彝药斯赤列二氯甲烷提取物干预骨关节炎模型大鼠的作用及机制

doi:10.12307/2026.712

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (12): 3014-3028.doi: 10.12307/2026.712

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彝药斯赤列二氯甲烷提取物干预骨关节炎模型大鼠的作用及机制

陆玉春1，朱紫陌1，2，李朝梦1，刘桔1，江自鲜1，李秀芳1，王涛3，王文静1

云南中医药大学，1中药学院，2云南省傣医药与彝医药重点实验室，云南省昆明市 650500；3昆明市中医医院骨伤科，云南省昆明市 650051

收稿日期:2025-04-03 接受日期:2025-08-31 出版日期:2026-04-28 发布日期:2025-09-29
通讯作者: 王文静，博士，教授，博士生导师，云南中医药大学中药学院，云南省昆明市 650500 共同通讯作者：王涛，硕士，副主任医师，昆明市中医医院骨伤科，云南省昆明市 650051
作者简介:陆玉春，男，1998年生，云南省玉溪市人，云南中医药大学中药学院在读硕士，主要从事中药药理与应用研究。共同第一作者：朱紫陌，女，1998年生，云南省昆明市人，云南中医药大学在读博士，主要从事中药药理与应用研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区基金项目(82160744)，项目负责人：王文静；云南省宋少江专家工作站(202305AF150030)，项目负责人：王文静；彝药斯赤列治疗骨关节炎的临床前预研究(30272110298)，项目负责人：王文静；国家中医药管理局“十二五”重点学科—傣药学(024SS24011)，项目负责人：朱紫陌

Effect and mechanism of dichloromethane extract of fresh Sambucus adnata Wall. in rat osteoarthritis models

Lu Yuchun1, Zhu Zimo1, 2, Li Chaomeng1, Liu Ju1, Jiang Zixian1, Li Xiufang1, Wang Tao3, Wang Wenjing1

1School of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 2Yunnan Key Laboratory of Dai and Yi Medicines, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 3Department of Orthopedics, Kunming Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650051, Yunnan Province, China

Received:2025-04-03 Accepted:2025-08-31 Online:2026-04-28 Published:2025-09-29
Contact: Wang Wenjing, PhD, Professor, Doctoral supervisor, School of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China Co-corresponding author: Wang Tao, MS, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Kunming Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650051, Yunnan Province, China
About author:Lu Yuchun, MS candidate, School of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China Zhu Zimo, PhD candidate, School of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China; Yunnan Key Laboratory of Dai and Yi Medicines, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China Lu Yuchun and Zhu Zimo contributed to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Regional Program), No. 82160744 (to WWJ); Song Shaojiang Expert Workstation in Yunnan Province, No. 202305AF150030 (to WWJ); A Preclinical Study of Sambucus adnata Wall. in the Treatment of Osteoarthritis, No. 30272110298 (to WWJ); 12th Five-year Key Construction Discipline of State Administration of Traditional Chinese Medicine - "Dai Pharmacy," No. 024SS24011 (to ZZM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
斯赤列：彝药斯赤列(Sambucus adnata Wall.)为忍冬科(Caprifoliaceae)接骨木属(Sambucus Linn)植物，广泛分布于云南、西藏等地，以干燥地上部分或全草入药，又名接骨药、接骨丹、大血草、血管草等，彝族人民常将斯赤列用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、骨折、黄疸、荨麻疹和水肿等。
骨关节炎：是一种退行性疾病，以关节软骨退化、软骨下骨硬化、关节边缘骨赘生成以及滑膜炎为主要病理特征，主要临床表现为关节疼痛、肿胀、活动受限、关节畸形及功能丧失等，发病因素多与年龄、性别、基因、肥胖及损伤有关。

背景：课题组前期研究结果显示彝药斯赤列鲜品甲醇及二氯甲烷提取物具有抗炎、抗氧化、抗血管新生等作用，抗骨关节炎活性明显。
目的：探究彝药斯赤列(鲜品)二氯甲烷提取物(fSAW-DCE)对骨关节炎的保护作用及机制。
方法：①前交叉韧带切断法复制大鼠骨关节炎模型，术后连续灌胃斯赤列二氯甲烷提取物干预6周，ELISA检测关节腔液中肿瘤坏死因子α水平，苏木精-伊红染色观察关节软骨病理变化，计算关节软骨矿化程度，Micro CT影像学检查骨赘增生及软骨下骨骨量变化。②以小鼠胚胎瘤细胞ATDC5为研究对象，用胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠和维生素C将其诱导分化为软骨细胞，用白细胞介素1β刺激复制软骨细胞炎症模型，然后给予斯赤列二氯甲烷提取物干预，ELISA试剂盒检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α水平，RT-qPCR检测蛋白聚糖及Ⅱ型胶原mRNA表达。③转录组测序方法检测斯赤列二氯甲烷提取物干预软骨细胞炎症模型后的差异基因，探究作用机制。
结果与结论：①斯赤列二氯甲烷提取物可抑制关节炎症，降低关节腔液中肿瘤坏死因子α水平(P < 0.05)，延缓关节软骨矿质化(P < 0.05)，减轻关节软骨损伤，维持软骨下骨骨量(P < 0.05)；②斯赤列二氯甲烷提取物可减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症(P < 0.05)，维持软骨细胞外基质中Ⅱ型胶原mRNA表达水平(P < 0.05)；③转录组学测序及验证结果显示斯赤列二氯甲烷提取物抗骨关节炎的作用与抑制肿瘤坏死因子/核因子κB信号通路的激活有关。
https://orcid.org/0000-0002-4767-5350(王文静)；https://orcid.org/0009-0009-2043-1995(王涛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 斯赤列, 二氯甲烷提取物, 骨关节炎, 关节软骨, 炎症, 核因子κB, 肿瘤坏死因子, 转录组学, Ⅱ型胶原

