瑞马唑仑抑制软骨细胞衰老缓解骨关节炎的作用及机制

doi:10.12307/2026.677

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (12): 3005-3013.doi: 10.12307/2026.677

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瑞马唑仑抑制软骨细胞衰老缓解骨关节炎的作用及机制

柯燕琴1，原杰1，贺光辉1，张晓玲1，2

1山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030000；2上海交通大学医学院附属新华医院骨科，上海市 200092

收稿日期:2025-03-14 接受日期:2025-08-22 出版日期:2026-04-28 发布日期:2025-09-29
通讯作者: 张晓玲，博士，教授，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市030001；上海交通大学医学院附属新华医院骨科，上海市 200092
作者简介:柯燕琴，女，2000年生，安徽省安庆市人，山西医科大学在读硕士，主要从事骨关节炎机制及药物研究。
基金资助:
山西省重点研发项目(201903D321097)，项目负责人：张晓玲

Remimazolam inhibits chondrocyte senescence and alleviates osteoarthritis: roles and mechanisms

Ke Yanqin1, Yuan Jie1, He Guanghui1, Zhang Xiaoling1, 2

1Department of Orthopaedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; 2Department of Orthopaedics, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200000, China

Received:2025-03-14 Accepted:2025-08-22 Online:2026-04-28 Published:2025-09-29
Contact: Zhang Xiaoling, PhD, Professor, Department of Orthopaedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; Department of Orthopaedics, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200000, China
About author:Ke Yanqin, MS candidate, Department of Orthopaedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
Supported by:
Shanxi Province Key Research and Development Project, No. 201903D321097 (to ZXL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
瑞马唑仑：是一种新型的短效γ-氨基丁酸受体激动剂，属于酯苯二氮卓类药物。瑞马唑仑已被应用于临床治疗，主要用于镇静和麻醉，此外，研究还发现瑞马唑仑具有抗炎和器官保护的潜力。
细胞衰老：是一种不可逆的细胞周期阻滞状态。在这种状态下，细胞虽维持代谢活跃，但不再分裂，且对促进生长的刺激无反应。从形态学角度看，衰老细胞呈现出细胞结构的退行性变化，例如细胞核膜出现凹陷、染色质结构发生改变、细胞膜的脆性增加等；在生理学层面，衰老细胞表现为功能衰退和代谢减缓，具体表现为细胞周期停滞、复制能力丧失、酶活性降低等。

背景：研发能够阻止甚至逆转关节软骨退化的药物，一直是研究领域的重要科学问题，近年来细胞衰老及靶向调控细胞衰老的策略受到科研人员的关注。
目的：探讨瑞马唑仑对小鼠软骨细胞衰老的调控机制，评估瑞马唑仑在骨关节炎中的治疗效果及作用机制。
方法：①体外细胞实验：培养原代小鼠软骨细胞，使用10 ng/mL白细胞介素1β来诱导骨关节炎软骨细胞模型。通过CCK-8实验确定瑞马唑仑对小鼠软骨细胞的最佳干预浓度。实验设置正常对照组、白细胞介素1β组、瑞马唑仑组，干预24 h后采用Western blot、免疫荧光染色、β-半乳糖苷酶实验检测各组软骨细胞的合成与分解代谢蛋白指标、衰老蛋白指标以及核因子κB信号通路相关指标。②动物体内实验：选取8周龄C57/BL6小鼠，随机分为假手术组、内侧半月板失稳组、瑞马唑仑组。在瑞马唑仑治疗4周后，分析小鼠步态，采用番红O-固绿染色观察关节软骨的病理学变化，免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13表达水平。
结果与结论：①体外细胞实验：相对于白细胞介素1β组，使用60 μmol/L瑞马唑仑处理后，软骨细胞衰老指标P16、P21表达水平降低，合成代谢指标Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达增加，分解代谢指标基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13表达降低以及核因子κB信号通路被抑制。②动物体内实验：瑞马唑仑治疗4周后，与内侧半月板失稳组相比，瑞马唑仑组小鼠下肢功能恢复，组织病理学评分改善，Ⅱ型胶原表达增加，基质金属蛋白酶13表达降低。结果表明：瑞马唑仑通过抑制核因子κB信号通路减轻软骨细胞衰老，改善软骨结构，为骨关节炎治疗提供了新的策略。
https://orcid.org/0009-0000-0385-7438(柯燕琴)；https://orcid.org/0000-0002-0134-1347(张晓玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨关节炎, 瑞马唑仑, 软骨细胞, 细胞衰老, 核因子κB信号通路, Ⅱ型胶原, 基质金属蛋白酶

