Chinese Journal of Tissue Engineering Research ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (40): 7169-7174.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.023
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Gao Yan-ming, Zhang Lu
Online:
2013-10-01
Published:
2013-10-31
Contact:
Zhang Lu, Master, Attending physician, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China
andrew76aa@163.com
About author:
Gao Yan-ming★, Master, Associate professor, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, Liaoning Province, China
wwl_999@yahoo.com.cn
CLC Number:
Gao Yan-ming, Zhang Lu. Expression of vascular endothelial growth factor in the treatment of diabetic foot using bone marrow mesenchymal stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(40): 7169-7174.
2.1 骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足过程中血管内皮生长因子表达的实验研究 董方[10]、万江波等[11]和蔡黔等[12]分别对骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病足以及血管内皮生长因子的表达进行了实验研究。董方[10]研究中对90只大鼠进行对比分析,其中30只大鼠为正常对照组,将正常大鼠制备成足溃疡模型;另30只大鼠为糖尿病足溃疡对照组,制备成糖尿病足溃疡模型;剩余30只大鼠为糖尿病足溃疡治疗组,同样制备成糖尿病足溃疡模型。治疗组中30只糖尿病足溃疡模型大鼠于溃疡成形后第1天,在溃疡周围边缘 1 cm处4点皮下肉膜层注射移植0.1 mL计数后骨髓间充质干细胞悬液,其余2组均注射磷酸盐缓冲液,观察各组大鼠于造模后第1,4,8天时的溃疡愈合面积,应用细胞核荧光染色示踪、酶联免疫吸附实验检测外周血中血管内皮生长因子的表达,应用Western免疫印记检测局部血管内皮生长因子的表达情况。 结果显示溃疡形成后第1天注射移植骨髓间充质干细胞于溃疡周围,移植后1,4,8 d进行冰冻切片观察,均可见淡蓝色荧光聚集生长于溃疡周围皮下。骨髓间充质干细胞移植后第4天可见糖尿病足溃疡治疗组大鼠溃疡平均愈合面积快于糖尿病足溃疡对照组,但却慢于正常对照组,治疗组大鼠溃疡面积为(23.62±2.26) mm2,糖尿病足溃疡对照组大鼠溃疡面积为(25.50±6.79) mm2,而正常对照组大鼠溃疡面积为(20.16±3.68) mm2;第8天检测时,可见糖尿病足溃疡治疗组大鼠溃疡平均愈合面积明显快于糖尿病足溃疡对照组,但却仍慢于正常对照组,治疗组大鼠溃疡面积为(7.56±1.91) mm2,糖尿病足溃疡对照组大鼠溃疡面积为(13.20±1.74) mm2,而正常对照组大鼠溃疡面积为(3.64±0.92) mm2。