Abstract: BACKGROUND: The previous study conducted by the research group demonstrated that the methanol and dichloromethane extract of fresh Sambucus adnata Wall. (fSAW-DCE) exhibits anti-inflammatory, anti-oxidation, anti-angiogenesis properties, and shows significant anti-osteoarthritis activity.
OBJECTIVE: To investigate the protective effects and underlying mechanisms of fSAW-DCE on osteoarthritis.
METHODS: (1) The rat osteoarthritis model was replicated by anterior cruciate ligament transection. Following the operation, fSAW-DCE was administered intragastrically for a duration of 6 weeks. The concentration of tumor necrosis factor-α in the joint lavage fluid was evaluated. Hematoxylin-eosin staining was employed to observe the pathological changes of the articular cartilage, and the degree of mineralization of the cartilage was quantified. Micro-CT was used for imaging examination of osteophyte proliferation and changes in bone mass of the subchondral bone. (2) Insulin, transferrin, sodium selenite, and vitamin C were used to differentiate the mouse embryonic tumor cell line ATDC5 into chondrocytes. The chondrocyte inflammation model was replicated by interleukin-1β stimulation. Following this, the cells were treated with fSAW-DCE. The content of tumor necrosis-α in the cell supernatant was detected by ELISA kit, and the expression of Aggrecan and type II collagen mRNA was detected by RT-qPCR. (3) Transcriptome sequencing method was used to detect the differential genes after fSAW-DCE intervention in the ATDC5 cell inflammatory model, and to explore its mechanism.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) fSAW-DCE demonstrated the capacity to suppress joint inflammation, decrease the level of tumor necrosis factor-α in the joint fluid (P < 0.05), retard mineralization of the articular cartilage (P < 0.05), mitigate cartilage injury, and maintain subchondral bone volume (P < 0.05). (2) fSAW-DCE could alleviate inflammation in ATDC5 chondrocytes induced by interleukin-1β (P < 0.05) and preserve the mRNA expression of type II collagen in the extracellular matrix of chondrocytes (P < 0.05). (3) Transcriptome sequencing and subsequent verification indicated that the anti-osteoarthritis effects of fSAW-DCE may be associated with inhibiting the tumor necrosis factor/nuclear factor-κB signaling pathway.

Key words: Sambucus adnata Wall, dichloromethane extract, osteoarthritis, articular cartilage, inflammation, nuclear factor-κB, tumor necrosis factor, transcriptomics, type II collagen

中图分类号:

陆玉春, 朱紫陌, 李朝梦, 刘桔, 江自鲜, 李秀芳, 王涛, 王文静. 彝药斯赤列二氯甲烷提取物干预骨关节炎模型大鼠的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(12): 3014-3028.

Lu Yuchun, Zhu Zimo, Li Chaomeng, Liu Ju, Jiang Zixian, Li Xiufang, Wang Tao, Wang Wenjing. Effect and mechanism of dichloromethane extract of fresh Sambucus adnata Wall. in rat osteoarthritis models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(12): 3014-3028.