Abstract: BACKGROUND: The development of medications that can stop or even reverse the degeneration of articular cartilage has long been a significant scientific concern. Researchers have recently become interested in cell senescence and focused on regulatory techniques.
OBJECTIVE: To explore the regulatory mechanism of remimazolam on chondrocyte senescence in mice, and assess its therapeutic efficacy and mechanism of action in osteoarthritis.
METHODS: (1) In vitro cell experiment: After primary chondrocytes were isolated and cultivated, chondrocyte models of osteoarthritis were induced in vitro using 10 ng/mL interleukin-1β. The optimal intervention concentration of remimazolam on mouse chondrocytes was detected using the cell counting kit-8 assay. Three groups were set up in the experiment: normal control, interleukin-1β, and remimazolam groups. Twenty-four hours after intervention, western blot, immunofluorescence staining, and β-galactosidase assays were used to detect the synthesis and catabolism protein indicators, senescence protein indicators, and nuclear factor-κB signaling pathway-related indicators in mouse chondrocytes. (2) In vivo animal experiment: C57/BL6 mice aged 8 weeks were randomized into three groups: the sham group, the medial meniscus instability group, and the remimazolam group. Following 4 weeks of remimazolam treatment, gait analysis in mice was performed. Pathological changes in the articular cartilage were observed using safranine O-fast green staining. Immunofluorescence staining was used to detect the expression levels of type II collagen and matrix metalloproteinase 13.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro cell experiment: Compared with the interleukin-1β group, interleukin-1β-induced chondrocytes treated with 60 μmol/L remimazolam exhibited a significant decrease in the expression levels of the senescence markers P16 and P21, an increase in the expression of anabolic markers type II collagen and aggrecan, a decrease in the expression of catabolic markers matrix metalloproteinase 3 and matrix metalloproteinase 13, and inhibition of the nuclear-κB signaling pathway. (2) In vivo animal experiment: After 4 weeks of treatment with remimazolam, the mice in the remimazolam group showed recovered lower limb function, improved histopathological scores, increased expression of type II collagen, decreased expression of matrix metalloproteinase 13 compared with those in the medial meniscus instability group. To conclude, by blocking the nuclear factor-κB signaling pathway, remimazolam alleviates chondrocyte senescence and enhances cartilage structure, offering a novel approach to treating osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, remimazolam, chondrocytes, cellular senescence, nuclear factor-κB signaling pathway, type II collagen, matrix metalloproteinase

中图分类号:

柯燕琴, 原杰, 贺光辉, 张晓玲. 瑞马唑仑抑制软骨细胞衰老缓解骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(12): 3005-3013.

Ke Yanqin, Yuan Jie, He Guanghui, Zhang Xiaoling. Remimazolam inhibits chondrocyte senescence and alleviates osteoarthritis: roles and mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(12): 3005-3013.