骨髓间充质干细胞移植后第4天于外周血中测定血管内皮生长因子浓度,正常对照组为(1.58±0.06) μg/L,糖尿病足溃疡治疗组为(1.53±0.08) μg/L,糖尿病足溃疡对照组为(1.04±0.05) μg/L;移植后第8天时检测外周血中血管内皮生长因子浓度,正常对照组为(1.70±0.04) μg/L,糖尿病足溃疡治疗组为(1.50±0.04) μg/L,糖尿病足溃疡对照组为(1.14±0.07) μg/L,检测结果均可见糖尿病足溃疡治疗组中血管内皮生长因子的浓度高于糖尿病足溃疡对照组,但却低于正常对照组。局部血管内皮生长因子浓度检测结果显示骨髓间充质干细胞移植后第1,4,8天,糖尿病足溃疡对照组的检测结果均明显低于正常对照组,正常对照组在第1,4,8天的检测结果分别为(1.04±0.05),(1.81±0.06),(1.64± 0.06) μg/L,糖尿病足溃疡对照组在第1,4,8天的检测结果分别为(0.21±0.02),(0.24±0.02),(0.19±0.02) μg/L,而糖尿病足溃疡治疗组的在第1,4,8天的检测结果分别为(2.44±0.25),(2.86± 0.11),(0.85±0.06) μg/L,糖尿病足溃疡治疗组血管内皮生长因子的水平在第1和第4天时明显高于正常对照组,但是在第8天时降至低于正常对照组的水平。病理切片观察可见糖尿病足溃疡治疗组在肉芽生长速度及表皮覆盖速度均明显快于糖尿病足溃疡对照组,但是与正常对照组相比较,仍较慢。 万江波等[11]研究中将36只大鼠随机分为3组,骨髓间充质干细胞经小腿肌肉移植组、正常足溃疡对照组和糖尿病足溃疡对照组,每组12只大鼠。正常足溃疡对照组建立足溃疡模型,糖尿病足溃疡对照组建立糖尿病足溃疡模型,骨髓间充质干细胞经小腿肌肉移植组将大鼠建立糖尿病足溃疡模型后,在双侧小腿注射50 μL骨髓间充质干细胞悬液,而其余2组均注射等量的磷酸盐缓冲液。移植后第2,5,8,11天评估各组大鼠溃疡创面的愈合率,应用酶联免疫吸附实验和反转录聚合酶链反应检测血管内皮生长因子的表达,应用苏木精-伊红染色法检测肉芽组织厚度。 结果显示,骨髓间充质干细胞移植后第2天,各组大鼠溃疡创面形成黄褐色或黑色干痂,痂皮较薄,创面周围稍有红肿,且有少许脓性分泌物;从第5天开始,创面炎症反应逐渐减轻,痂皮干燥,面积逐渐缩小;第8天时,有干痂脱落,露出新生表皮,但此时新生表皮尚无毛发覆盖。正常足溃疡对照组的溃疡创面愈合最快,第8天和第11天时骨髓间充质干细胞经小腿肌肉移植组溃疡创面愈合率明显高于糖尿病足溃疡对照组。苏木精-伊红染色检测显示第2天时,各组溃疡创面的肉芽组织厚度无明显差异,但均有大量炎性细胞浸润;第5天时,正常足溃疡对照组和骨髓间充质干细胞经小腿肌肉移植组溃疡创面的肉芽组织厚度相同,均比糖尿病足溃疡对照组厚;第8天时,各组大鼠的创面周围干痂下已有大量新生表皮形成,无肉芽组织,但皮下缺少毛囊和腺管等组织,仍属于不成熟表皮。正常足溃疡对照组和糖尿病足溃疡对照组血管内皮生长因子浓度在第8天达到高峰,而骨髓间充质干细胞经小腿肌肉移植组血管内皮生长因子浓度一直在增加,第11天时达高峰。第11天时骨髓间充质干细胞经小腿肌肉移植组血管内皮生长因子浓度明显高于正常足溃疡对照组,而正常足溃疡对照组血管内皮生长因子浓度则仍高于糖尿病足溃疡对照组。 蔡黔等[12]研究中将90只大鼠随机分为3组,正常足溃疡对照组、糖尿病足溃疡对照组和骨髓间充质干细胞移植治疗组,每组30只大鼠。正常足溃疡对照组大鼠建立足溃疡模型,糖尿病足溃疡对照组和骨髓间充质干细胞移植治疗组大鼠建立糖尿病足溃疡模型,并分别注射干细胞培养基DMEM和骨髓间充质干细胞。模型建立后第1,4,8天观察各组大鼠的创面溃疡面积和病理学检查,应用酶联免疫吸附实验检测外周血中血管内皮生长因子的表达,应用Western免疫印记检测局部血管内皮生长因子的表达情况。 结果显示,骨髓间充质干细胞移植后第1天,3组溃疡愈合无明显差异;第4天比较时各组间开始出现差异,正常足溃疡对照组创面愈合最快,而其他2组创面溃疡愈合无明显差异;第8天时正常足溃疡对照组创面溃疡较其他2组明显愈合快,而骨髓间充质干细胞移植治疗组较糖尿病足溃疡对照组创面愈合也明显较快。