图/表（结果） 16

2.1 实验动物数量分析参与实验SD大鼠40只，均进入结果分析。
2.2 Micro CT影像学检查结果 CT结果显示假手术组大鼠关节面光滑，无明显损伤，无骨赘生成；与假手术组相比，模型组大鼠关节表面粗糙，有明显骨赘生成，关节间隙变窄；与模型组相比，经塞来昔布及低、高剂量fSAW-DCE干预后关节面较光滑，骨赘生成减少，关节损伤减轻，关节间隙变宽，见图1。
与假手术组相比，模型组大鼠骨体积、骨体积分数、骨小梁厚度、骨密度显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，塞来昔布组骨体积、骨体积分数、骨小梁厚度显著升高(P < 0.05)，fSAW-DCE低剂量组骨体积、骨体积分数、骨小梁厚度、骨密度显著升高
(P < 0.05，P < 0.01)，fSAW-DCE高剂量组骨体积分数显著升高(P < 0.05)，见表5。
2.3 fSAW-DCE对骨关节炎大鼠关节软骨病理形态的影响苏木精-伊红染色结果显示，假手术组大鼠膝关节软骨染色均匀，软骨表面光滑平整无明显损伤，软骨组织完整，软骨细胞排列整齐，潮线完整，未见异常改变；模型组大鼠软骨厚度明显变薄，软骨破坏明显，中间区域着色较浅，潮线结构消失，软骨细胞排列散乱并伴有簇集的现象，软骨层厚度变薄，软骨细胞数量明显减少；塞来昔布组软骨形态有明显改善，软骨结构完整，软骨细胞数量与排列有明显改善，软骨层厚度增加；fSAW-DCE低、高剂量组软骨表面较为光滑，软骨形态与结构完整性有所改善，软骨层厚度有所增加，软骨细胞数量与排列较好，见图2。
2.4 fSAW-DCE对骨关节炎大鼠关节软骨矿质化程度及Mankin’s评分的影响与假手术组相比，模型组大鼠关节软骨矿质化程度严重(P < 0.001)，Mankin’s评分明显升高(P < 0.01)；与模型组相比，塞来昔布组及fSAW-DCE低剂量组关节软骨矿质化程度及Mankin’s
评分明显降低(P < 0.05，P < 0.01)， fSAW-DCE高剂量组关节软骨矿质化程度明显降低(P < 0.05)，Mankin’s评分有降低趋势，但结果无统计学差异，见图3。
2.5 fSAW-DCE对骨关节炎大鼠关节腔液中肿瘤坏死因子α水平的影响与假手术组相比，模型组大鼠关节腔液中肿瘤坏死因子α水平显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，塞来昔布组及fSAW-DCE低剂量组关节腔液中肿瘤坏死因子α水平明显降低(P < 0.01)，fSAW-DCE高剂量组关节腔液中肿瘤坏死因子α水平呈降低趋势，但结果无统计学差异，见图4。
2.6 fSAW-DCE对ATDC5细胞增殖的影响与对照组相比，1.25-40 μg/mL fSAW-DCE干预24 h后细胞存活率增加，但差异无显著性意义；1.25-5 μg/mL fSAW-DCE干预48 h后细胞存活率呈上升趋势，10-40 μg/mL fSAW-DCE干预48 h后细胞存活率呈下降趋势，其中5 μg/mL fSAW-DCE干预48 h后可明显增加细胞的存活率、40 μg/mL fSAW-DCE干预48 h后可明显降低细胞的存活率(P < 0.001，P < 0.05)，见图5。
2.7 fSAW-DCE对ATDC5细胞上清中肿瘤坏死因子α水平的影响与对照组相比，模型组上清中肿瘤坏死因子α水平明显升高(P < 0.05)；与模型组相比，塞来昔布组及1.25，5 μg/mL fSAW-DCE组细胞上清中肿瘤坏死因子α水平明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，20 μg/mL fSAW-DCE组细胞上清中肿瘤坏死因子α水平呈降低趋势，但差异无显著性意义，见图6。

2.8 fSAW-DCE对ATDC5细胞中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖 mRNA表达的影响 RT-qPCR结果显示，与对照组相比，模型组蛋白聚糖mRNA表达水平呈下降趋势，Ⅱ型胶原mRNA表达水平明显降低(P < 0.01)；与模型组相比，1.25 μg/mL fSAW-DCE组Ⅱ型胶原mRNA表达水平明显降低(P < 0.01)，5 μg/mL fSAW-DCE组Ⅱ型胶原mRNA表达水平升高(P < 0.05)，蛋白聚糖mRNA表达水平有上升趋势，见图7。

2.9 转录组学分析
2.9.1 转录组样品RNA质检情况质检结果显示各组样品RNA纯度及浓度均符合要求，检测结果为A，可进行后续建库分析，质检情况见表6。

2.9.2 基因表达差异分析样本间相关性热图显示各组间分类界限明显，各组内样本基因表达相似性较高。差异基因数目柱状图显示，与对照组相比，模型组共有1 169个差异基因，其中633个基因上调，536个基因下调；与模型组相比，20 μg/mL fSAW-DCE
组共有516个差异基因，其中217个基因上调，299个基因下调，见图8。
2.9.3 蛋白相互作用网络将差异基因导入STRING网站进行蛋白间相互作用分析，物种选择小鼠，下载其tsv文件，并导入Cytoscape 3.10.1进行可视化，以degree值为指标将差异基因进行大小排序，以筛选核心靶点。蛋白相互作用网络图结果显示，与对照组相比，造模后主要影响了白细胞介素6、C-C趋化因子配体2、基质金属蛋白酶9等基因；与模型组相比，给予fSAW-DCE后主要影响白细胞介素6、C-X-C趋化因子配体10、C-X-C趋化因子配体9等基因，见图9。
2.9.4 GO和KEGG富集分析将差异基因及其FC值导入Omicshare云平台进行动态GO和KEGG富集分析，物种选择小鼠。富集结果按照P值从小到大进行排列，选取排名前20的结果进行展示，P < 0.05视为结果有显著性意义。KEGG富集结果删除与关节炎不相关的人类疾病后，选取排名前20的结果进行

展示。GO和KEGG富集结果显示，与对照组相比，模型组富集到的基因主要涉及生物调节、多细胞生物过程及免疫系统过程等生物过程；调节催化活性、抗氧化活性及小分子传感器活性等分子功能；调节细胞解剖实体及含蛋白质的复合物等细胞组成；影响肿瘤坏死因子、白细胞介素17、细胞外基质受体相互作用等信号通路发挥作用。与模型组相比，给予fSAW-DCE后富集到的基因主要涉及生物调节、多细胞生物过程及免疫系统过程等生物过程；调节催化活性、ATP依赖活性及抗氧化活性等分子功能；调节细胞解剖实体及含蛋白质的复合物等细胞组成；通过影响细胞外基质受体相互作用、肿瘤坏死因子、Janus激酶-信号转导和转录活化因子等信号通路发挥作用，见图10，11。
2.10 转录组学结果验证
2.10.1 核心基因检测结果根据蛋白相互作用网络分析结果，选择白细胞介素6进行验证。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，模型组软骨细胞中白细胞介素6 mRNA表达水平明显升高(P < 0.001)；与模型组相比，经塞来昔布及5，20 μg/mL fSAW-DCE干预后白细胞介素6 mRNA表达水平明显降低(P < 0.01，P < 0.05)，1.25 μg/mL fSAW-DCE干预后白细胞介素6 mRNA表达水平有降低的趋势，见图12。

