In vitro pre-vascularized tissue-engineered bone

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.018

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Tissue-engineered bone, as an emerging method, is used to repair bone defects, but it is difficult to be used widely because of no nutrient metabolism of implants. Pre-vascularized tissue-engineered bone research is performed for this limitation. Forward-looking and procedural vascular construction prior to artificial grafting is perspective to supply the nutrient metabolism of implants.
OBJECTIVE: To analyze the research results and developmental tendency of pre-vascularized bone engineering in vitro using a multilevel analysis.
METHOD: Literature search was performed in CNKI database for Chinese literatures and PubMed database for English literatures from 2000 to 2012. The key words included “tissue-engineered bone, vascularization, implant, osteoblasts, endothelial cells, co-culture” in Chinese, and “bone engineering, endothelial cells, osteoblast, implant, cells co-culture” in English. A review addressing pre-vascularized tissue-engineered bone was completed based on retrieved literature classified according to bone physiological studies, in vitro experimental research and material research.
RESULTS AND CONCLUSION: Totally 60 articles were included in result analysis. Studied have documented that microvascular regeneration in normal bone tissue has an important role in osteogenesis regulation. Current bone tissue engineering research is to simulate this physiological process of vascular regeneration in the human body, and lots of in vitro studies are designed to complete this angiogenic process in bone tissue engineering. It is confirmed that in vitro pre-vascular work is used for bone tissue engineering, especially for in vivo survival and ossification of tissue-engineered bone, pointing out the developmental direction for the clinical application of tissue-engineered bone.

