毛喉素调控ERK和Akt信号通路促进C2C12成肌细胞分化

doi:10.12307/2026.024

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (5): 1114-1121.doi: 10.12307/2026.024

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

毛喉素调控ERK和Akt信号通路促进C2C12成肌细胞分化

黄柳艳，张文烯，陈淑雯，余诗美，戴忠，左长清

广东医科大学药学院，广东省东莞市 523808

收稿日期:2024-12-05 接受日期:2025-01-13 出版日期:2026-02-18 发布日期:2025-06-23
通讯作者: 左长清，博士，副教授，广东医科大学药学院，广东省东莞市 523808 并列通讯作者：戴忠，博士，副教授，广东医科大学药学院，广东省东莞市 523808
作者简介:黄柳艳，女，1999年生，广东省韶关市人，壮族，广东医科大学药学院在读硕士。
基金资助:
广东省基础与应用基础研究基金项目(2023A1515140157)，项目负责人：左长清

Forskolin promotes C2C12 myoblast differentiation via regulating the ERK and Akt signaling pathways

Huang Liuyan, Zhang Wenxi, Chen Shuwen, Yu Shimei, Dai Zhong, Zuo Changqing

School of Pharmacy, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China

Received:2024-12-05 Accepted:2025-01-13 Online:2026-02-18 Published:2025-06-23
Contact: Zuo Changqing, PhD, Associate professor, School of Pharmacy, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China Co-corresponding author: Dai Zhong, PhD, Associate professor, School of Pharmacy, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
About author:Huang Liuyan, Master candidate, School of Pharmacy, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation, No. 2023A1515140157 (to ZCQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
毛喉素(forskolin)：是一种从毛喉鞘蕊花中提取到的二萜类天然化合物，能直接、快速地激活腺苷酸环化酶，该酶能提高细胞内环磷酸腺苷的水平。作为经典的环磷酸腺苷激活剂，毛喉素已被发现在众多疾病的靶点中发挥作用，但目前关于毛喉素在成肌细胞系中的作用机制尚未见文献报道。
肌细胞生成素(myogenin)：是一种肌肉特异的转录因子，是生肌调节因子MRFs家族的一员，肌细胞生成素能促进肌肉特异性靶基因的转录，并在肌肉分化、细胞周期退出和肌肉萎缩中发挥作用，可在组织培养中的多种细胞类型中诱导肌生成，对于骨骼肌的生长发育至关重要。

背景：毛喉素是一种从毛喉鞘蕊花中提取到的二萜类天然化合物，对骨骼肌的修复具有重要的调节作用。但毛喉素对C2C12骨骼肌细胞成肌分化的调控作用尚未得到充分探索。
目的：研究毛喉素对C2C12成肌细胞系分化的影响，并探讨其潜在的分子机制。
方法：在C2C12细胞生长过程中分别加入0，0.1，0.25，0.5，1，5，10，20 μmol/L毛喉素进行处理，CCK-8和qRT-PCR检测细胞增殖情况。在诱导C2C12细胞成肌分化过程中分别加入0，0.25，0.5，1 μmol/L毛喉素进行处理，免疫荧光染色及qRT-PCR检测C2C12细胞成肌分化状况；Western blot检测影响成肌分化的相关信号通路蛋白的表达水平。
结果与结论：①高浓度(> 1 μmol/L)毛喉素处理后，C2C12细胞的活力下降，细胞增殖被抑制。②与0 μmol/L组比较，成肌诱导4 d时，
qRT-PCR结果显示毛喉素能够上调Myh2、Myh4、Myomaker的表达，但是下调Myh7的表达；免疫荧光染色结果表明，毛喉素处理后C2C12细胞的融合指数和肌管直径均增加，肌管的数量增多。③Western blot结果表明成肌分化诱导2 d时，毛喉素处理明显抑制细胞外信号调节激酶1/2磷酸化蛋白表达水平，促进蛋白激酶 B磷酸化蛋白表达；毛喉素处理会显著上调成肌分化转录因子肌细胞生成素蛋白表达水平。④结果表明，毛喉素可能通过调控细胞外信号调节激酶1/2及蛋白激酶 B信号传导促进C2C12骨骼肌细胞成肌分化。

https://orcid.org/0009-0008-1777-122X(黄柳艳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 毛喉素, 成肌分化, C2C12细胞, ERK1/2, Akt, 骨骼肌, 肌细胞生成素, 细胞增殖

