2.1   牙髓干细胞在牙髓组织工程中的应用 2.1.1   牙髓干细胞的定义及特征   牙髓干细胞是来源于牙髓组织的多能干细胞，主要通过酶消化法从正畸拔除的牙齿、埋伏牙和第三磨牙等牙髓组织中分离、提取，具有易于获取、无伦理问题以及免疫排斥反应低等独特优势。牙髓干细胞源于胚胎发育早期的神经嵴组织，具有多向分化能力和高度增殖潜力，可以作为牙髓再生的关键种子细胞来源。研究表明，牙髓干细胞可以分化为成牙本质细胞[13]、成骨细胞[14-16]、血管内皮细胞[4]、神经细胞等多种细胞类型[2，17]。此外，牙髓干细胞可通过旁分泌机制释放血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白等多种生长因子，有助于促进血管生成和神经再生[8，18-20]。 2.1.2   牙髓干细胞在牙髓再生中的应用   在牙髓再生过程中，提高牙髓干细胞活性及促进其向成牙本质细胞、血管内皮细胞分化是恢复牙髓组织结构和功能的理想方法之一[18]。近年来，工程化干细胞作为干细胞研究领域的重要发展方向，已逐渐应用于牙髓再生治疗中。通过细胞因子调控、生物材料支持、物理条件调节和基因工程编辑等手段，工程化干细胞能够显著提升牙髓干细胞的活性，并促进其向成牙本质细胞及血管内皮细胞分化，从而加速牙髓组织的修复与再生。例如，相关细胞因子的添加可以增强牙髓干细胞的增殖潜力和分化能力[18]，实现细胞状态的定向调控；生物支架和纳米载体的优化设计为牙髓干细胞提供了更为理想的再生微环 境[21]；通过调节培养环境中的pH值、氧气体积分数及电磁场等物理因素[22-23]，可精确调控牙髓干细胞的增殖和分化；此外，基因转染技术通过调控特定转录因子的表达[24-26]，促进牙髓干细胞向目标细胞类型分化，进一步提升牙髓干细胞在牙髓再生中的效果。 (1)牙髓干细胞活性：为了提高牙髓再生的效果，增强和维持牙髓干细胞的活性包括增殖、黏附、迁移、分化和免疫调节能力等方面，是实现有效修复的关键。研究者们提出了多种工程化干细胞方案来提高牙髓干细胞的活性，为后续血运重建以及形成牙髓-牙本质样结构奠定了坚实的基础[27-28]。YU等[18]发现大麻二酚通过下调促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达，有效恢复炎症环境中牙髓干细胞的增殖与分化活性，进一步增强成牙分化潜力。AYADILORD等[29]将植物体姜黄素纳米颗粒作用于牙髓干细胞，发现通过调控多个miRNA(如miR-21、miR-23、miR-155等)和CD200的表达，抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/核因子κB信号通路，从而调节干细胞的免疫活性并降低促炎细胞因子的表达。WANG等[22]利用等离子体纳米材料的电磁场效应和光热效应的协同作用，靶向增加牙髓干细胞线粒体内羟脯氨酸的含量，从而促进牙髓干细胞向成牙本质细胞的定向分化。ZHANG等[23]构建了一种磁性纳米颗粒交联的超分子聚合物纳米纤维，并通过施加人工磁场成功实现对牙髓干细胞极性的调控，促进牙髓干细胞定向极化及延伸等细胞行为，这一机制策略为牙髓再生提供了新的研究方向。JEONG等[30]利用牙髓干细胞构建了一种牙髓牙本质样类器官，这些类器官能够对生物刺激器展现出适当的反应，具有干细胞和分化细胞(如成牙本质细胞)的特征，呈现了在牙髓再生领域作为新型研究工具的巨大潜力。MEZA等[31]首次将自体牙髓干细胞与白细胞富血小板纤维蛋白基质联合应用于不可逆牙髓炎患者的恒牙再生手术，结果表明，白细胞富血小板纤维蛋白基质不仅为牙髓干细胞提供了理想的黏附与迁移环境，还通过释放生长因子促进了细胞的增殖与分化，最终成功再生出具有血管结构的均匀致密牙髓样组织。