Key words: tissue construction, tissue construction review, bone tissue construction, tissue-engineered bone, vascularization, revascularization, in vitro pre-vascularization, vascular endothelial cells, osteoblasts, stent implantation, co-culture, provincial grants-supported paper

CLC Number:

R318

Li Yan, Zhang Jian-she, Dong Xiu-hua . In vitro pre-vascularized tissue-engineered bone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.018.

Figures/Tables 1

2.1 血管再生在体内成骨中的意义在人体正常骨组织中，血管不仅为骨组织提供营养支持，同时血管与成骨相关细胞之间的调控也是维持骨骼代谢稳定的一个必要条件。因此，在组织工程骨的研究中，血管是一个值得重视的因素。组织工程骨的预血管化，能够提高种子细胞的存活率，从而保证人工支架材料植入后的活性和组织相容性。 2.1.1 骨组织重建与血管化在人体正常骨组织中，骨骼的微血管系统对于骨形成、骨代谢、骨修复和重建具有重要的生理意义。组织解剖研究成果显示骨祖细胞通常位于血管周围，在骨祖细胞周围有大量网状细胞呈窦样分布，分泌炎症趋化因子和基质细胞激活因子促进了骨祖细胞的分化成熟[2]。不论是膜内成骨或是软骨成骨，其骨发生都与血管的再生有着密切的关系，在膜内成骨过程中，微血管的侵入将运输骨髓间充质干细胞进入骨折区域，最终分化成为成骨细胞，分泌骨基质完成骨骼重建；在软骨成骨过程中，随着微血管的侵入，软骨板最终被血管化的骨板所替代，在此过程中未分化的增殖旺盛的软骨细胞产生大量的血管生成抑制因子，而肥大软骨细胞产生大量的促血管生成因子，诸如血管内皮生长因子和纤维生长因子，两方面的拮抗作用保证了血管再生的方向性和目的性。肥大软骨细胞和骨形成细胞共同分泌基质金属蛋白酶，程序性降解细胞外基质，允许血管长入。其中基质金属蛋白酶9作用肥大软骨细胞释放血管内皮生长因子A，通过成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞膜表面的血管内皮生长因子A受体发挥生物学效应[3]。因此，在骨痂愈合过程中，新生血管不仅为骨痂修复区的细胞募集建立了通道，同时构建血管的内皮细胞也产生细胞生长因子，激活了成骨所需的骨髓间充质干细胞并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。新生血管在骨痂修复重建的不同时期扮演者不同的角色。在骨痂形成最早的血肿期，原有血管的破裂和瓦解导致了骨痂局部的缺氧环境[1]，随之而来的炎症反应激活了炎症因子和生长因子的分泌，从而募集了骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞到达骨折部位[1, 4]。在骨痂中期的形成期，血管源性生长因子参与到骨痂形成，尤其是对血管内皮生长因子研究得相对透彻[5]。研究证实，血管内皮生长因子在软骨成骨过程中的促成骨效应与cbfa-1/runx-2的激活有密切关系[6]，而骨形成蛋白2，4，6和转化生长因子β1则参与了血管内皮生长因子的上游调控[7]。在最后的骨痂改建期，新生血管承担了双向调控作用。在骨质吸收方面，血管运送前体破骨细胞到骨改建位点，发挥骨质吸收的作用；在基质形成方面，血管则运送前体成骨细胞完成了骨基质的沉淀效应。 