Abstract: BACKGROUND: Forskolin, a diterpenoid natural compound extracted from Coleus forskohlii, has a crucial regulatory role in skeletal muscle repair. However, the regulatory role of forskolin on myogenic differentiation of C2C12 skeletal muscle cells has not been fully explored.
OBJECTIVE: To explore the effects of forskolin on the differentiation of C2C12 myoblast cell line and probe into the underlying molecular mechanisms.
METHODS: C2C12 cells were treated with 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 5, 10 and 20 μmol/L forskolin during growth, and cell proliferation was detected by cell counting kit-8 and qRT-PCR. C2C12 cells were treated with 0, 0.25, 0.5 and 1 μmol/L forskolin during the induction of myogenic differentiation. Immunofluorescence staining and qRT-PCR were used to detect C2C12 cells differentiation. Western blot was used to detect the expression level of myogenic differentiation-related signaling pathway proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The viability of C2C12 cells was decreased and cell proliferation was inhibited after treatment with high concentrations (> 1 μmol/L) of forskolin. (2) The qRT-PCR results showed that forskolin up-regulated the expression of Myh2, Myh4, Myomaker, but down-regulated the expression of Myh7 compared with the 0 μmol/L group, when C2C12 cells were differentiated for 4 days. Immunofluorescence staining results showed that the fusion index and myotube diameter of C2C12 cells were increased after forskolin treatment, and the number of myotubes was also increased. (3) Western blot results showed that the phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2 expression was inhibited; however, the phosphorylated protein kinase B was promoted after treatment with forskolin. The protein expression level of the myogenic differentiation transcription factor Myogenin was significantly up-regulated after treatment with forskolin. The above results demonstrate that forskolin may promote myogenic differentiation of C2C12 skeletal muscle cells through the extracellular signal-regulated kinase 1/2 and protein kinase B signaling pathway.

Key words: myogenic differentiation, C2C12 cell, ERK1/2, Akt, skeletal muscle, myogenin, cell proliferation

中图分类号:

黄柳艳, 张文烯, 陈淑雯, 余诗美, 戴忠, 左长清. 毛喉素调控ERK和Akt信号通路促进C2C12成肌细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(5): 1114-1121.

Huang Liuyan, Zhang Wenxi, Chen Shuwen, Yu Shimei, Dai Zhong, Zuo Changqing. Forskolin promotes C2C12 myoblast differentiation via regulating the ERK and Akt signaling pathways[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(5): 1114-1121.

图/表（结果） 6

2.1 毛喉素对C2C12细胞活力的影响首先，使用C2C12成肌细胞研究了不同浓度毛喉素处理的细胞毒性，将C2C12细胞分别与不同浓度的毛喉素(0-20 μmol/L)孵育48 h后进行CCK-8检测。结果显示，无论是在含体积分数1%胎牛血清或是在体积分数10%胎牛血清的培养基中培养，低浓度的毛喉素对C2C12成肌细胞的增殖过程无细胞毒性(图1A)，但是当毛喉素浓度增加，细胞活力下降，并在毛喉素浓度> 1 μmol/L时活性下降20%左右(图1B)。这些数据表明，高剂量毛喉素处理会抑制C2C12细胞的活性。
2.2 毛喉素对C2C12细胞增殖相关基因的影响为了进一步探讨毛喉素是否会影响C2C12细胞的增殖，在毛喉素处理C2C12细胞36 h后进行qRT-PCR检测。结果显示，CDK4表达水平在毛喉素处理的细胞和对照组细胞之间没有差异(图2A)；PCNA表达水平在毛喉素处理浓度为5 μmol/L的时候下降(图2B)；Cyclin D1表达水平在毛喉素处理浓度> 0.25 μmol/L时开始下降，毛喉素处理浓度为5 μmol/L时CyclinD1表达水平大幅下降(图2C)。以上结果说明高浓度毛喉素对C2C12细胞具有抗增殖作用。
2.3 毛喉素对C2C12细胞成肌分化的影响
2.3.1 qPCR分析为了研究毛喉素对C2C12细胞成肌分化的影响，用不同浓度的毛喉素(0，0.25，0.5，1 μmol/L)孵育C2C12细胞，并在处理后进行qPCR分析，观察毛喉素对成肌分化标志基因mRNA表达的影响。在成肌分化4 d时，经毛喉素处理的细胞Myh2、Myh4基因表达水平较0 μmol/L毛喉素组增加(图3A)，肌肉特异性膜蛋白Myomaker的表达水平也增加，而主要在Ⅰ型慢缩肌纤维中表达的Myh7