LIU等[32]通过在牙本质切片表面修饰多巴胺-透明质酸涂层来增强牙髓干细胞与根管壁之间的黏附力，研究表明涂层处理后的牙本质组在细胞数量、细胞伸长率和黏附力上明显优于未处理的牙本质组，进而促进了牙髓干细胞在根管内的增殖和迁移。TERRANOVA等[33]将鞣酸修饰的聚己内酯微粒引入电纺聚乳酸纳米纤维支架中，得到的3D锥体结构支架具备优良的结构可控性，易于插入根管，同时具有高度多孔性，能够有效促进牙髓干细胞的浸润与定植，增强增殖、分化和迁移活性，为牙髓组织再生与修复提供有力支持。 (2)牙髓干细胞向成牙本质细胞分化：牙髓-牙本质复合体的重建是牙髓再生的关键因素之一，大量研究表明，牙髓干细胞能够在多种信号通路的调控下向成牙本质细胞分化[34-36]，从而促进牙髓-牙本质复合体的再生。LIU等[37]研究发现，过表达BTB和CNC同源1能够影响血红素加氧酶1信号通路从而促进牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化。JEON和LIU等[13，38]研究发现，通过阻断程序性细胞死亡配体1信号，可以激活Ras-细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和蛋白激酶B信号通路，进一步促进牙髓干细胞的成牙本质分化。CHEN等[39]研究表明，分解素E1通过调节蛋白激酶B、ERK以及核糖体蛋白S6的磷酸化水平，显著促进牙髓干细胞中牙本质磷蛋白(dentin sialoprotein，DSP)的表达。另一项研究证明了镁离子(Mg2+)通过激活ERK/骨形态发生蛋白2/Smads信号通路促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化[40]。 WANG等[24]通过反转录病毒转染技术使牙髓干细胞过表达分泌型Frizzled相关蛋白2，并将其移植到上下颌牙拔除的兔模型中，实验组拔牙槽被大量高密度的牙本质样结构填充，并且表达了牙本质特异性蛋白，如牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)和牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)等。XUAN等[41]使用自体乳牙牙髓干细胞治疗因创伤导致的年轻恒牙牙髓坏死，成功再生出含有正常成牙本质细胞层的牙髓组织，经过24个月的随访，发现再生牙髓仍然保持活性。另外，牙髓干细胞与生物材料的联合应用已被广泛探索，被认为是牙髓再生的有效策略之一。HAN等[42]采用双网络羧乙基几丁质水凝胶携载牙髓干细胞，在体外促进成牙本质分化，并在体内实验中展现出与天然牙髓组织生成相匹配的支架降解速率。JUN等[43]将氧化铈纳米颗粒引入到三氧化二矿物骨料并作用于牙髓干细胞，发现细胞内活性氧水平下降约70%，而牙髓干细胞成牙本质分化能力得到明显提升。其他支架材料如光交联丝素蛋白甲基丙烯酸酯复合水凝胶、富含氯化钾的卡拉胶/壳聚糖/明胶复合支架等为牙髓干细胞提供了优异的仿生微环境，进一步提升了牙髓干细胞的成牙本质分化能力[7，44-53]。相关文献见表1。 "

