2.1  胶原蛋白质量浓度对纤维重组纳吸棉的影响  胶原蛋白质量浓度是影响纤维重组构建纳吸棉的因素之一。图1是不同质量浓度胶原蛋白对纤维重组纳吸棉的影响。从图中可以看出，随着胶原蛋白溶液质量浓度的升高，纤维重组率也随之增大，即纳吸棉生成量逐渐增加，在1 g/L胶原蛋白质量浓度下，纳吸棉生成量达到最高值。 该实验结果提示，随着胶原蛋白质量浓度的提高，胶原分子的重组程度也随之增加，有文献报道，胶原纤维重组存在临界质量浓度[16]，临界质量浓度以上，胶原会重组构成纳吸棉，但在临界质量浓度以下，通过离心等测定方法不能检测到纳吸棉的形成。罗非鱼皮Ⅰ型胶原重组的临界质量浓度为0.2-0.3 g/L。但是，胶原质量浓度不能无限制增大，适量的胶原分子能促进重组纤维的生长，但过多却产生抑制作用。"

2.2  离子强度(NaCl浓度)对纤维重组纳吸棉效果的影响  离子强度(NaCl浓度)是决定纤维重组效果的重要参数之一。试验中通过控制PBS中NaCl浓度的方法调节离子强度的大小。离子强度对胶原蛋白纤维重组构建纳吸棉的影响如图2所示。从中可以看出，当溶液中有NaCl存在时，胶原表现明显的纤维重组现象。NaCl含量在35.5-130 mmol/L时，胶原蛋白纤维重组明显加快，盐粒子对聚集的阻滞作用力较弱，胶原分子表面的静电作用较大，分子间可通过静电作用聚集，说明NaCl在胶原重组过程中发挥重要作用，但浓度一旦超过130 mmol/L，胶原纤维重组率逐步下降，原因可能是NaCl通过屏蔽带电基团而增强了胶原分子间的斥力[17]，胶原聚集受阻；实验表明适量的离子强度有利于胶原纤维重组过程，但是过量的离子强度阻碍胶原纤维重组效果。"

2.3  体系pH值对纤维重组纳吸棉效果的影响  溶液环境的pH值是决定纤维重组效果的最重要参数。pH值通过影响胶原分子间电荷排斥作用的强弱，从而影响分子间重组纤维的结合能力，进而影响纳吸棉纤维的重组效果[8]。 环境pH值对胶原蛋白纤维重组纳吸棉的影响如图3所示。从实验选择的5个pH值中，可以看出当pH值为5.4-7.4时，纤维重组率逐步升高；当pH值增大到7.4时，其重组效果达到最佳，随着pH值进一步增大，其重组率有所降低并渐渐维持恒定。 原因可能是：在H+浓度较高的条件下，胶原分子内肽键的酰胺基能和溶液中的H+形成-NH2+，由于电荷排斥作用，胶原分子多以线性单分子或小的聚集体形式存在，较难形成大的分子聚集体。随着pH值的增大，胶原蛋白分子间电荷排斥作用下降，分子间聚集程度增加，有助于大的纤维聚集体形成[18]。罗非鱼鱼皮酶促溶性胶原蛋白纤维重组快速上升阶段的起始pH值为5左右，接近胶原分子的等电点pH值[19]。"

2.4  体系温度对纤维重组纳吸棉效果的影响  在蛋白纤维重组过程中，温度影响胶原蛋白三螺旋结构稳定性[20]。环境温度对胶原蛋白纤维重组影响显著。 温度对纤维重组纳吸棉的影响如图4所示。当温度为  4 ℃时，罗非鱼鱼皮酶促溶性胶原蛋白纤维重组纳吸棉效果较差，升高到20 ℃时，纤维重组效果最好，当温度升高到30 ℃及以上时，其纤维重组率降低。从纤维重组效果来看，随着温度的升高，纤维重组率先升高后降低，在20 ℃时达到最大值。该结果表明：在最接近鱼类生活环境的温度条件下，其纤维重组效果最好，而低温条件下明显抑制其重组效果，高温条件下蛋白易变性，变性后，三螺旋结构被破坏，纤维重组过程被破坏。"