的表达水平降低。因此推测毛喉素除了影响成肌分化过程中成肌细胞的融合，同时也参与了快慢肌纤维的转化。
2.3.2 免疫荧光染色为了进一步探讨毛喉素对C2C12细胞肌管形成的影响，在C2C12细胞诱导分化第4天时，用抗MyHC抗体进行免疫荧光染色，检测C2C12细胞的分化形态。可以看到0 μmol/L毛喉素组C2C12细胞已经有一定数量分化融合形成的多核肌管，然而，在毛喉素处理的细胞中，多核肌管的数量明显更多，并且肌管的长度和宽度也更长

(图3B)。此外，定量分析数据显示：毛喉素处理后的C2C12细胞融合指数上升(图3C)，与0 μmol/L毛喉素组相比，毛喉素处理各组肌管直径明显增加(图3D)。总之，与0 μmol/L毛喉素组相比，毛喉素处理各组MyHC阳性肌管的数量明显增多。以上结果表明，毛喉素能有效促进C2C12成肌细胞的分化。
2.4 毛喉素通过调控ERK1/2和Akt信号通路影响C2C12成肌细胞分化先前研究表明，ERK1/2对哺乳动物骨骼肌生成至关重要 [15]。为了探讨毛喉素促进C2C12细胞分化的分子机制，采用Western blot法检测了毛喉素处理C2C12细胞分化2 d时ERK1/2磷酸化蛋白水平的变化(图4)。与对照组C2C12细胞相比，毛喉素处理2 d的C2C12细胞中磷酸化ERK1/2的蛋白表达显著减少，而总ERK1/2蛋白的水平保持不变(图4A)，表明毛喉素的促肌生成作用依赖于ERK1/2信号通路的抑制。此外，在调节肌肉发育的信号通路中，Akt信号通路在肌肉生长中起着核心作用 [16]，因此同时检测了Akt信号通路的变化，结果发现，成肌分化2 d时，毛喉素处理组磷酸化Akt的蛋白表达水平升高(图4C)，表明毛喉素的促肌生成作用还依赖于Akt信号通路的激活。

2.5 毛喉素对C2C12细胞成肌转录因子的影响研究还探索了毛喉素处理是否通过促进肌细胞生成素的表达从而刺激肌源性分化(图5)。为了验证假设，采用Western blot法检测了毛喉素处理后成肌分化2 d肌细胞生成素的蛋白表达，结果表明，与对照组细胞相比，经过毛喉素处理的C2C12细胞中的肌细胞生成素的表达水平在成肌分化2 d时显著增加。因此，结果揭示毛喉素可能通过影响肌细胞生成素的表达从而作用于成肌分化。