外周血血管内皮生长因子检测可见骨髓间充质干细胞移植后第1天,各组中血管内皮生长因子浓度无明显差异;第4天时正常足溃疡对照组外周血血管内皮生长因子浓度明显高于骨髓间充质干细胞移植治疗组和糖尿病足溃疡对照组,而骨髓间充质干细胞移植治疗组和糖尿病足溃疡对照组之间外周血血管内皮生长因子浓度无明显差异;第8天时正常足溃疡对照组外周血血管内皮生长因子浓度高于骨髓间充质干细胞移植治疗组,而骨髓间充质干细胞移植治疗组则高于糖尿病足溃疡对照组。病理切片可见模型建立后第1天,溃疡深度均为全层皮肤,第4天和第8天可见正常足溃疡对照组肉芽组织生长迅速,表皮覆盖完全,糖尿病足溃疡对照组可见创面溃疡愈合缓慢,表皮覆盖不完全,骨髓间充质干细胞移植治疗组创面溃疡较糖尿病足溃疡对照组愈合快,表皮覆盖较明显,但是与正常足溃疡对照组相比较愈合仍较慢。 上述3组实验研究中均给予正常大鼠腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病足大鼠模型,当检测随机血糖水平≥16.0 mmol/L,并出现多饮、多尿、体质量减轻等症状时,切除大鼠足部皮肤组织,建立糖尿病足模型。研究结果显示骨髓间充质干细胞移植可促进糖尿病足溃疡的愈合,其促进愈合的机制可能是通过上调局部、全身外周血中血管内皮生长因子的表达,从而促进局部微血管的形成,进而促进溃疡创面的愈合,达到有效治疗的作用。 2.2 骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足的临床应用研究 付汉东等[13]对骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足进行了临床应用研究,对30例糖尿病足患者血管内皮生长因子的变化以及血管内皮生长因子mRNA的表达水平变化进行了观察。30例患者中,男23例,女7例,年龄58-81岁,糖尿病病程5-17年。给予控制血糖、扩张血管、改善微循环等常规治疗后给予骨髓间充质干细胞移植治疗。结果显示,移植治疗前血管内皮生长因子和mRNA的表达水平分别为(165±36) ng/L和(1.7±2.3)×104 copy/μL,治疗后2,4,8,12周时分别为(336±39) ng/L和(38.7± 32.4)×104 copy/μL、(241± 46) ng/L和(76.4± 9.6)×104 copy/μL、(192±41) ng/L和(9.9± 1.2)×104 copy/μL、(167±31) ng/L和(4.8±3.6)× 104 copy/μL。各组间结果比较差异有显著性意义(P < 0.05)。 陈兵等[14]对骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足进行了临床应用研究,研究对象为40例糖尿病足患者,其中男22例,女18例,年龄(64.3±12.7)岁。按wagner分级,2级8例,主要表现为静息痛或间歇性跛行;3级18例,主要表现为不同程度的足部溃疡、化脓性瘘道形成;4级14例,其中伴有干性坏疽8例,湿性坏疽6例。按数字表法随机分为骨髓间充质干细胞移植治疗组22例,常规治疗组18例。常规治疗组给予降血糖、降压调脂、抗感染、抗凝、营养神经、扩张血管等药物治疗,局部常规换药,有坏疽者行截趾治疗;骨髓间充质干细胞移植治疗组在常规治疗基础上,按密度梯度离心和贴壁法分离制备骨髓间充质干细胞悬液,并予培养鉴定、扩增后行自体骨髓间充质干细胞移植。比较2组患者治疗效果,以及不良反应、并发症等发生情况。 结果显示,治疗后1个月,骨髓间充质干细胞移植治疗组患者肢体疼痛、冷感、间歇性跛行等症状均有改善,踝肱指数明显升高,双下肢血管显像血流灌注增加,与常规治疗组比较差异均有显著性意义。且移植后3个月随访患者均无异常症状体征出现,血、尿、便常规检测正常,心电图和肝肾功能无特殊改变,出凝血时间正常。 王秀慧等[15]同样对骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足进行了临床应用研究,研究对象为69例糖尿病足患者,其中男39例,女30例,年龄45-84岁。69例患者中,合并高血压42例,血脂异常59例,冠心病38例,脑血管病11例。