2.10.2 信号通路检测结果根据KEGG富集分析结果，选择肿瘤坏死因子信号通路进行验证，见图13。Western blot验证结果显示，与对照组相比，模型组软骨细胞内肿瘤坏死因子受体1、肿瘤坏死因子受体1相关死亡结构域蛋白表达有降低趋势，转化生长因子激酶1、核因子κB抑制蛋白激酶β、p65、基质金属蛋白酶13蛋白表达有升高趋势，核因子κB抑制蛋白α蛋白表达明显上升(P < 0.05)；

与模型组相比，塞来昔布组及各fSAW-DCE组肿瘤坏死因子受体1、转化生长因子激酶1、核因子κB抑制蛋白激酶β无明显变化，5 μg/mL fSAW-DCE组肿瘤坏死因子受体1相关死亡结构域蛋白、基质金属蛋白酶13蛋白表达明显减少(P < 0.01，P < 0.001)，5，20 μg/mL fSAW-DCE组核因子κB抑制蛋白α蛋白表达明显减少(P < 0.001，P < 0.05)，塞来昔布及fSAW-DCE干预后p65蛋白表达明显降低(P < 0.001，P < 0.01)，见图14。

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引言

骨关节炎以关节软骨退化、软骨下骨硬化、关节边缘骨赘生成以及滑膜炎为主要病理特征[1]，主要临床表现为关节疼痛、肿胀、活动受限、关节畸形及功能丧失等。相关研究表明，骨关节炎的患病率正在逐年上升[2]，据全球疾病、伤害和风险因素负担研究的报道，截至2020年全球有约5.95亿人患骨关节炎，到2050年预计全球患病人数近10亿，其中膝骨关节炎患者约占75%。中国骨关节炎患者以60岁以上老年人为主(约占78.5%)，疾病的整体发病率约为9.56%[3]。骨关节炎的发生多与年龄、性别、基因、肥胖及损伤等因素有关，但目前发病机制仍不明确。长期以来骨关节炎被认为是一种与滑膜和关节软骨损伤相关的疾病[4]，而关节软骨损伤修复尤为重要。膝关节软骨是一层覆盖在关节表面无血管、神经的结缔组织[5]，由95%软骨基质和5%软骨细胞构成，主要功能是为关节提供光滑的表面、降低关节之间的摩擦以维持人体的日常运动[6]。关节软骨细胞处于软骨陷窝处，通过合成富含Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和相关大分子的软骨细胞外基质来调节软骨稳态；当骨关节炎发生时，关节液中的炎症细胞因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等浓度升高，进一步介导基质金属蛋白酶(如基质金属蛋白酶13)的激活[7]。基质金属蛋白酶13是主要的分解代谢酶，可降解软骨细胞外基质中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、Ⅳ型胶原、Ⅸ型胶原、骨连接蛋白等，加速软骨细胞外基质破坏[8-9]，导致软骨细胞外基质无法发挥正常功能，促进了骨关节炎的发展，因此抑制炎症是骨关节炎治疗的有效着力点。
斯赤列(Sambucus adnate Wall.)为忍冬科接骨木属植物的干燥地上部分或全草，由于根和根茎呈红色且折断后流出红色汁液因此又名血满草、大血草等。斯赤列主要分布于云南、贵州、西藏等地，味辛、甘，性温，具有利水、活血散瘀、祛风通络的功效，主要用于治疗骨折、扭伤、急慢性肾炎、风湿疼痛等[10]。研究表明斯赤列水/醇提取物均具有抗炎作用，从斯赤列提取物中分离出的木脂素类及黄酮类成分具有骨保护作用[11]。课题组前期研究表明斯赤列鲜品二氯甲烷提取物具有抑制骨关节炎大鼠异常血管新生的作用[12]，由于彝医在临床常使用新鲜斯赤列治疗关节疼痛等症，目前对鲜品斯赤列的药效研究较少，鲜品斯赤列二氯甲烷提取物(the dichloromethane extraction of fresh Sambucus adnata Wall.，fSAW-DCE)的作用尚不明确，该实验通过前交叉韧带切断法复制大鼠骨关节炎模型以及通过白细胞介素1β诱导建立ATDC5细胞炎症模型，给予fSAW-DCE干预以探究抗骨关节炎的作用及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验、体内随机对照动物实验及转录组学分析。
1.2 时间及地点实验于2023年6月至2024年1月在云南中医药大学国家中医药管理局科研三级实验室中药药理实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性SPF级SD大鼠40只，6周龄，体质量180-200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2024-0009，饲养于云南中医药大学动物实验室，许可证号：SYXK(滇)K2022-0004，所有大鼠在(25±1) ℃、相对湿度60%-65%的环境中饲养，昼夜循环照明，自由摄食饮水。实验操作符合云南中医药大学动物伦理学要求，审批号：R-062022099。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验细胞小鼠胚胎瘤细胞：ATDC5细胞，购自北纳细胞库，呈成纤维细胞样。