2.1.2 组织血管化的启动因子和抑制因子骨组织中的血管再生通常伴随了3个步骤：①血管内皮细胞从成熟血管萌芽增殖。②从管腔样结构向血管结构的改建。③血管成熟及后继的静态诱导[8]。在此过程中，血管生成相关细胞因子参与了对血管内皮细胞的受体作用。在骨折形成后的低氧环境诱导下，迁徙到骨折部位的单核细胞和巨噬细胞所分泌的血管内皮生长因子与血管萌芽最为密切[9]。同时低氧环境诱导血管生成素2与内皮细胞的受体络氨酸激酶结合，使血管内皮细胞对血管内皮生长因子的敏感性增加，最终使血管内皮细胞膜表面的血管内皮生长因子受体VEGFR-1 (Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)活化，完成细胞调控作用。此外，血管生成素及相关受体Tie-1和Tie-2同样调控了骨折愈合过程中血管内皮细胞的血管再生。最新研究发现，与血管发生相关的各类调控因子还包括了各类细胞炎症因子和生长因子，例如纤维生长因子、基质金属蛋白酶、肝细胞生长因子和血小板衍生因子等，上述生长因子在血管内皮细胞的迁徙、诱导、增殖和细胞基质形成中起着重要的调控作用[10-15]。 2.1.3 血管内皮细胞和成骨细胞之间的交互调控机制血管内皮细胞和成骨细胞之间存在有以下3种交互调控通道：①紧密相邻血管内皮细胞和成骨细胞间细胞膜的分子连接调控。②相邻细胞间的缝隙连接调控。③细胞旁分泌产生调控因子的间接调控。实验研究表明缝隙连接中，Cx43双向介导了血管内皮细胞和成骨细胞之间的调控作用，而Cx40则单向介导了血管内皮细胞的调控作用[16]。在血管内皮细胞和成骨细胞共培养实验中发现了大量的具有调控作用的细胞因子，包括血小板衍生因子，转化生长因子β1，转化生长因子β2，成纤维细胞生长因子2，骨形成蛋白2，表皮生长因子和骨保护素等[17]。血管内皮细胞在肿瘤坏死因子，白细胞介素1β和内毒素等炎症因子的作用下，能够合成分泌内皮缩血管肽促进骨形成，同时也能分泌白细胞介素6或RANKL促进骨吸收[18-19]；反之，骨髓间充质干细胞能够分泌血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生因子和胰岛素样生长因子等血管源性生长因子促进血管生成。因此，在共培养环境下成骨细胞的碱性磷酸酶和血管内皮细胞的Ⅰ型胶原蛋白均有显著上调[20-21]。研究发现在聚已酸内酯支架上共培养的血管内皮细胞和成骨细胞，其交互调控作用具有严格的时效性。在共培养的早期，血管内皮细胞形成单细胞层覆盖于成骨细胞表面；21 d后，血管内皮细胞在成骨细胞之间形成管腔样结构。同时该实验还发现，共培养环境中血管内皮生长因子浓度出现了3次截然不同的变化趋势，在7-14 d中，血管内皮生长因子浓度呈现上升趋势；14-28 d中，血管内皮生长因子浓度处于平台期；在28-35 d中，血管内皮生长因子浓度呈现下降趋势；而在成骨细胞单独培养过程中，1-28 d血管内皮生长因子浓度呈现稳定的小幅度上升趋势，在28 d后出现下降[20]。 2.2 血管内皮细胞血管内皮细胞根据其收获的血管类型不同，可以分作大血管内皮细胞和微血管内皮细胞两大类。 2.2.1 人脐静脉血管内皮细胞和其他大血管内皮细胞人脐静脉血管内皮细胞是大血管内皮细胞中最为研究者所熟知的一类细胞，而其他类型的血管内皮细胞还包括从人体隐静脉、牛和猪的主动脉或肺动脉中获取的血管内皮细胞，后者很少用于组织工程骨的实验研究中[22]。 2.2.2 微血管内皮细胞人体的微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells, HMVEC)可以从脂肪组织、真皮和肺组织中获取[22-24]，此类血管内皮细胞与大血管内皮细胞有着很大的细胞生物学差异，且各类微血管内皮细胞的生物学性质也各不相同。在组织工程研究中，微血管内皮细胞具有较人脐静脉血管内皮细胞更为贴近骨组织微血管形态的优势，微血管内皮细胞在今后的临床应用中也具有显著的取材容易的特点。 2.2.3 血管内皮祖细胞血管内皮祖细胞是一类可以分化成为成熟血管内皮细胞的成体干细胞，可以通过对其表面3类特异性标志物(CD133，CD34和VEGFR-2)进行分离[25-26]。