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引言

毛喉素是一种半日花烷型二萜类化合物，主要存在于毛喉鞘蕊花根部的木栓组织中 [1]。作为一种天然化合物，毛喉素安全性高，在医学中具有多方面的应用。由于毛喉素能够激活腺苷酸环化酶，提高环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的水平，目前在许多疾病治疗中发现具有良好的潜在价值 [2-3]，如抗青光眼、缓解皮肤衰老、治疗哮喘和心血管疾病、改善肥胖、抗菌抗肿瘤等 [3-5]。
作为人体最重要的器官之一，骨骼肌能够维持机体的基本代谢和运动。骨骼肌的形成是成肌细胞不断增殖到一定程度，开始停止分裂，然后分化融合形成多核肌管，再进一步形成成熟的肌纤维，肌纤维再组装的过程；分化是骨骼肌形成过程中十分关键的一步，受到众多因素的调控和影响 [6-7]。
大量研究表明毛喉素在细胞分化过程中具有调控作用，毛喉素给药可以改善高脂饮食喂养小鼠的葡萄糖代谢，减小其脂肪细胞的直径，同时抑制小鼠间充质干细胞的成脂分化，降低细胞内三酰甘油水平 [8]。将毛喉素装载于纤维蛋白-聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架以达到局部短期递送，此方法能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，并诱导骨组织的形成 [9]。成脂、成骨及成肌是紧密联系的几个细胞生物过程，目前毛喉素在肌生成方面的研究较少，用毛喉素培养的卫星细胞能够保持其表型特征和在体内移植的能力，移植后也能保持成肌活性；联合使用毛喉素、碱性成纤维细胞和糖原合酶激酶3β (glyoogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制剂BIO可以诱导人类诱导性多能干细胞和脂肪干细胞的骨骼肌分化从而产生肌肉祖细胞，这些肌源性祖细胞可以移植到肌肉中，有助于肌肉的修复 [10-11]。毛喉素可以增强肌源性转分化 [12]，还能增强wnt 1介导的肌生成 [13]。通过激活促甲状腺素受体下游的信号通路，毛喉素减缓了骨骼肌干细胞的衰老，增加干细胞再生潜能，从而逆转杜氏肌营养不良肌肉细胞的衰老，促进骨骼肌组织修复 [14]。这些研究提示毛喉素可能在肌肉发育中具有积极的作用，然而毛喉素对成肌细胞分化的影响及其潜在的分子机制尚未阐明。因此，此项研究的目的是探讨毛喉素对成肌细胞分化的影响，并确定可能的机制，为进一步探索毛喉素对骨骼肌再生的作用及其潜在机制，以及骨骼肌相关疾病的治疗提供一定的见解。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞观察实验。多组间差异比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)评估。
1.2 时间及地点实验于2023年8月至2024年11月在广东医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 C2C12细胞购自中国科学院上海细胞库。
1.3.2 主要试剂胎牛血清、0.25%胰酶、DMEM培养基 (Hyclone，美国)；青霉素/链霉素(Cytiva，美国)；马血清(Gibco，美国)；毛喉素、Phosphatase Inhibitor Cocktail Ⅰ/Ⅱ(MCE，美国)；RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、TB Green@Premix Ex TapTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TAKARA，日本)；PVDF膜(Merk Millipore，德国)；脱脂奶粉(上海麦克林生化科技股份有限公司，中国)；phospho-ERK1/2 (1∶1 000)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2；1∶1 000)(CST，美国)；蛋白激酶B(protein kinase B，Akt；1∶5 000)、phospho-Akt (1∶5 000)(Abcam，美国)；肌细胞生成素(myogenin，1∶500；Santa Cruz Biotechnology，美国)；Hsp90(1∶1 000)、蛋白酶抑制剂PMSF、DAPI染色液、RIPA、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔IgG抗体(H+L)(碧云天生物技术有限公司，中国)；ECL试剂盒(Zeta Life，美国)；4%组织细胞固定液(Solarbio，中国)；Triton X-100(广州威佳科技有限公司，中国)；驴血清(华越洋生物，中国)；MyHC (1∶150，Sigma，德国)；Alexa Fluor® 594(Abcam，美国)；CCK-8试剂 (DOJINDO，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 C2C12细胞培养及成肌分化诱导