所有患者均给予降血糖、降压、降血脂、改善循环、抗感染、抗凝、营养神经、局部理疗等常规治疗,组织破溃者给予局部清创换药等对症处理,待局部感染控制后,破溃处组织新鲜或愈合后进行骨髓间充质干细胞移植治疗。 结果显示,所有患者膝以下溃疡共43处,合并感染36例,截趾16个,行单侧肢体骨髓间充质干细胞移植26例。如创面较新鲜无明显感染表现可同时行截趾后予骨髓间充质干细胞移植治疗。部分经清创后创面组织新鲜,给予骨髓间充质干细胞移植,7-25 d后创面即可达到Ⅰ级愈合。双下肢CT血管成像、双下肢血管造影显示股浅动脉狭窄34例,闭塞2例;腘动脉狭窄74例,闭塞6例;胫前动脉狭窄89例,闭塞57例;胫后动脉狭窄74例,闭塞67例;腓动脉狭窄81例,闭塞67例;足背动脉狭窄62例,闭塞47例。与治疗前相比较,治疗后3个月踝肱指数升高0.1有12条肢体,升高0.2有24条肢体,升高0.3有10条肢体,降低0.1有25条肢体,降低0.2有19条肢体,降低0.3有17条肢体;治疗后6个月踝肱指数升高0.1有19条肢体,升高0.2有27条肢体,升高0.3有18条肢体,降低0.1有18条肢体,降低0.2有12条肢体,降低0.3有5条肢体。对随访患者进行治疗前后主观症状评分和客观指标比较,治疗前、移植治疗后3个月、6个月,自觉疼痛症状评分分别为(2.8±1.7),(2.4±1.4),(2.1±1.3)分,冷感评分为(2.0±1.0),(1.8±0.8),(1.6±0.7),间歇性跛行评分为(2.4±1.3),(2.1±1.2),(1.4±1.1)分,各项指标治疗后评分均明显降低。测试皮肤温度分别为(22.2±5.0),(24.4±5.9) ,(24.7±5.5) ℃,经皮氧分压分别为(20.1±3.5),(24.5±4.1),(25.2±5.7) kPa,皮肤温度和经皮氧分压在治疗后3个月与6个月比较结果差异无显著性意义,治疗后3个月与治疗前比较结果差异具有显著性意义。骨髓间充质干细胞移植治疗后1-7 d内部分患者自觉移植下肢有发热感,并且疼痛、麻木、发凉症状减轻,但一两周后上述自觉症状消失,所有患者随访6个月期间内无死亡病例,无心脑血管疾病发生,肝肾功能和出凝血时间等无特殊改变,无其他不良症状发生。 陆德宾等[16]和陈玲珍等[17]分别对1例骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病足进行了研究。陆德宾等[16]研究中1例患者为女性,66岁,15年糖尿病史,检查时可见左足深达真皮层的溃疡面,左侧肢体症状分级,疼痛4级,冷感3级,间歇性跛行4级,左足踝肱指数0.65。给予扩血管、改善循环、降血糖、抗感染等常规治疗,4周后给予骨髓间充质干细胞移植左侧小腿肌肉注射治疗,观察患者创面溃疡愈合情况。 结果显示,移植时和移植后4周,左侧肢体症状分级疼痛分别为4级和1级,冷感分别为3级和1级,间歇性跛行分别为4级和1级,左足踝肱指数分别为0.66和0.79。移植时,左足外侧、前背的溃疡面为3.0 cm× 3.0 cm、2.0 cm×3.5 cm,移植7 d后溃疡创面基本愈合。 陈玲珍等[17]研究中1例患者为女性,64岁,糖尿病史3年,合并有血脂异常和高血压病,检查时可见右足趾干性坏疽,右足底见深达真皮层的溃疡面,伴有恶臭味,且右足背动脉搏动消失。按wagner分级为Ⅳ级,下肢血管彩色多普勒检查见右下肢各段动脉均有不同程度的狭窄或闭塞,足背动脉全部闭塞。右侧肢体症状分级,疼痛4级,冷感3级,间歇性跛行4级,右足踝肱指数0.31。给予骨髓间充质干细胞移植治疗,同时给予控制血糖、扩张血管、改善微循环、降压、降脂以及清创等治疗,观察患者溃疡创面愈合情况。 结果显示,骨髓间充质干细胞移植3个月后患者疼痛、冷感明显缓解,麻木症状改善,移植治疗6个月后,疼痛消失,踝肱指数明显升高,创面溃疡完全愈合,且行走间距延长,下肢动脉造影CT三维重建及彩色多普勒检查可见患肢有明显的新生侧支血管、血流明显改善。治疗过程中无心、肺、肝、肾等重要器官功能的损伤。随访14个月,未见相关并发症等不良反应发生。"
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