图/表（结果） 7

2.1 瑞马唑仑对软骨细胞活性的影响用0，1，10，20，40，60，80 μmol/L瑞马唑仑(图1A)处理软骨细胞24 h，以确定瑞马唑仑对软骨细胞的安全作用浓度，结果显示，瑞马唑仑在0，1，10，20，40，60，80 μmol/L浓度下，软骨细胞的活力分别为100%，100%，100%，104%，100%，81%，77%。鉴于细胞活力在80%以上时为细胞的安全作用浓度[17]，后续细胞实验将以60 μmol/L作为实验工作浓度(图1B)。

2.2 瑞马唑仑对软骨细胞合成分解代谢指标的影响白细胞介素1β刺激软骨细胞是骨关节炎常用的体外细胞模型[18]，与正常对照组相比，白细胞介素1β组聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的蛋白表达水平显著降低，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的蛋白表达水平显著升高；与白细胞介素1β组相比，瑞马唑仑组聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的蛋白表达水平显著升高，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的蛋白表达水平显著降低(图2)，结果表明瑞马唑仑能够促进软骨细胞的合成代谢，抑制分解代谢。

2.3 瑞马唑仑对软骨细胞衰老的影响与正常对照组相比，白细胞介素1β干预后软骨细胞衰老表型P16和P21的蛋白表达水平显著升高。与白细胞介素1β组相比，瑞马唑仑组P16和P21的蛋白表达水平显著降低(图3A，B)。此外，β-半乳糖苷酶染色实验显示，在白细胞介素1β干预下衰老阳性细胞明显增加，而瑞马唑仑干预后衰老阳性细胞明显减少(图3C，D)。以上实验证实瑞马唑仑对软骨细胞衰老发挥抑制作用。

2.4 瑞马唑仑对软骨细胞核因子κB信号通路的影响免疫荧光染色显示，白细胞介素1β干预后核因子κB信号通路的关键转录因子P65的表达水平显著升高，瑞马唑仑处理降低了P65的表达水平(图4A，B)。Western blot实验结果显示，与正常对照组相比，白细胞介素1β干预后IκB-α蛋白表达下降，P65蛋白表达升高；与白细胞介素1β组相比，瑞马唑仑干预后IκB-α蛋白表达显著升高，P65蛋白表达显著降低(图4C-E)。这些结果证实了瑞马唑仑可能够通过抑制软骨细胞在炎症状态下核因子κB信号通路的激

活，减轻炎症反应。
2.5 动物行为学变化治疗4周后，利用CatWalk仪器对小鼠步态进行分析。当小鼠在固定跑道上行走时，电脑能够清晰地记录下四肢的印记(图5A，B)。假手术组小鼠以规律的步伐顺畅地通过跑道；DMM组小鼠在通过跑道时表现出明显的节律紊乱；与DMM组相比，瑞马唑仑组小鼠下肢步态节律更为整齐(图5C)。定量分析结果显示，与假手术组相比，DMM组小鼠在通过跑道时出现了步态不协调，尤其是右后肢的触地面积和摆动速度均有所减少，而经过瑞马唑仑治疗后，小鼠右后肢的触地面积和摆动速度得到了显著改善(图5D)。
2.6 小鼠软骨组织病理学分析和细胞外基质相关蛋白表达番红O-固绿染色显示，DMM组小鼠膝关节表面粗糙，软骨层严重磨损；相比之下，瑞马唑

仑组小鼠膝关节表面磨损减少，软骨层得到一定程度的保护，软骨组织病理学表现有所改善(图6A)。使用OARSI评分从软骨基质丢失、软骨损伤面积占比、垂直裂隙延伸长度等方面对软骨退变进行定量评估，结果显示，与DMM组比较，瑞马唑仑组OARSI评分显著降低，表明瑞马唑仑对软骨退变有显著的改善作用(图6C)。免疫荧光染色显示，与假手术组相比，DMM组Ⅱ型胶原表达显著降低而基质金属蛋白酶13表达显著升高，这与骨关节炎的典型病理变化一致。与DMM组相比，瑞马唑仑组Ⅱ型胶原表达显著增加，而基质金属蛋白酶13表达显著降低(图6B，D)。这些结果表明瑞马唑仑能够促进软

