生化刺激将沿着上述这些线路进行，这样未来的研究才可能会引起重大的医学进步。目前仍然有很多有关生化刺激用于组织工程膝关节半月板研究亟待解决。 2.5.2 半月板组织工程的机械刺激 半月板细胞可能对纤维软骨细胞外基质的机械刺激产生积极回应，基质的力学性能有3个通用机制：增强沉积、对齐或压实。为了实现这些结果，有几种半月板组织的机械刺激方法，包括高、低剪切、液体灌注、静水压力、直接压缩以及超声波。然而，当前大多数的研究都集中在静水压力和直接压缩刺激上。 外植体和工程组织可以证明不同重构对静水压力的反应，例如，野兔的半月板移植组织受到循环静水压力在1 MPa、0.5 Hz、1 min、14 min后结束，结果显示产生炎症性因子和基质降解。相比之下，野兔的半月板细胞播种在丙交脂结构，10 MPa静态每3 d 1 h的静水压力刺激下表现出类似的反应[42]。 在这些结构中，当运行在0.1或1 Hz时，胶原蛋白和糖胺聚糖的沉积以及抗压特性，都明显高于控制或动态静水压力方案。当添加上转化生长因子b时，半月板细胞在静水压力的刺激下，显示胶原蛋白和糖胺聚糖沉积的增加，以及协同增加的抗压性能。这些结果表明了，半月板细胞的有效机械刺激可能是静水压力[43]。 半月板的直接压力刺激也一直被关注，使用的直接压力在0.1 MPa和0.08-0.16 MPa，证明其可以降低Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白和核心蛋白聚糖的mRNA水平。同样的，动态压缩下的猪半月板外植体(24 h，0.1 MPa，0.1 Hz)已经被证明会有一氧化氮的生产， 而对于关节炎和半月板变性，它是一个强有力的信号分子。因此，使用不正确的加载方案参数可能导致基质和组织退化[44]。 相比之下，其他某些加载方案显示了有益的作用。半月板在体内的生理负荷可能超过1 000 N，目前认为这种压缩加载有助于促进传输限制中的营养交换和无血管的半月板，目前的研究已经证明拉伸加载半月板细胞，可以抑制炎症因子的生产。此外，半月板移植组织的动态压缩(2%振荡压力，1 Hz，1 min/1 min周期，4 h每天4 d)下聚集蛋白聚糖的表达与静态压缩样本相比有一定的增加[45]。 长时间加载的方案(0.1 MPa，0.5 Hz，每24 h)，也被证明能增加半月板移植组织中蛋白质(68%)和蛋白多糖(58%)的合成。动态压缩含有牛半月板细胞成型海藻酸支架中，取得了有效的成果。研究的加载方案(7%-15%应变、1 Hz、1 h/1 h，周期：每天3 h，每周3 d)，2周后胶原蛋白含量增加[46]。这些结果表明不同的机械刺激加载方案可能会导致不同生物合成反应后的发生。"