血管内皮祖细胞主要位于人体骨髓中，并能够释放到外周血[27]，在正常人体血液的单核细胞中占到0.000 1%-0.01%的比例[28]。在体外实验中根据不同的细胞形态，血管内皮祖细胞可以划分为早期血管内皮祖细胞和晚期血管内皮祖细胞两大类，早期血管内皮祖细胞为纺锤形细胞，通常在4周以后死亡，晚期血管内皮祖细胞出现较晚，呈现铺路石样的卵圆形，通常可以存活至12周以上。血管内皮祖细胞在临床治疗上较其他血管内皮细胞具有先天的优势，现已有心肌缺血性坏死和肝脏疾病通过血管内皮祖细胞达到临床治疗效果的报道。有体内实验证实，在骨折区域新生微血管中血管内皮祖细胞的浓度高达5%-35%，较正常外周血中的血管内皮祖细胞有数量级的提升[29]。组织工程骨研究中血管内皮祖细胞的优势取决于其促成骨和成血管化两方面的能力[30-31]，因为CD34+细胞不仅具有成骨和成血管双向分化能力，同时CD34+细胞还能够分泌血管内皮生长因子等生长因子[32]。因此，血管内皮祖细胞在组织工程骨中正得到更为深入的研究和重视。 2.2.4 血管内皮细胞株体外培养的原代血管内皮细胞，在经历一段时间后会出现增殖能力下降的现象，因此，目前有来源于血管肿瘤或转基因的永生血管内皮细胞用于体外实验。ISO-HAS细胞株就是一类典型的来源于肿瘤的衍生血管内皮细胞株，而HAEND细胞株则来源于肝脏的血管肉瘤[33]；通过细胞转染技术可获得永生性血管内皮细胞株，包括人脐静脉血管内皮细胞转染来源的EVLC2，人真皮微血管内皮细胞转染来源HMEC-1，和人肺微血管内皮细胞转染来源的HPMEC-ST1.6R[34]。此类细胞具有原代培养的血管内皮细胞基本结构和某些细胞学特性，能够表达血管内皮细胞所具有的特异性蛋白，且能在基质胶表面形成管型。但是也有部分细胞生物学性状发生了改变，例如该类细胞在细胞黏附因子1的炎症因子诱导表达上出现了差异[35-36]。 2.3 血管化支架未预血管化处理的组织工程骨在植入人体的过程中，由于缺乏正常的微血管系统，无法提供组织营养和发挥成骨诱导作用，仅仅通过外源性血管侵入，植入的组织工程骨形成正常骨质通常不会超过植入体表面的1 mm[37]，而且，由炎症反应所构建的侵入性微血管系统也会在数周之内消失[38]。在缺乏血管供应的情况下，植入体的营养供给仅能依靠组织液的弥散作用，而该弥散作用的有效范围仅仅有100-200 μm的距离，大量组织工程骨内部细胞将面临缺乏营养支持和代谢产物堆积的问题[38-39]。因此，建立预血管化的组织工程骨，并迅速完成该预成型系统与支架外周受体血供之间的对接，是目前解决组织工程骨植入存活率的首要问题[40]。血管化的组织工程骨支架，不仅仅能够提供成骨细胞合成骨基质的空间，同时要支撑血管内皮细胞黏附和生长，并能够诱导血管内皮细胞发育成为功能血管，为植入细胞提供营养和氧气。一个成功的血管化组织工程骨支架具备有以下特点：①血管内皮细胞能够移行到支架表面。②血管内皮细胞能够顺利的从支架表面移行到支架内部。③能够让外源性血管内皮细胞黏附和生长。④有利于血管内皮细胞合成细胞基质。⑤血管内皮细胞可形成管型结构。⑥能够募集其他细胞形成血管壁。⑦有利于与周围组织构成血管网。此外，血管内皮细胞移行到支架上还应当保持正常的生理形态，并不会形成炎症反应。 2.3.1 血管内皮细胞的植入在血管内皮细胞植入到人工支架之前，通常支架会被培养液浸泡数小时，以便于细胞蛋白质与支架表面相互贴附，从而使血管内皮细胞能够顺利贴附和生长。以下技术保证了细胞植入能够顺利完成：滴加细胞培养液在支架表面，置于37 ℃环境下15-30 min，然后再加入细胞培养液，而支架表面往往会涂布明胶、纤维蛋白、胶原蛋白或血清以利于细胞生长[41]。 2.3.2 血管内皮细胞形态学变化移植后支架上的细胞形态学可以通过电镜或激光共聚焦等技术进行检测，后者通常要求对血管内皮细胞的特异性蛋白进行荧光染色，例如CD31进行免疫荧光染色，或是使用钙黄绿素、吖啶橙等荧光染料对细胞直接着色后观察[42]。血管内皮细胞骨架通常是使用F-actin或是波形蛋白进行标记[43]。血管钙黏附蛋白是介导血管内皮细胞间连接的一类重要蛋白，在维护血管完整性中具有重要的意义，在植入支架中的细胞钙黏附蛋白表达量决定了血管内皮细胞是否能够成功附着支架[44]。