骨基质的合成并抑制其分解，从而对骨关节炎的软骨退变具有改善作用。

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引言

骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病，病理特征是关节软骨的进行性退化，导致关节功能受限和疼痛[1]。骨关节炎的发病机制复杂，涉及多种因素，包括体质量过大、关节损伤和人口老龄化[2-3]，目前人口老龄化是骨关节炎患病率增加的重要危险因素[4]。临床骨关节炎治疗方法包括药物治疗、物理治疗、关节注射以及手术干预[5]，这些策略主要减轻患者的症状和延缓疾病进程，但并不能从根本上解决骨关节炎软骨退变的病理变化。探讨骨关节炎软骨退变的机制，并研发能够阻止甚至逆转关节软骨退化的药物，是骨关节炎研究领域的重要科学问题，近年来软骨细胞衰老及靶向调控细胞衰老的策略受到科研人员的关注。
细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态[6]。在正常关节软骨中，软骨细胞是唯一的细胞类型并处于静止状态，具有较低的增殖能力[7]。但在骨关节炎的发展过程中，软骨细胞出现显著衰老现象，与疾病进展紧密相关。研究表明，通过清除衰老细胞或抑制衰老相关分泌表型因子，可以有效缓解骨关节炎的症状[8]。随着衰老的发生，软骨细胞的合成代谢指标聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达受到抑制，而分解代谢指标基质金属蛋白酶13和基质金属蛋白酶3表达则增加[9]，同时核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)这一经典的信号通路也参与调控软骨细胞衰老[10]。
瑞马唑仑是一种新型苯二氮卓类药物，属于短效γ-氨基丁酸A型受体激动剂，它通过作用于γ-氨基丁酸A型受体，发挥独特的药理作用，因可控的镇静效果、快速起效和短暂的作用时间而备受关注[10]。有研究表明瑞马唑仑不仅在镇静和麻醉领域有应用，还具有抗炎和器官保护的潜力，能抑制巨噬细胞的炎症反应，减少心肌缺血损伤[11]。此外，瑞马唑仑在改善认知功能障碍和延缓老年小鼠神经退化方面也显示出一定的效果[12]。骨关节炎是炎性衰老性疾病，那么瑞马唑仑是否具有潜在的骨关节炎治疗效果？为此，该研究探讨瑞马唑仑调节软骨细胞衰老和骨关节炎炎症的作用及机制，为临床骨关节炎防治提供新的理论依据及策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞实验和随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2024年3-7月在山西医科大学第二医院骨科实验室和动物房完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选择8-10周龄C57BL/6J雄性小鼠18只，体质量25-30 g，新生五六天的C57BL/6J小鼠4-6只，均购自山西医科大学迎泽校区实验动物中心，动物生产许可证编号为SYXK (晋)2019-0009。小鼠在购买后适应性喂养1周，在18-25 ℃、50%湿度环境下饲养，并允许自由进食和饮水。严格遵循国际兽医学编辑协会(ICLAS)发布的《关于动物伦理与福利的作者指南共识》，同时符合本地及国家的相关法规。所有实验动物在进行手术时均处于麻醉状态，以最大限度地减少它们的痛苦和死亡风险。实验方案经过山西医科大学第二医院动物伦理委员会批准(审批号：DW2025001)。
1.3.2 主要试剂瑞马唑仑(货号：R114131)购自罗恩公司；胎牛血清(货号：BS1618-109 )、DMEM/F12培养基(货号：KGL1305-500)、CCK-8试剂盒(货号：AR1199)、24 Insert Cell Invasion/Migration Plates(货号：782890)、苏木精-伊红染色试剂盒(货号： C0105S)、β-半乳糖苷酶定色剂(货号：G2195)购自索莱宝公司；Ⅱ型胶原抗体(货号：ab34712)、基质金属蛋白酶3抗体(货号：ab137659)、基质金属蛋白酶13抗体(货号：ab39012)、聚集蛋白聚糖抗体(货号：ab194594)购自美国赛默飞公司；P16抗体(货号：A00016-5)、p21抗体(货号：A00145-1)购自博士德公司。
1.3.3 主要仪器细胞超净工作台(货号：HFsafe-1200)购自上海力申科学仪器有限公司；细胞培养箱(货号：BB150)购自美国Thermo 公司；酶标仪(货号：HBS-1096A)购自南京德铁实验设备有限公司；荧光倒置显微镜(货号：DMi8)购自德国Leica公司；小动物步态分析仪(货号：XR-XFP101)购自北京诺达思公司；石蜡切片机(货号：ArcadiaH+C)购自德国Leica 公司。