2.5  时间对纤维重组纳吸棉效果的影响  时间对胶原蛋白纤维重组构建纳吸棉的影响如图5所示，随着重组时间的延长，胶原蛋白重组效果明显增大，0-3 h增长速率最快，3 h后增长速度逐渐减慢，10 h达到峰值，以后胶原重组率基本维持不变，表明纤维重组在10 h已经达到平衡。由上述分析可知，胶原蛋白纤维重组构建纳吸棉时间为10 h较为合适。 单因素试验结果表明，在胶原质量浓度为1 g/L、离子强度(NaCl浓度)为130 mmol/L、调节pH值为7.4、环境温度为20 ℃、重组时间为10 h的条件下，罗非鱼鱼皮酶促溶性胶原蛋白纤维重组构建纳吸棉效果最好，从胶原质量浓度单因素来讲，适量的胶原分子能促进重组纤维的生长，但过多却产生抑制作用；从离子强度(NaCl浓度)单因素来讲，适量的离子强度(NaCl浓度)有利于胶原纤维重组过程，但是过量的离子强度(NaCl浓度)阻碍胶原纤维重组效果；从体系pH值单因素来考虑，当调节pH值达到蛋白等电点时，其蛋白纤维重组程度达到最大；调节环境温度达到鱼生长环境的最适温度，纤维重组率最好，一旦超过蛋白变性温度，三螺旋结构完全破坏，胶原蛋白不会重组形成纤维，可见胶原蛋白纤维重组程度与其结构的完整性关系很大，时间对胶原蛋白重组纤维的多少也起到作用。"

2.6  正交试验  在上述单因素试验的基础上，胶原质量浓度、离子强度(NaCl浓度)、体系pH值、体系温度为主要因素，进行四因素三水平正交试验，以胶原蛋白纤维重组率为考察指标，选用正交表L9(34)进行试验确定胶原蛋白纤维重组构建纳吸棉的最佳实验条件，结果分析见表2。 由表2可知，以胶原质量浓度、离子强度(NaCl浓度)、体系pH值、体系温度为主要因素，以纤维重组率为指标，对正交试验结果进行极差分析，发现各因素的影响程度依次为pH值、体系温度、离子强度(NaCl浓度)、胶原质量浓度；最佳试验组合为A1B2C2D2，即胶原质量浓度为1 g/L，离子强度(NaCl浓度)为65 mmol/L，pH 7.4体系温度为   20 ℃，重组时间为10 h。"

2.7  重组纳吸棉的红外光谱分析  蛋白质的二级结构与其分子内形成的不同氢键类型密切相关，傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术是研究氢键的强有力手段，它可以在各种环境条件下得到几乎所有生物物质的红外光谱图。一般而言，N-H 伸缩振动产生的酰胺 A 带的吸收通常在3 300- 3 440 cm-1；-CH2的不对称伸缩振动产生的酰胺B带的吸收通常在2 920-2 944 cm-1；C=O伸缩振动产生的酰胺Ⅰ带的吸收通常在1 652-1 653 cm-1；酰胺Ⅱ带、Ⅲ带的吸收峰通常出现在1 558 cm-1、1 238 cm-1。 根据图6可知重组前胶原蛋白酰胺A带的特征吸收为   3 340.11 cm-1处的强吸收，酰胺B的特征吸收为           2 927.41 cm-1处的强吸收，酰胺Ⅰ带的特征吸收为         1 650.77 cm-1处的强吸收，酰胺Ⅱ带的特征吸收为         1 546.63 cm-1处的强吸收。1 241.93 cm-1处为胶原蛋白N-H弯曲引起的酰胺Ⅲ带的特征频率。"

根据图7可知重组后纳吸棉酰胺A带、酰胺B带、酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带及N-H弯曲引起的酰胺Ⅲ带的特征频率峰值均与重组前胶原蛋白的特征峰值接近。 根据表3及上述常见蛋白质二级结构的数据对比，说明鱼皮胶原重组构建的纳吸棉的三螺旋结构完整，制备过程中未受过破坏。"

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2.8  纳吸棉的微观结构分析  经冷冻干燥形成的纳吸棉呈多孔白色网孔絮状海绵体。将纳吸棉样品在离子溅射仪上进行喷金处理，于扫描电镜上观察样品的表面和截面结构，取放大100与200倍的镜头图像进行观察比较，图8显示的是纳吸棉在光学显微镜下的细微结构。由图可知，胶原重组后的纳吸棉单层，都呈细线状纤维构成的多孔网状结构。这种细微的网络状结构有利于胶原应用于生物医学材料，它的网状结构有足够的空间供细胞在其中黏附生长，此外还能促进胶原蛋白的外源性凝血作用。"