成肌分化诱导：采用13-18代C2C12细胞用于实验，按1.4×104/cm2的细胞密度接种于12孔细胞培养板，每孔1 mL含1%青霉素/1%链霉素、体积分数10%胎牛血清的完全培养基，当细胞融合度达95%左右，更换为含1%青霉素/1%链霉素、体积分数2%马血清的完全培养基，每2 d更换1次诱导液。
1.4.2 细胞给药处理将1 mg毛喉素溶解于0.243 6 mL的二甲基亚砜中，配制为10 mmol/L的母液，避光于-80 ℃储存。使用时在培养基中添加上述母液，以12孔板为例，取2 μL母液与18 μL培养基完全混匀即将毛喉素稀释至1 mmol/L，然后在1 mL培养基中分别加入0.1，0.25，0.5，1，5，10，20 μL 1 mmol/L的毛喉素，使得毛喉素在培养基中的终浓度分别为0.1，0.25，0.5，1，5，10，20 μmol/L。对照组在培养基中加入相应二甲基亚砜。
将C2C12细胞按1.4×104/cm2的细胞密度接种于12孔细胞培养板，每孔1 mL含1%青霉素/1%链霉素、体积分数10%胎牛血清的完全培养基，当细胞融合度达95%左右，更换为含不同浓度毛喉素的分化培养基诱导细胞分化，每2 d更换1次含不同浓度毛喉素的分化培养基，根据实验需要，诱导培养至2 d或4 d。
1.4.3 CCK-8检测C2C12 细胞增殖每孔3 000个C2C12细胞接种于96孔培养板中，每孔含100 μL完全培养基，分别用含有体积分数1%及10%胎牛血清的生长培养基处理细胞12 h换液，将不同浓度的毛喉素(同1.4.2)加入培养基中处理细胞48 h。为检测细胞活力，每孔加入CCK-8试剂10 μL，将96孔培养板放入培养箱中反应2 h，在450 nm处用多功能酶标仪测定吸光度值。
1.4.4 qRT-PCR检测细胞增殖相关基因及成肌标志基因表达水平
(1)检测细胞增殖相关基因的表达：用不同浓度毛喉素(0，0.25，0.5，1，5 μmol/L)处理C2C12细胞36 h后，检测细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4，CDK4)、增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)基因的表达。采用总RNA提取试剂RNAiso Plus从C2C12成肌细胞中提取总RNA。cDNA的合成使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒，共从总RNA中反转录1 μg用于qRT-PCR。qRT-PCR采用TB Green@Premix Ex TapTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒，参照试剂盒说明书配制样品溶液，采用LightCycler 96荧光定量PCR仪的检测系统进行检测。以36B4基因为内参对照进行归一化。
(2)检测成肌标志基因(Myh1、Myh2、Myh4、Myh7、Myomaker)表达：用不同浓度的毛喉素(0，0.25，0.5，1 μmol/L)孵育C2C12细胞4 d后进行qRT-PCR分析。
所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。
1.4.5 Western Blot 检测相关信号通路蛋白表达水平用不同浓度的毛喉素(0，0.5，1 μmol/L)孵育C2C12细胞后进行Western Blot 检测。采用含有蛋

白酶抑制剂PMSF和Phosphatase Inhibitor Cocktail Ⅰ/Ⅱ的RIPA裂解液从细胞液中提取总蛋白。蛋白质样品用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转移到PVDF膜上，将膜在含5%脱脂奶粉的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBST)中封闭1.5 h，然后用稀释至一定比例的特异性一抗[phospho-ERK1/2(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 000)、phospho-Akt(1∶5 000)、Akt(1∶5 000)、Hsp90(1∶1 000)、肌细胞生成素(1∶500)]在4℃孵育过夜，用TBST溶液洗膜后，用以1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔IgG抗体(H+L)在室温孵育1.5 h，孵育后用TBST溶液洗涤，最后使用ECL试剂盒检测特异性蛋白条带。使用FCM成像系统观察图像，然后使用Image J软件对图像进行定量分析，以Hsp90作为内参对照。
1.4.6 免疫荧光检测肌管变化用组织细胞固定液固定C2C12成肌细胞30 min，用0.3% Triton X-100室温通透30 min。封闭细胞样品用体积分数10%驴血清在37 ℃中孵育30 min，然后用抗MyHC抗体在4 ℃下孵育16 h以上。用PBS洗涤样品后，细胞样品用1∶200稀释的二抗Alexa Fluor® 594处理1.5 h。细胞核用DAPI染色液染色10 min。最后，使用倒置荧光显微镜观察染色细胞，并捕获图像。所有指标采用Image J软件进行分析，其中肌管融合指数=(阳性肌管内的细胞核数/总细胞核数)×100%。
1.5 主要观察指标 ①C2C12细胞活力和增殖情况；②C2C12细胞成肌分化标志基因的表达；③C2C12细胞成肌相关信号通路蛋白的表达；④C2C12细胞成肌转录因子蛋白的表达。
1.6 统计学分析应用Image J对Western Blot实验的条带进行灰度值分析。采用GraphPad Prism 9统计软件进行统计分析。至少3个独立实验的结果显示为平均值±标准误。使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)评估多组间的组间差异。分别以P < 0.05，
P < 0.01，P < 0.001表示差异的显著性水平。文章的统计学方法已经通过广东医科大学生物统计学专家审核。