1.4 实验方法
1.4.1 小鼠原代软骨细胞提取与培养对4-6只新生五六天的C57BL/6J小鼠给予腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，脱颈处死浸入体积分数75%乙醇中消毒，在无菌条件下剥离四肢皮肤和肌肉，暴露透明软骨，放置在含20%双抗的PBS溶液中清洗两三次，将软骨剪碎后置于含0.2%Ⅱ型胶原酶的DMEM/F12培养基中，在37 ℃、150-200 r/min摇床中消化3 h，将细胞悬液在37 ℃、1 000 r/min离心5 min，去除上清液，使用含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/12培养基重悬细胞沉淀，接种于10 mm培养皿中进行细胞培养。待细胞长满至90%左右进行传代，1×PBS清洗，胰酶消化1 min转移至15 mL离心管中，1 200 r/min离心5 min，去除上清液，DMEM/12完全培养基重悬转移至培养皿中培养。
1.4.2 CCK-8实验检测细胞活性将第2代小鼠软骨细胞以每孔1×104个细胞密度接种到96孔板中，每孔添加100 μL DMEM/F12完全培养基，随后使用0.1%二甲基亚砜作为溶剂，制备不同浓度的瑞马唑仑溶液，终浓度分别为0，1，10，20，30，40，60，
80 μmol/L。待软骨细胞培养24 h后，加入不同浓度的瑞马唑仑溶液处理24 h，使用CCK-8细胞活性检测试剂盒，检测细胞在450 nm波长下的吸光度值。
1.4.3 β-半乳糖苷酶检测细胞衰老将第2代小鼠软骨细胞以每孔1×105个细胞密度接种到6孔板中，分为正常组(正常软骨细胞)、白细胞介素1β组、瑞马唑仑组，待软骨细胞培养24 h后白细胞介素1β组、瑞马唑仑组分别用白细胞介素1β(10 ng/mL)和白细胞介素1β (10 ng/mL)+瑞马唑仑(60 μmol/L)处理24 h[13]，采用β-半乳糖苷酶试剂盒染色，普通光学显微镜观察细胞染色情况。
1.4.4 Western blot检测将第2代小鼠软骨细胞以每孔1×105个细胞密度接种到6孔板中，每孔添加2 mL DMEM/12完全培养基，分为正常组(正常软骨细胞)、白细胞介素1β组、瑞马唑仑组，待软骨细胞培养24 h后白细胞介素1β组、瑞马唑仑组分别用白细胞介素1β(10 ng/mL)和白细胞介素1β(10 ng/mL)+瑞马唑仑(60 μmol/L)处理24 h[13]，吸去培养液，PBS冲洗3次，用含有1% PMSF+1%广谱磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，4 ℃、
12 000 r/min离心10 min，收集上清，加入适量的5×蛋白上样缓冲液，98 ℃金属浴10 min使蛋白变性，在SDS-PAGE凝胶上电泳分离80 min后，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。转膜结束后，使用5% BSA或脱脂牛奶封闭90 min。使用相应一抗(聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、P16、P21、IκB-α、P65和GAPDH抗体，稀释倍数为1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10 min，使用HRP结合的羊抗鼠/羊抗兔二抗(稀释倍数为1∶5 000)37 ℃孵育1 h，使用增强化学发光检测系统进行显色，结果用目标蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。
1.4.5 细胞免疫荧光染色将第2代小鼠软骨细胞以每孔1×104个细胞密度接种到6孔板中(内含20 mm细胞爬片)，分为正常组(正常软骨细胞)、白细胞介素1β组、瑞马唑仑组，待软骨细胞培养24 h后白细胞介素1β组、瑞马唑仑组分别用白细胞介素1β(10 ng/mL)或白细胞介素1β (10 ng/mL)+瑞马唑仑(60 μmol/L)处理24 h[13]，去除培养基，PBS清洗1次，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，每次3 min；加入细胞通透液(含0.3% Triton X-100的PBS溶液)通透15 min，PBS清洗3次；加入山羊血清封闭液封闭1 h；使用抗体稀释液稀释P65一抗(稀释比例按1∶50)，滴加一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次；滴加相应二抗避光室温孵育1 h；清洗后DAPI复染细胞核30 min，PBS清洗3次后将爬片倒扣至载玻片上加入抗荧光淬灭剂，用封固剂封固后荧光显微镜观察。