(3)牙髓干细胞向血管内皮细胞分化：在牙髓重建过程中，新生血管为周围组织提供必要的营养支持[54]，有效促进牙髓干细胞向血管内皮细胞分化，并分泌相关血管生成活性因子。为了克服牙髓干细胞在单细胞培养模型中增殖缓慢和微环境模拟不足等问题，研究者们通过在单细胞培养模型中引入其他类型的细胞[55]、各种生长因子和活性材料建立细胞共培养体系，显著提高了牙髓干细胞的血管生成能力[56-58]。吕继忠[58]将小鼠成纤维细胞来源的诱导多能干细胞诱导分化为血管内皮样细胞后，与牙髓干细胞共培养，发现共培养体系中牙髓干细胞的血管内皮生长因子mRNA表达水平显著上升。KATATA等[4]以及ITOH等[59]的研究表明，使用内皮分化培养基对牙髓干细胞进行预处理，显著增强了牙髓干细胞的血管生成能力。BINDAL等[60]研究发现，人血小板裂解液可以显著提升牙髓干细胞中血管生成相关基因的表达。LIANG等[61]在比格犬和裸鼠体内模型中的研究表明，骨形态发生蛋白7能够诱导牙髓干细胞迁移，并促进新生血管向内生长，同时促进丰富的牙髓样组织形成。WU等[62]通过铜离子(Cu2+)激活晚期牙髓干细胞中染色盒蛋白同源物7 (chromobox protein homolog 7，CBX7)的表达，并将干细胞注射到裸鼠皮下移植模型中，发现CD31表达上调，提示有血管生成。NAKASHIMA等[63]在犬牙髓切除的临床前模型中，通过自体牙髓干细胞与粒细胞集落刺激因子联合移植到根管中，成功促进了血管和神经丰富的牙髓样组织形成，且治疗后的犬临床体征恢复正常。在验证干细胞疗法用于牙髓再生的临床前安全性和有效性后，NAKASHIMA等[64]首次将自体牙髓干细胞应用于人体多根磨牙的牙髓再生治疗，治疗后4周，患牙电活力测试呈阳性反应，患者未见全身毒性；24周时，核磁共振成像结果显示再生牙髓与对照牙髓几乎无差异，并形成血管-神经支配的牙本质样矿化组织；48周时，锥形束计算机断层扫描未见根尖周射线可透性，表明治疗后的牙髓组织稳定无渗漏，证明该疗法在人体牙髓再生中的临床安全性与疗效性。同时，研究者们构建封装牙髓干细胞与血管内皮生长因子的可注射海藻酸钠/锂皂石水凝胶微球，不但可以注射到常规细胞片层或刚性支架难以覆盖的区域，同时能够持续释放血管内皮生长因子长达28 d[65]。ATILA等[51，66]在水凝胶核/壳结构上分别负载了褪黑素和非竞争性糖原合酶激酶3β，成功实现了双重可控释放，其中非竞争性糖原合酶激酶3β作为首要释放成分，用于刺激血管生成，褪黑素起到延迟释放的作用，有效调控牙髓干细胞的早期增殖速率。此外，LI等[26]提出了一种新型非病毒基因纳米载体，通过携载血管内皮生长因子基因显著提升了转染后的牙髓干细胞血管生成潜力，有效促进了牙根血运重建与牙髓组织再生。 2.2   牙髓干细胞来源活性因子在牙髓组织工程中的应用    2.2.1  细胞外囊泡 (1)细胞外囊泡的定义及特征：牙髓干细胞来源细胞外囊泡是由牙髓干细胞分泌的一类被细胞膜包裹的纳米级囊泡，具有高度稳定性和生物相容性。根据国际细胞外囊泡学会的建议，通常将细胞外囊泡根据大小和形成机制分为3类：小的内体衍生的外泌体(直径30-150 nm)、大的质膜衍生的微囊泡(直径100-1 000 nm)和凋亡过程中产生的凋亡小体(直径50-1 000 nm)。由于牙髓干细胞基因工程的可行性和便利性，可作为细胞外囊泡的合适来源[67]。通过收集牙髓干细胞上清液，离心即可获得富含蛋白质、脂质和核酸如信使RNA(messenger RNA，mRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等活性因子的牙髓干细胞来源细胞外囊泡[68-70]，牙髓干细胞来源细胞外囊泡可以停留在原始细胞附近或进入生物体液[71]，通过细胞膜融合或内吞作用进入靶细胞，发挥信号通路传递作用。因较低的免疫排斥风险和较高的基因工程改造可行性[67，72]，牙髓干细胞来源细胞外囊泡被认为是牙髓组织工程中一种极具潜力的无细胞治疗手段[73-80]，相关文献见表2。 "