1.3.3 主要试剂与仪器斯赤列植物采于云南省曲靖市马龙区，经云南中医药大学普春霞教授鉴定为忍冬科接骨木属植物斯赤列(Sambucus adnate Wall.)。斯赤列鲜品二氯甲烷提取物由云南中医药大学分析化学实验室制备。塞来昔布(美国Proteintech公司，批号：169590-42-5)；注射用青霉素钠(江西科达动物药业，批号：20231004)；40 g/L多聚甲醛(北京兰杰柯科技有限公司，批号：20220203)；二甲苯(天津市风船化学试剂科技有限公司，货号：20220801)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号80109218)；EastepTM Total RNA Super Extraction Kit 试剂盒(Invitrogen，货号：15596026CN)；Eastep RT Master Mix (5×)反转录预混液(上海 Promega，货号：LS2052)；Eastep qPCR Master Mix (2×)试剂盒(上海Promega，货号：LS2062)；蛋白Marker(武汉Servicebio公司，货号：G2087)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术所，货号：P0010)；苏木精染色液(上海Beyotime公司，货号：C0107)；苏木精返蓝液(武汉Servicebio公司，货号：CR2208076)；苏木精分化液(武汉Servicebio公司，货号：CR2208136)；小鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫检测试剂盒(南京建成公司，货号：H052-1-2)；基质金属蛋白酶13多克隆抗体(美国Proteintech公司，货号：18165-1-AP)；核因子κB抑制蛋白α多克隆抗体(美国Proteintech公司，货号：10268-1-AP)；核因子κB抑制蛋白激酶β多克隆抗体(美国Proteintech公司，货号：15649-1-AP)；肿瘤坏死因子受体1相关死亡结构域蛋白多克隆抗体(美国Proteintech公司，货号：15468-1-AP)；肿瘤坏死因子受体1多克隆抗体(美国Proteintech公司，货号：21574-1-AP)；兔抗核因子κB p65多克隆抗体(武汉Servicebio公司，货号：GB11997)；兔抗转化生长因子激酶1多克隆抗体(武汉Servicebio公司，货号：GB11700)；重组抗β-actin抗体(武汉Servicebio公司，货号：ZB15001-HRP-100)；HRP-山羊抗兔抗体(武汉Servicebio公司，货号：GB23303)；HRP-山羊抗鼠抗体(武汉Servicebio公司，货号：GB23301)；异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，货号：2024081201)；MTS试剂盒(上海Promega公司，货号：G3580)；低温高速离心机(Hitachi Koki公司)；-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo Fishe公司)；包埋机(美国Thermo Fisher公司)；轮转式病理切片机(美国Thermo Fisher公司)；酶标仪(瑞士Tecan公司)；玻片扫描影像分析系统(深圳生强科技股份有限公司)；荧光定量PCR仪(CXF Connect)；超微量分光光度计(美国Thermo公司)；垂直电泳仪(美国BIO-RAD公司)；转膜仪(美国BIO-RAD公司)；UVP凝胶成像分析系统(美国Spectrum公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo scientific公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 受试物fSAW-DCE的制备取新鲜斯赤列75 kg，甲醇浸提，48 h/次，浸提3次，过滤，合并滤液，减压蒸馏得斯赤列甲醇提取物，斯赤列甲醇提取物混悬分散于水中，二氯甲烷萃取得二氯甲烷提取物(fSAW-DCE，172.6 g)。

1.4.2 动物分组、造模与给药 SD大鼠适应性喂养1周，按体质量随机分为5组：假手术组、模型组、塞来昔布组(900 mg/kg)[13]、fSAW-DCE低剂量组(740 mg/kg，临床5倍量[10，12，14])、fSAW-DCE高剂量组(1 480 mg/kg，临床10倍量)，每组8只。假手术组只打开关节囊暴露关节腔，不切断前交叉韧带；其余各组采用前交叉韧带切断法复制膝骨关节炎模型[14]，术后每日驱赶大鼠运动30 min，同时塞来昔布组、fSAW-DCE低剂量组、fSAW-DCE高剂量组按10 mL/kg灌胃相应药物，1次/d，假手术组、模型组灌胃等量生理盐水，连续灌胃6周。末次给药24 h后取相应的组织进行指标检测。

1.4.3 膝关节Micro CT影像学检查造模6周后，异氟烷麻醉后，仰卧位固定大鼠，Micro CT扫描大鼠膝关节，电压60 kV，电流134 mA，分辨率25 μm。采用Hiscan analysis软件对膝关节三维重建，分析软骨下骨体积(bone volume，BV)、骨体积分数(percent bone volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)及综合骨密度(bone density，BMD)。Micro CT扫描与分析于云南中医药大学完成。
1.4.4 苏木精-伊红染色观察关节软骨病理变化取膝关节，剔除多余肌肉，40 g/L多聚甲醛固定保存，脱钙三四周，经过脱水、透明、浸蜡、包埋等过程制成组织蜡块，切成厚度为5 μm的切片。切片经二甲苯以及梯度乙醇脱蜡后进行苏木精-伊红染色，再经脱水、透明及中性树胶封固后于玻片扫描影像分析系统下观察。