1.4.6 小鼠分组及构建内侧半月板不稳定模型将18只C57BL/6J小鼠随机分为3组：假手术组、内侧半月板失稳(destabilization of the medial meniscus，DMM)模型组和瑞马唑仑组，后两组小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(剂量为2 mL/kg)进行麻醉，对小鼠右侧膝关节周围皮肤进行备皮处理，以确保手术区域的清洁，使用体积分数75%乙醇对切口周围皮肤进行彻底消毒，以降低感染风险。在小鼠右侧膝部正前方制作一个长度约为5 mm的纵行切口，然后借助显微镊进行钝性分离，逐步分离关节囊局部的肌肉和筋膜，直至能够清晰地看到半月板与下方胫骨平台相连的韧带，最后使用镊子小心地挑断该韧带，以构建内侧半月板不稳定模型，然后逐层缝合膝关节的肌肉和皮肤。假手术组小鼠在相同部位仅打开关节囊而不切断内侧半月板，随后缝合肌肉和皮肤。术后2周，对术侧膝关节病变进行评估，包括膝关节的屈伸运动步态功能障碍和膝关节组织的肿胀情况，以此确定DMM模型是否构建成功[14]。术后3周，瑞马唑仑组腹腔注射30 mg/kg的瑞马唑仑生理盐水溶液[15]，每3 d注射1次，共干预４周。治疗结束后，通过过量麻醉处死小鼠收集右侧膝关节标本，放置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h以进行后续处理。
1.4.7 小鼠步态分析在治疗4周后，利用小动物步态分析仪(CatWalk)检测小鼠的功能恢复情况。在避光环境下，让小鼠适应周围的环境，并将它们放置在已经设定好的小动物步态分析仪的跑道上。当小鼠匀速通过固定检测区域时，系统会基于小鼠四肢施加的压力来测定步态特征，包括步频、周期、节律、足底压力、触地面积以及站立时间等。每个样本重复测量3次，以确保结果的准确性，取平均值。
1.4.8 番红O-固绿染色小鼠右侧膝关节标本在多聚甲醛中固定24 h，随后进行组织脱钙、脱水、石蜡包埋和切片处理(切片厚度5 μm)。切片经过常规脱蜡和脱水后，滴加固绿染色液染色5 min，用弱酸溶液洗涤切片15 s，在番红染色液中浸染5 min。染色完成后，用体积分数95%乙醇和无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明化处理5 min，使用中性树脂封固，光学显微镜观察关节软骨的病理学变化，采用国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritisrthritis Research Society International，OARSI)评分法对关节软骨的病理损伤程度进行评估[16]。
1.4.9 免疫荧光染色将组织切片经过常规脱蜡和脱水处理，用组化笔将标本圈出，滴加内源性过氧化酶阻断剂室温孵育10 min，PBS清洗3次，每次3 min，在37 ℃下使用胃蛋白酶进行抗原修复45 min，PBS清洗3次，每次3 min，使用山羊血清封闭1 h；滴加Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13抗体(稀释比例均为1∶100)，在4 ℃下孵育过夜，次日用PBS清洗3次，滴加相应荧光二抗(稀释比例1∶100)避光室温孵育1 h；PBS清洗后用即用型DAPI染细胞核30 min，PBS清洗后加入抗荧光淬灭剂，用封固剂封固后在荧光显微镜下进行观察。用Image Pro Plus软件对图像进行半定量分析。
1.5 主要观察指标 ①瑞马唑仑对软骨细胞活性的影响；②瑞马唑仑对软骨细胞合成分解代谢指标的影响；③瑞马唑仑对软骨细胞衰老的影响；④瑞马唑仑对软骨细胞核因子κB信号通路的影响；⑤小鼠动物行为学变化；⑥小鼠软骨组织病理学分析和细胞外基质相关蛋白表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计分析。运用Shapiro-Wilk检验对数据进行正态性检验，当数据呈正态分布时，采用t检验进行两组间比较；若涉及多组间比较，则运用单因素方差分析；若数据不符合正态分布，则采用秩和检验。P < 0.05为差异有显著性意义。使用GraphPad Prism软件对数据进行整理并绘图。文章的统计学分析已由山西医科大学统计学专家审核。