虽然通过显微电镜和激光共聚焦显微镜的观察，可以发现细胞与支架之间的形态学关系，但是要判定贴附细胞的生物学改变却需要其他的分析手段。 2.3.3 血管内皮细胞贴附和迁徙由于人工支架能够作用细胞合成各类蛋白，包括CD31、血管钙黏蛋白和整联蛋白，影响细胞在受床上的黏附，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽等多肽类物质已被学者结合在支架上，以利于血管内皮细胞或成骨细胞的黏附，此类多肽物质能够有效结合各类细胞所分泌的黏附分子[45]。可对以上各类黏附分子免疫荧光物标记，然后通过激光共聚焦的手段进行检测，从而反映出细胞在支架上的黏附情况。该类定量分析常采用酶联免疫法对细胞黏附分子进行直接检测，而流式细胞仪检测则是另一类常用方式，但是后者通常在检测前需要将细胞从支架上剥离下来，导致细胞表达情况出现失真。此外，还可以使用RT-PCR技术从相关黏附蛋白的mRNA的层面对其进行检测。 2.3.4 血管内皮细胞增殖对DAPI或钙黄绿素着色细胞的镜下观察，可以粗略反映血管内皮细胞在支架上的增殖情况，而Amalar染色可以通过其蓝色到红色的色谱变化，反映细胞培养环境的氧化还原状况，从而间接检测细胞增殖情况[46]。通过对已知种类血管内皮细胞在某一人工支架上的增殖曲线，能够粗略估计未知种类血管内皮细胞在该人工支架上的增殖状况[47]。此外，还可以通过胸腺嘧啶脱氧核苷放射同位素标定或MTT法对细胞增殖情况进行分析[48-49]。 2.3.5 血管内皮细胞管腔形成血管内皮细胞管腔样结构形成的数量和质量，同样可以评估细胞在支架上的生长情况。当血管内皮细胞被接种于诱导型的基质中(多数实验中基质也用于包被支架)，无论该基质是否含有血管生长因子，在数小时之后血管内皮细胞便可以形成管腔样结构，对细胞核进行染色便可以观察，通过对管型的数量，长度和分支计数可以进行量化分析，从而鉴别细胞在某一类支架上的生长特性。目前用于构建血管内皮细胞植入基质包括细胞基质胶、Ⅰ型胶原蛋白等，有文献报道在Ⅰ型胶原蛋白所构成的细胞基质中，20 h后便可观察到有类似毛细血管样的管型形成[50]。 2.3.6 血管内皮细胞促成骨类蛋白的表达由于复合血管内皮细胞的支架最终是用于构建组织工程骨，因此，血管内皮细胞所表达分泌的促成骨类蛋白或炎症因子是研究分析的重点。通常该类因子的检测都是从mRNA和蛋白两个层面进行检测的，而检测的手段包括PCR和Western-blot两大类，此外细胞培养液的ELISA检测也是常用的手段之一。细胞黏附于生物材料表面，通常会受到促炎症因子的作用，因此，有实验研究对细胞促炎症因子的表达，在基础环境和脂多糖诱导环境下分别进行了研究[36]。 2.4 共培养体系经过几十年的研究发展，目前血管内皮细胞-成骨细胞共培养体系已经有了详尽的划分，根据培养方式的不同，分为了直接共培养和间接共培养两大类，其中直接共培养又根据培养环境不同，分为了2D培养、3D培养和球形培养等多种，而间接共培养根据细胞介质共享不同，分作透膜共培养、培养液交换共培养和细胞外基质交换共培养等[51]。在直接共培养条件下，血管内皮细胞-成骨细胞之间的调控关系与体内环境下更为类似。在2D培养环境下，细胞间分子水平的交互作用得到了详尽解释，同时还发现了在该环境作用下成骨细胞分化成熟的差异；3D环境则为血管内皮细胞-成骨细胞提供了有利的物理环境，大量血管化的进程和原理得到阐述；球形共培养是将血管内皮细胞-成骨细胞培养于含有20%甲基纤维素的培养基中，置于U形培养皿中，形成半圆形球体，在经过一段时间的共培养后，成骨细胞形成球体的核心，而血管内皮细胞则覆盖于该核心的表面[52]。成功的血管内皮细胞-成骨细胞共培养，通常需要考虑以下几个问题：①选择正确的培养基。②是否同时植入两种细胞，还是先植入某一类。③两种细胞的比例。④在实验过程中和实验结束后如何有效的分离细胞。就培养液而言，血管内皮细胞的培养液对营养要求较高，通常会选择适合血管内皮细胞培养的培养液作为共培养的培养液。目前常使用的培养顺序是先植入血管内皮细胞，或血管内皮细胞和成骨细胞同时植入。