1.4.5 骨关节炎大鼠膝关节Mankin’s评分根据苏木精-伊红染色结果，按照表1评分标准对骨关节炎大鼠膝关节进行损伤评分。

1.4.6 检测骨关节炎大鼠关节软骨矿化程度根据苏木精-伊红染色结果，采用Image viewer软件测量钙化软骨与全层软骨厚度，根据矿质化程度=钙化软骨厚度/全层软骨厚度×100%评价各组大鼠关节软骨退化情况。
1.4.7 ELISA检测骨关节炎大鼠关节液中肿瘤坏死因子α水平取膝关节，用0.1 mL生理盐水清洗和冲刷关节腔，得到关节腔灌洗液，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书检测关节腔液中肿瘤坏死因子α水平。
1.4.8 细胞培养将ATDC5细胞接种于6孔板中，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养24 h，在培养液中加入1%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠与40 μg/mL维生素C培养7 d，诱导分化为软骨细胞，然后更换含体积分数10%胎牛血清、青霉素-链霉素的H-DMEM培养基培养，24 h后视细胞贴壁情况更换培养基，之后每一两天换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况，当细胞生长至80%-90%融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养，后续以8-10代细胞进行相关实验。
1.4.9 MTS法检测fSAW-DCE对ATDC5细胞增殖的影响将ATDC5细胞浓度调整为3×107 L-1，按100 μL/孔接种于96孔板培养24 h，将细胞按分组进行干预，分别为空白组(只加培养基，不加细胞)、正常组(正常培养的细胞)、fSAW-DCE组(质量浓度分别为1.25，2.5，5，10，20，40 μg/mL)，每组设6个复孔，分别培养24 h和48 h，按20 μL/孔避光加入MTS溶液，在培养箱中孵育2 h，用酶标仪在490 nm处测定各孔吸光度值，计算细胞存活率=(实验组吸光度值−空白组吸光度值)/(正常组吸光度值−空白组吸光度值)×100%。
1.4.10 ELISA检测ATDC5细胞上清中肿瘤坏死因子α水平将ATDC5细胞浓度调整为2×108 L-1，按2 mL/孔接种于6孔板中，将细胞按分组进行干预，分别为对照组、模型组、塞来昔布组(10 μmol/L)、1.25 μg/mL fSAW-DCE组、5 μg/mL fSAW-DCE组、
20 μg/mL fSAW-DCE组，除对照组外，其他组加入50 ng/mL白细胞介素1β培养48 h后再加入相应药物干预48 h，取上清液按照试剂盒说明书检测肿瘤坏死因子α水平。

1.4.11 RT-qPCR检测ATDC5细胞中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖 mRNA表达水平按1.4.10的方法培养细胞及给药，干预结束后吸去上清，收集细胞，提取细胞总RNA，采用核酸蛋白定量仪对RNA进行定量，然后将RNA反转录为cDNA，RT-qPCR法检测Ⅱ型胶原及蛋白聚糖mRNA表达水平。运用2-ΔΔCt方法确定mRNA的相对表达量，以GAPDH为内参，ΔCT=CT目的-CT内参，ΔΔCT=ΔCT实验样本-ΔCT对照样本。基因引物序列见表2。

1.4.12 转录组学检测及分析将ATDC5细胞浓度调整为5×108 L-1，按2 mL/孔接种于6孔培养板中，分为对照组、模型组、fSAW-DCE(20 μg/mL)组，除对照组外，其他组加入50 ng/mL白细胞介素1β培养48 h，fSAW-DCE组在白细胞介素1β培养48 h再加入20 μg/mL fSAW-DCE干预48 h，干预结束后收集细胞，Trizol裂解液提取总RNA，NanoDrop2000检测样品的纯度和浓度，Agilent 5300检测RQN值，综合评估样本并建库，Illumina平台测序。对样品进行基因表达量差异统计，以|log2FC|≥0.263，且P < 0.05为筛选条件，得到差异基因。使用OmicShare云平台对差异基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，String数据库进行蛋白质相互作用网络分析，深入挖掘差异基因的相关功能和富集情况，可视化关键基因所涉及到的通路和生物学过程。

1.4.13 RT-qPCR和Western blot验证将ATDC5细胞浓度调整为5×108 L-1，按2 mL/孔接种于6孔培养板中。参照1.4.10方法分组培养、收集细胞。采用RT-qPCR法对蛋白相互作用网络中的核心基因进行验证，RT-qPCR检测参照1.4.11方法，引物序列见表3。采用Western blot法对KEGG信号通路进行验证，提取细胞蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃变性10 min，经电泳、转膜、牛奶封闭后，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗，显色成像，Image J软件计算条带灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值进行统计分析，抗体稀释比例见表4。

1.5 主要观察指标 ①fSAW-DCE对骨关节炎大鼠膝关节骨赘增生及软骨下骨骨量变化的影响；②fSAW-DCE对骨关节炎大鼠关节腔液中肿瘤坏死因子α水平、关节软骨形态、矿质化程度及关节软骨Mankin’s评分的影响；③fSAW-DCE对核因子κB信号通路的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析法(One-way analysis of variance，ANOVA)，方差齐者采用LSD法检验，方差不齐者采用Tamhane’s法检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经云南中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