讨论

关节软骨细胞的衰老是骨关节炎发展过程中的核心环节[19]。衰老的软骨细胞表现出多种特征，包括衰老相关半乳糖苷酶表达增加[20]、端粒缩短[21]、氧化应激反应增强以及炎性衰老[22-23]，这些变化破坏了软骨细胞外基质合成与降解的平衡，进而引发软骨退化和关节炎症。衰老的软骨细胞无法维持软骨结构的稳定性，导致软骨基质快速分解和软骨层变薄[24]。此外，衰老的软骨细胞通过分泌多种促炎细胞因子(如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶[25])，改变局部微环境，加速软骨细胞衰老[26]，这些因子不仅直接破坏细胞外基质的结构，还通过诱导炎症反应和细胞周期停滞，进一步加剧软骨组织的退变[27]，这些发现突出了调控软骨细胞衰老在骨关节炎预防和治疗中的关键作用。该研究显示白细胞介素1β诱导软骨细胞加速衰老，瑞马唑仑在体外可以降低软骨细胞衰老指标，在延缓软骨细胞衰老方面具有潜在效果，为骨关节炎的治疗策略提供了新的视角。
软骨基质代谢平衡失调是引发骨关节炎发生和发展的关键因素。在正常生理状况下，软骨细胞通过合成代谢与分解代谢来维持软骨基质的稳定状态[28]，然而，在骨关节炎中这种平衡被打破，导致基质降解酶表达上调，而基质合成相关蛋白表达下调[29]。随着年龄增长，软骨细胞增殖和合成能力减弱，但其产生促炎递质和基质降解酶的能力依然存在，这些变化使软骨细胞代谢模式重构，推动骨关节炎病理进程。细胞外基质硬化也是软骨老化及骨关节炎的典型特征[30]。研究表明，细胞外基质硬化会加速软骨细胞衰老，下调组蛋白去乙酰化酶3表达，促使Parkin乙酰化激活过度线粒体自噬，加速小鼠软骨细胞衰老及骨关节炎发生[31]。该研究借助体内、体外实验，深入探究了瑞马唑仑对骨关节炎细胞外软骨基质的作用机制。在实验过程中，运用蛋白印迹、番红O-固绿染色以及免疫组织化学技术系统评估了瑞马唑仑对骨关节炎发展进程的潜在保护效能，相比于DMM模型组，瑞马唑仑组软骨中Ⅱ型胶原表达水平升高，同时基质金属蛋白酶13表达水平下降，这一系列结果证实了瑞马唑仑在促进骨关节炎软骨组织的合成代谢以及抑制分解代谢方面发挥了显著的积极作用。
核因子κB信号通路在骨关节炎的发生、发展以及病理进程中起着重要作用，其激活与炎症反应、软骨细胞凋亡以及细胞外基质降解之间存在着显著的相互作用[32]。核因子κB是一个多亚基转录因子家族，在正常生理条件下，核因子κB与抑制因子IκB结合，以非活性形式存在于细胞质中[33]。当细胞受到促炎细胞因子、机械应力或氧化应激等刺激时，IκB会被IκB激酶磷酸化并降解，从而释放核因子κB，随后核因子κB转移到细胞核内，激活一系列炎症相关基因的表达[34]。核因子κB通路的激活与软骨细胞凋亡密切相关，抑制该通路可显著减少软骨细胞凋亡，进而保护关节软骨。