讨论

此次研究表明，高浓度毛喉素处理会降低C2C12细胞的活力并且抑制C2C12细胞的增殖。在诱导分化条件下，毛喉素处理上调成肌标志基因的表达，促进肌管的形成；持续使用毛喉素作用C2C12细胞显著上调肌细胞生成素的表达，并显著促进肌管的融合。结果还发现毛喉素通过抑制ERK1/2磷酸化，促进Akt磷酸化从而促进C2C12细胞成肌分化。
毛喉素是天然存在的二萜类化合物，作为一个经典且高效的环磷酸腺苷形成诱导剂，它的作用机制与环磷酸腺苷响应的下游信号通路密切相关 [17]。而环磷酸腺苷作为一种必不可少的细胞内第二信使，由ATP通过腺苷酸环化酶催化生成，环磷酸腺苷参与调节增殖、分化、迁移、生存等细胞功能，也被发现能够影响脂质代谢、糖尿病和肌肉减少症等疾病 [18-20]。而成肌细胞的增殖与分化对肌肉的生长、发育及修复至关重要 [6]。此次研究发现，毛喉素能够抑制C2C12细胞的增殖，高浓度的毛喉素使增殖相关基因PCNA、CyclinD1表达下降同时影响细胞活力。细胞周期及细胞增殖均由细胞周期蛋白和它的催化基团细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)所驱动，其中D型细胞周期蛋白常与CDK4/6结合形成二聚体启动DNA的复制 [21]。而PCNA是DNA聚合酶的一种辅助蛋白，协调许多蛋白质的招募到 DNA 复制位点，积极地参与到DNA的复制及代谢中，与细胞周期的控制密不可分 [22]。此外，由于骨骼肌细胞分化需要成肌细胞早期不可逆地退出细胞周期 [23]，并且已经有部分研究发现毛喉素对骨骼肌质量和功能的修复作用，因此猜测毛喉素对骨骼肌形成的必需步骤分化可能存在一定影响。此次研究使用了C2C12小鼠成肌细胞系构建成肌模型，从而探索毛喉素对肌源性分化的作用。在研究中检测了毛喉素对成肌分化标志基因表达的影响，结果显示毛喉素可以上调Myh2及Myh4的表达但是显著下调了Myh7的表达。大多数骨骼肌由不同的肌纤维混合组成，这些肌纤维根据不同的收缩和代谢特性可以分为快型肌纤维和慢型肌纤维，它们会选择性地表达负责其特性的基因，其中慢型肌纤维表达 Myh7，快型肌纤维表达 Myh1、Myh2、Myh4 [24]。而肌纤维类型组成并非固定不变，会受到外界因素及内在细胞因子、信号通路的调控和影响 [25]。该研究结果强烈提示毛喉素可能在肌纤维转换的过程中发挥调节作用，当然，还需要进一步的研究来确定毛喉素更深的作用机制。此外，毛喉素还显著促进了Myomaker的表达。MyoD和肌细胞生成素可以诱导Myomaker转录，而Myomaker能够促进C2C12细胞的融合，是成肌细胞融合的必要条件 [26]。与此对应，经毛喉素处理后，C2C12细胞的融合指数有所上升。以上皆表明毛喉素具有促肌生成的作用。
过往研究发现，环磷酸腺苷也会积极与细胞内其他信号通路相互作用与影响，如细胞因子、Ras-Raf-ERK通路、PI3K-Akt通路等 [3，27]。而在这项研究中，确定了ERK1/2和Akt在毛喉素介导的肌源性分化中的作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路是一个典型的信号级联反应通路，细胞的增殖、迁移、分化和衰老等关键细胞功能均受MAPK信号通路的调节，其中ERK1/2途径被研究得最广泛 [28-29]。