目前，对骨关节炎的治疗手段主要包括非手术治疗(如药物干预、物理治疗，关节腔注射等)和手术治疗(如关节置换、关节镜手术等)，但主流治疗手段存在着诸多问题，例如术后感染、药物不良反应大等[15-17]，因此仍需寻找安全有效的治疗手段。彝族人民在骨关节炎治疗的长期临床实践中发现斯赤列对骨关节炎具有明确疗效，《云南中草药》《云南彝族药学》中记载在治疗骨关节炎及跌打损伤时，彝族人民常采用新鲜叶子及根、茎皮煮水吃，或用新鲜斯赤列捣碎外敷等方法。课题组前期研究显示，干品斯赤列提取物的药理活性明显，其甲醇提取物具有明显的抗炎、抗氧化、延缓骨关节炎发展的作用，水提物具有明显的促进成骨作用，二氯甲烷提取物可调节磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路影响血管新生[12，14，18-20]。鲜品斯赤列提取物的药理活性如何尚不清楚，因此进行了此研究。
关节作为身体的承重结构，承受着各种机械负荷的刺激，前交叉韧带、后交叉韧带、内侧副韧带以及外侧副韧带共同作用于关节，为关节提供稳定性[21]；前交叉韧带作为关节韧带的重要组成部分，具有防止胫骨相对于股骨前移，控制膝关节旋转、限制膝关节内外翻及提供膝关节动力稳定性的作用[22]，当前交叉韧带损伤时会改变关节的前向稳定、增加关节面摩擦，使关节软骨损伤[23-24]，适度运动带来的关节负荷具有软骨保护作用，前交叉韧带受损时的运动带来的机械负荷则会损伤关节软骨[25]；白细胞介素1β作为一种促炎因子可上调基质金属蛋白酶表达，加速软骨细胞外基质降解，加速骨关节炎的发展[26-27]，而前交叉韧带切断法诱导的大鼠骨关节炎模型在病理特征、发病机制方面能模拟临床骨关节炎的病理进程。该研究采用前交叉韧带切断法离断大鼠膝关节前交叉韧带并将大鼠置于跑步机上进行跑步运动以复制大鼠骨关节炎模型，并结合白细胞介素1β刺激ATDC5细胞炎症模型体外实验共同探讨斯赤列对骨关节炎的作用及机制。
关节软骨是覆盖在关节骨骼表面无神经、血管或淋巴管的结缔组织[28]，其主要成分为蛋白多糖和胶原纤维。关节软骨作为关节受力的主要部位，时刻受到外力的刺激，异常的力学刺激使得软骨产生多种病理变化如炎症、软骨细胞肥大、钙化、凋亡、软骨细胞外基质降解等[29-30]，最终导致软骨损伤。关节软骨与软骨下骨组成一个复合单元共同发挥关节缓冲减震的作用，软骨下骨由软骨下骨板及软骨下骨小梁构成，内含丰富的血管，可吸收关节负荷[31]。当关节软骨受损时会引起软骨下骨的变化，主要表现为软骨下骨板变薄、软骨下骨小梁空隙变大；到骨关节炎晚期时关节软骨钙化层变厚，软骨下骨小梁硬化，软骨下骨出现骨囊肿、骨赘增生等[32]。该研究结果显示经低剂量fSAW-DCE干预后骨关节炎大鼠关节软骨矿质化程度及关节软骨损伤评分明显降低，骨赘增生及软骨下骨骨量丢失情况得到明显改善，提示fSAW-DCE可改善骨关节炎引发的病理损伤。
此外，炎性反应是引发骨关节炎软骨代谢失衡的发病机制之一。当软骨细胞受到白细胞介素1β刺激时，会分泌肿瘤坏死因子α等炎性因子，细胞受到肿瘤坏死因子α刺激后会启动肿瘤坏死因子信号转导。肿瘤坏死因子α激活位于细胞膜表面的肿瘤坏死因子受体1，肿瘤坏死因子受体1相关死亡结构域蛋白被招募到肿瘤坏死因子受体1上[33-34]，发生构象变化并能够招募受体相互作用蛋白激酶1和肿瘤坏死因子受体相关因子2，在细胞膜附近形成复合物(复合体Ⅰ)[35]，进一步招募转化生长因子激酶1，转化生长因子激酶1是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶的家族成员，被认为是肿瘤坏死因子受体介导核因子κB信号激活炎症反应的关键调节因子[36-37]。核因子κB是炎症的中央调节剂，炎症因子介导靶蛋白的合成均通过依赖核因子κB的信号传导途径介导。核因子κB的激活受到核因子κB抑制蛋白激酶复合体的调节，核因子κB抑制蛋白激酶复合体由核因子κB抑制蛋白激酶α、核因子κB抑制蛋白激酶β和核因子κB必需调节因子组成，核因子κB必需调节因子向复合体Ⅰ募集使核因子κB抑制蛋白激酶复合体靠近转化生长因子激酶1，转化生长因子激酶1通过与复合体Ⅰ关联激活核因子κB抑制蛋白激酶β磷酸化核因子κB抑制蛋白α，导致其泛素介导的蛋白酶体降解，继而激活下游核因子κB，促进肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等分泌进而促进软骨细胞炎症[38-41]。炎症因子的产生继而诱导基质金属蛋白酶13等高表达，基质金属蛋白酶13是参与软骨降解的主要分解代谢因子，其高表达可导致软骨细胞外基质降解加剧[42-43]。