此外，核因子κB通路的激活还能促进基质金属蛋白酶和蛋白多糖降解酶的表达[35]，这些酶能够降解软骨基质的主要成分，如Ⅱ型胶原和蛋白多糖，从而导致软骨退化。一些药物通过抑制核因子κB通路的激活来缓解骨关节炎的症状。例如，右归丸通过抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/核因子κB信号通路中磷脂酰肌醇3激酶、磷酸化蛋白激酶B、基质金属蛋白酶14和白细胞介素6的表达，有效治疗膝骨关节炎[36]；姜黄素和白藜芦醇已被证实对核因子κB通路具有抑制作用[37]，从而为骨关节炎的治疗提供了新的思路。因此，抑制核因子κB通路的激活可能是治疗骨关节炎的一种有效策略。在此研究中，软骨细胞在白细胞介素1β干预下，IκB-α蛋白表达下降，P65蛋白表达上调。相比于白细胞介素1β组，瑞马唑仑干预后IκB-α蛋白表达显著升高，P65蛋白表达显著降低，表明瑞马唑仑可以通过抑制核因子κB信号通路缓解了白细胞介素1β诱发的小鼠软骨细胞损伤，进一步证实了瑞马唑仑对体内骨关节炎疾病具有保护作用。
尽管瑞马唑仑在小鼠骨关节炎中显示出潜在的治疗作用，但该研究存在一些不足之处：首先，瑞马唑仑的保护效果仅在动物骨关节炎中得到证实，其对人类骨关节炎患者的临床效果尚未得到验证；其次，尽管瑞马唑仑能够抑制白细胞介素1β诱导的核因子κB信号通路的激活，但它对核因子κB通路的长期抑制作用还需深入研究；最后，仍需要探讨瑞马唑仑抑制核因子κB通路的具体分子机制，以及这种抑制作用如何影响炎症递质和基质金属蛋白酶的表达，进而影响软骨细胞的功能和关节软骨的完整性。综上所述，相比现有的抗炎药物，瑞马唑仑不仅具有抗炎效果，还能保护软骨细胞，减缓软骨退变，但其临床应用的有效性仍需通过严谨的临床研究来验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

瑞马唑仑抑制软骨细胞衰老缓解骨关节炎的作用及机制

Remimazolam inhibits chondrocyte senescence and alleviates osteoarthritis: roles and mechanisms

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[1]	吕国庆, 艾孜麦提江·肉孜, 熊道海. 鸢尾素抑制人关节软骨细胞中铁死亡的作用及其机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1359-1367.
[2]	吴天翼, 缪逸鸣, 万恺晨, 滕云, 邹俊. 介孔ZLN005@聚多巴胺纳米颗粒对骨关节炎软骨细胞的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(14): 3576-3585.