研究发现毛喉素可以通过提高小鼠心肌成纤维细胞胞内环磷酸腺苷水平，从而降低下游p44/42 MAPK 磷酸化水平，抑制结缔组织生长因子的表达 [30]。经过毛喉素处理的人结肠癌细胞(SW480和HT-29)中的磷酸化ERK水平降低 [31]。此次研究在C2C12细胞的分化培养基中加入毛喉素，诱导成肌分化2 d时可以明显观察到与对照组相比，磷酸化ERK1/2的表达显著下降。已有许多研究证明ERK1/2对肌生成的负向调控作用，MAPK1/ERK2、MAPK3/ERK1的活性在肌生成诱导后24 h显著降低，抑制MAPK1/3促进成肌细胞分化 [32]。在C2C12细胞中，敲低Apol9a通过增加ERK1/2磷酸化抑制肌源性分化 [33]；虫草素通过激活ERK1/2信号通路从而抑制成肌分化 [34]；抑制 ERK1/2 活性明显增强了维生素 C 刺激的肌生成 [35]。此外，MAPK活性水平与肌生成素表达之间存在相关性，抑制ERK1/2活性能够增强肌细胞生成素的表达，而ERK通路可以通过阻止肌细胞生成素的表达或功能，进一步抑制肌细胞分化 [36-37]；在分化培养基中加入ERK1/2抑制剂后，相比于培养在没有添加抑制剂的分化培养基中的细胞，细胞中的分化和融合因子MyoD、肌细胞生成素、Mymk和Mymx的上调明显提早，细胞分化和融合也增强 [38]。而在此次研究中，发现毛喉素处理诱导成肌2 d时肌细胞生成素的表达显著升高，与成肌分化2 d时磷酸化ERK1/2水平降低相对应，说明毛喉素很有可能通过调节肌细胞生成素的表达而影响肌管的形成，ERK1/2则是调控肌发生的上游信号因子，通过调控肌细胞生成素的表达激活成肌分化过程。此外，进一步探索发现毛喉素处理细胞成肌分化2 d时，磷酸化Akt的表达上调。Akt是经典的控制骨骼肌生长的正向调节因子 [39]，研究表明毛喉素能通过激活Akt调节人脐内皮细胞血管生成过程 [40]，毛喉素处理后能增强DNA损伤诱导的Akt磷酸化 [41]。而Akt也被发现常与ERK1/2共同调节肌肉的生长发育，DI-10通过激活ERK、Akt信号传导促进成肌细胞分化 [42]；Selumetinib 通过抑制 ERK1/2和激活Akt信号可有效预防癌症恶病质模型中的骨骼肌萎缩 [43]；MFG-E8 和乳清蛋白联合使用通过影响PI3K/Akt/PGC-1α 和 MAPK/ERK 信号级联减轻衰老相关肌肉减少症，维持骨骼肌的质量与功能 [44]。
总之，研究证明了毛喉素在C2C12细胞肌生成中的正向调节作用及潜在的分子机制。毛喉素显著诱导成肌细胞分化，其促肌生成作用是通过抑制ERK1/2和促进Akt信号通路介导的。然而，此研究仅在体外进行，存在一定的局限性，还需要大量的体内研究进一步验证毛喉素调控肌肉分化作用。目前的研究结果证明了毛喉素可能有助于骨骼肌的生成与修复。研究首次发现毛喉素通过影响ERK1/2及Akt信号，调控成肌分化转录因子肌细胞生成素表达促进肌源性分化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

毛喉素调控ERK和Akt信号通路促进C2C12成肌细胞分化

Forskolin promotes C2C12 myoblast differentiation via regulating the ERK and Akt signaling pathways

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