(2)细胞外囊泡在牙髓再生方面的应用 促进成牙本质分化：在牙髓组织修复过程中，牙髓干细胞来源细胞外囊泡内部的活性因子能够通过多种机制有效调控干细胞向成牙本质细胞的分化。研究表明，牙髓干细胞来源细胞外囊泡通过激活多条信号通路如ERK、C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等[73，81]，促进人脂肪来源干细胞的成骨分化，效果与美国食品和药物管理局批准的骨形态发生蛋白2相当。此外，SWANSON等[82]实验表明，牙髓干细胞来源外泌体能够通过内吞作用刺激人源性间充质干细胞激活DSPP的转录，促进其向成牙本质细胞分化。CHEN等[74]研究发现，牙髓干细胞来源外泌体通过细胞归巢机制，成功招募了根尖牙乳头干细胞，并在体内形成牙髓样结缔组织。值得注意的是，牙髓干细胞来源细胞外囊泡中的miRNA在促进成牙本质分化过程中也发挥了重要作用。XIE等[75]研究发现，在牙髓干细胞来源外泌体被同型牙髓干细胞吞噬后，上调的环状溶血磷脂酸受体1与miR-31结合，消除了对牙髓干细胞成骨分化的抑制作用。LI等[67]研究表明，牙髓干细胞来源外泌体携载的长链非编码RNA锚定蛋白重复结构域26能够通过调控miR-150/Toll样受体4信号通路促进成骨细胞分化。 促进成血管和成神经分化：牙髓干细胞来源细胞外囊泡在牙髓再生中的另一个关键作用在于其强大的促进血管和神经再生能力。牙髓神经的再生依赖于健康血管提供的营养支持，牙髓干细胞来源细胞外囊泡通常包含可溶性血管生成相关蛋白(如血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子)及相关miRNA[83-85]，在血管再生方面发挥着尤为重要的作用。ZHANG等[9]通过将含有牙髓干细胞来源细胞外囊泡的纤维蛋白凝胶与牙髓干细胞共培养，发现牙髓干细胞来源细胞外囊泡中的miRNA促进了血管内皮生长因子的分泌，并且伴随多种胶原蛋白的沉积，后者为新生血管的成熟和稳定提供了支持。GANESH等[10]发现，血管分化条件下的牙髓干细胞来源外泌体在促进血管生成方面有显著优势。蓝彬园等[86]研究发现，脂多糖预处理的牙髓干细胞分泌的外泌体能够在根管内形成更多新生血管密度的牙髓样组织。LI等[87]进一步表明，脂多糖预处理的牙髓干细胞分泌的外泌体还能够增强施万细胞的增殖、迁移及成牙本质分化的能力。CHEN等[80]将脂多糖预处理的牙髓干细胞产生的微囊泡植入到大鼠牙髓根管模型中，发现血管内皮生长因子、神经成束蛋白和牙本质涎磷蛋白等标志物表达显著上升，显示出脂多糖预处理的牙髓干细胞分泌的微囊泡在血管、神经和牙本质再生中的潜力。此外，不同年龄供者来源的牙髓干细胞衍生细胞外囊泡在血管和神经再生能力方面存在差异[88]，年轻组的牙髓干细胞来源外泌体相较于年老组在促进血管内皮生长因子和肝细胞生长因子分泌上具有显著优势，显示出更高的无细胞治疗潜力。MAS-BARGUES等[89]研究发现，衰老牙髓干细胞来源细胞外囊泡能够诱导年轻牙髓干细胞中抗氧化基因过表达，进而增强抗氧化能力，并促进年轻牙髓干细胞的增殖、迁移与存活，从而调节年轻牙髓干细胞的微环境。 2.2.2   条件培养液 (1)条件培养液的定义及特征：牙髓干细胞来源条件培养液是通过收集在体外培养牙髓干细胞的基液，经过过滤、离心和浓缩等处理步骤，从而获得高生物活性的条件培养液。牙髓干细胞来源条件培养液富含细胞因子、生长因子、细胞外基质的分解产物和代谢产物等，能够通过旁分泌机制调节周围细胞的行为。由于含有丰富的生物活性成分和低免疫排斥风险，牙髓干细胞来源条件培养液被认为在组织修复领域具有重要的应用潜力[90]。与牙髓干细胞来源细胞外囊泡相比，牙髓干细胞来源条件培养液含有更多的分解产物和代谢因子，能够在微环境中提供更有利的修复条件，促进成牙本质分化，诱导新生血管形成并减少内皮细胞凋亡，在牙髓再生领域相关文献如表3所示，受到了广泛关注[91-95]。 "