血管内皮细胞-成骨细胞共培养比例有较大的分歧，有学者在使用人皮肤微血管内皮细胞-成骨细胞共培养时，采用的比例是5∶1或10∶1[46]，而作者在人脐静脉内皮细胞-MG-63的共培养体系中，发现1∶1的细胞比例能够获得较好的实验效果[53]。共培养细胞的分离包括观察过程的视觉分离和检测的物理分离。前者可以通过共培养前某一类细胞的荧光染色，或共培养后某一类细胞的特异性标志物的免疫荧光染色来进行区分，例如针对血管内皮细胞选取CD31染色，针对成骨细胞使用碱性磷酸酶染色。物理分离常用的方法则是免疫磁珠选择，然后通过流式细胞仪进行甄别。间接共培养的目的在于，让血管内皮细胞-成骨细胞之间能够有代谢产物或分泌因子之间的影响，但是避免细胞之间发生直接作用，主要用于对细胞旁分泌作用的实验阐述。尽管经过长时间的科学研究工作，阐明了大量共培养的细胞形态学问题和分子生物学机制，但是由于血管内皮细胞和成骨细胞均是上皮来源型细胞，在代谢产物和细胞因子分泌上有大量的交集，实际上应用现有的实验方法，仍无法从蛋白层面上阐述清楚某一成骨或成血管因子的改变究竟是来源于何种细胞。例如研究最为透彻的血管内皮生长因子，在共培养环境下血管内皮细胞和成骨细胞均有表达，其培养液中发现外源性血管内皮生长因子上调，究竟是说明了血管内皮细胞分泌血管内皮生长因子促进了成骨细胞的成骨样分化，还是说明了成骨细胞分泌血管内皮生长因子促进了血管内皮细胞的血管化？因此，血管内皮细胞-成骨细胞共培养体系尚需要大量的基础理论有待于进一步深入研究。最为有趣的实验现象是，当血管内皮细胞和成骨细胞共培养后植入人工支架后，可以降低对支架的技术要求，甚至细胞可以直接植入到没有基质覆盖的支架表面。在共培养环境下，血管内皮细胞可以直接在支架的网眼上形成管型样结构；但是当血管内皮细胞单独移植到同一类支架之上，无论是否加入促血管生成因子，都不可能再形成管型样结构[46]。 2.5 促血管化因子的释放生物材料的血管化可以通过在支架上植入成熟血管内皮细胞或血管内皮细胞前体细胞完成[54]，同样可以通过支架局部释放促血管化生长因子，在体内诱导血管内皮细胞迁徙进入和生长[50]，从而达到血管化的目的。 2.5.1 支架材料的生长因子释放目前的人工生物支架材料不仅能够在体内降解，同时可以释放各类生长因子，从而良好模拟体内的组织重建过程。研究发现支架材料在复合重组人血小板源性生长因子BB和血管内皮生长因子165后，能够有效启动并促进组织工程骨的血管化进程，在体内实验中发现能够提高新生血管的数量[55]。小鼠颅骨缺失的动物模型中，植入复合人重组血管内皮生长因子A的聚乳酸支架，其骨缺损部位的新生血管数量、骨质形成和矿化密度均高于单独植入聚乳酸支架的对照组[56]。血管内皮生长因子A在体内释放后，骨折模型的血管再生通常先于骨质形成，同时这一血管再生促进了后继的骨基质沉淀和骨矿化过程。但也有学者研究发现，局部应用血管内皮生长因子A能够促进兔胫骨骨折区域的血流形成，但是对后继的骨矿化和骨痂的组织学评定并无显著意义[57]，这一现象的可能因素是机体在骨折发生后，骨折区域的血管内皮生长因子A含量已经达到了一个峰值，因此再次增加局部的血管内皮生长因子A含量将不再具有治疗意义。 2.5.2 富含血小板血浆使用富含血小板血浆同样是一种可靠的血管生长因子的释放方法。机体中活性血小板能够刺激血小板源性生长因子，转化生长因子β，胰岛素样生长因子，纤维生长因子和血管内皮生长因子等促成骨或促血管分化因子的分泌，因此经过凝血酶活化的自体血细胞板，同样被当做一类生长因子促进组织的修复重建。富血小板血浆目前被广泛用于组织工程骨的实验中，用于促进移植于支架上的血管内皮细胞或血管内皮细胞-成骨细胞的种子细胞分化和增殖[58]。 2.5.3 基因转染体外细胞的基因转染技术，让骨髓间充质干细胞能够通过转染特异性基因自体形成血管生成因子，从而使细胞在整个移植过程能够持续释放生长因子[59]。实验证实当血管内皮生长因子的cDNA转染到脂肪干细胞后，与血管内皮细胞联合移植在聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架上，能够形成促进移植物的血管生成[60]。"

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