Ⅱ型胶原和蛋白聚糖作为软骨细胞外基质的主要成分[44]，为软骨提供收缩和恢复的能力[45]，当基质金属蛋白酶13高表达时，会导致Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的丢失，加速骨关节炎的发展进程[46-47]。该研究结果显示fSAW-DCE可降低骨关节炎大鼠关节腔液及白细胞介素1β诱导的ATDC5炎症细胞上清中肿瘤坏死因子α水平，降低细胞中白细胞介素6的mRNA表达水平，提高Ⅱ型胶原 mRNA表达水平，并且降低了肿瘤坏死因子受体1相关死亡结构域蛋白、核因子κB抑制蛋白α、p65及基质金属蛋白酶13蛋白表达水平，提示fSAW-DCE可通过抑制肿瘤坏死因子/核因子κB信号通路以减轻炎症及软骨细胞外基质降解，延缓骨关节炎发展。
为探讨斯赤列对骨关节炎的作用，目前课题组已进行了不同的实验：干品斯赤列水提取物和二氯甲烷提取物对成骨细胞增殖与分化的影响、干品斯赤列甲醇提取物和二氯甲烷提取物对骨关节炎模型大鼠异常血管新生的作用以及鲜品斯赤列甲醇提取物对骨关节炎模型大鼠的治疗作用。研究发现不同提取部位的斯赤列对骨关节炎均有较好的治疗效果，二氯甲烷提取部位对成骨细胞增殖分化、异常的血管新生均有较好的作用，提示斯赤列发挥治疗骨关节炎的药效成分可能集中于二氯甲烷提取部位。研究发现鲜品斯赤列对骨关节炎大鼠的治疗效果较干品好，因此采用fSAW-DCE以探讨斯赤列治疗骨关节炎的作用机制。将转录组学分析结果与鲜品斯赤列甲醇提取物的网络药理学分析结果进行对比发现，两种提取物均涉及了炎症信号通路，但fSAW-DCE还可调节细胞间的相互作用相关的信号通路，治疗骨关节炎的机制更为具体。将该研究中转录组学结果与二氯甲烷提取物对骨关节炎模型大鼠异常血管新生作用中转录组学结果对比发现，斯赤列二氯甲烷提取物均可影响细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞外基质受体相互作用、黏着斑、Janus激酶-信号转导和转录活化因子信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路、类风湿关节炎、核黄素代谢等信号通路，提示斯赤列二氯甲烷提取物可能通过调节这些共同通路发挥抑制骨关节炎异常血管新生及软骨炎症的作用。
关节软骨作为关节的重要组成部位，在关节的受力承载中发挥着重要的作用。炎症微环境的发生会造成关节软骨损伤，大量促炎细胞因子可导致软骨基质的降解，加重关节的受力承载，加速骨关节炎发展，因此抑制软骨炎症的发生发展是阻止骨关节炎病理进程的有效治疗措施之一。该研究显示fSAW-DCE可通过抑制肿瘤坏死因子/核因子κB通路的激活发挥抗炎及软骨保护作用。但骨关节炎的发生累及关节软骨、滑膜、软骨下骨等结构，涉及软骨退变、炎症反应、机械应力异常、代谢等诸多方面，而离体细胞、整体动物与人体在发病机制、病理进程、药物代谢特性等方面存在诸多差异，在探究fSAW-DCE抗骨关节炎的机制时仅对软骨细胞的炎症反应进行研究显然不足以说明fSAW-DCE的作用，后续研究可将整体实验与体外实验相结合多角度、深层次探究fSAW-DCE抗骨关节炎的具体作用机制。另外，从临床骨关节炎的发生来看，目前普遍认为该病与年龄密切相关，是一种关节退行性改变，该实验动物模型是创伤造成的继发性关节损伤，不能准确模拟临床骨关节炎的发病原因，因此在后续的研究中还将采用更加贴合临床病因的动物模型对fSAW-DCE抗骨关节炎的作用进行探讨。该实验还存在一些局限性，例如fSAW-DCE抗骨关节炎的量效关系问题，高剂量fSAW-DCE干预后仅有关节软骨矿质化程度与关节软骨下骨骨体积分数出现统计学差异，其余各项指标均只有降低趋势，在体外细胞实验中也未表现出量效依赖的关系。目前根据fSAW-DCE所含活性成分研究的结果(另文待发表)，fSAW-DCE中的三萜类成分和木脂素类成分可分别作用于骨关节炎的不同病理环节，作用靶点也存在差异，分析原因可能与fSAW-DCE在不同给药剂量下其所含的不同类型成分入血后富集的程度有所不同，进而呈现了复杂的活性表现形式有关，更深入的差异比较研究还有待进一步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

彝药斯赤列二氯甲烷提取物干预骨关节炎模型大鼠的作用及机制

Effect and mechanism of dichloromethane extract of fresh Sambucus adnata Wall. in rat osteoarthritis models

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