人脐带间充质干细胞来源外泌体治疗SD大鼠骨质疏松性股骨骨折

doi:10.12307/2025.538

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (31): 6634-6641.doi: 10.12307/2025.538

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人脐带间充质干细胞来源外泌体治疗SD大鼠骨质疏松性股骨骨折

卜宪敏1，梁迪2，张斌3，徐英杰2，丁豪2，吴彬4，田荣华4

1济宁市第一人民医院病理科，山东省济宁市 272067；2 济宁医学院临床医学院，山东省济宁市 272067；济宁医学院附属医院，3检验科，4创伤骨科，山东省济宁市 272067

收稿日期:2024-04-20 接受日期:2024-06-11 出版日期:2025-11-08 发布日期:2025-02-19
通讯作者: 田荣华，硕士，医师，济宁医学院附属医院创伤骨科，山东省济宁市 272067
作者简介:卜宪敏，女，1980 年生，山东省微山县人，汉族，2006年福建医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事外科病理学研究。共同第一作者：梁迪，女，1995年生，山东省汶上县人，汉族，济宁医学院在读硕士，主要从事外科病理学研究。
基金资助:
济宁医学院高层次科研项目培育计划(JYGC2021FKJ016)，项目负责人：吴彬；济宁市重点研发计划基金(2021YXNS029)，项目负责人：吴彬；济宁市重点研发计划基金(2022YXNS129)，项目负责人：卜宪敏；济宁医学院附属医院主诊医师团队专项临床研究计划(ZZTD-MS-2023-04)，项目负责人：吴彬

Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells in treatment of osteoporotic femoral fractures in SD rats

Bu Xianmin1, Liang Di2, Zhang Bin3, Xu Yingjie2, Ding Hao2, Wu Bin4, Tian Ronghua4

1Department of Pathology, Jining No. 1 People’s Hospital, Jining 272067, Shandong Province, China; 2School of Clinical Medicine, Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China; 3Department of Laboratory, 4Department of Orthopedic Trauma, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China

Received:2024-04-20 Accepted:2024-06-11 Online:2025-11-08 Published:2025-02-19
Contact: Tian Ronghua, MS, Physician, Department of Orthopedic Trauma, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China
About author:Bu Xianmin, MS, Associate chief physician, Department of Pathology, Jining No. 1 People’s Hospital, Jining 272067, Shandong Province, China; Liang Di, Master candidate, School of Clinical Medicine, Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China Bu Xianmin and Liang Di contributed equally to this work.
Supported by:
High-Level Scientific Research Project Cultivation Program of Jining Medical University, No. JYGC2021FKJ016 (to WB); Jining Key Research & Development Program Fund, No. 2021YXNS029 (to WB); Jining Key Research & Development Program Fund, No. 2022YXNS129 (to BXM); Attending Physician Team Special Clinical Research Program of Affiliated Hospital of Jining Medical University, No. ZZTD-MS-2023-04 (to WB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

外泌体：是纳米级的囊泡，直径为30-100 nm，具有双层脂膜分子结构，含蛋白质、代谢物和核酸等生物活性成分，是细胞-细胞间信息通讯的重要递质，通过融合、受体介导的内吞、微胞饮和可溶性信号传导等多种途径影响靶细胞功能。
骨质疏松症：是由于成骨细胞和破骨细胞活性失衡而引起的一种严重的骨代谢疾病。WHO将其定义为以骨量低、骨组织微结构退化、骨脆性和骨折风险增加为特征的全身性骨骼疾病。

摘要
背景：人脐带间充质干细胞来源外泌体已广泛用于骨修复和重建研究，能显著促进成骨和血管生成。
目的：探究人脐带间充质干细胞来源外泌体治疗骨质疏松性骨折的机制。
方法：采用组织块培养法提取人脐带间充质干细胞及超速离心法提取人脐带间充质干细胞来源外泌体并进行鉴定。30只12周龄雌性SD大鼠随机分为假手术组(6只)和去势组(24只)。去势组采用经典的去势法构建骨质疏松模型，术后12周随机选取去势组6只大鼠与假手术组6只大鼠行Micro-CT及苏木精-伊红染色进行模型验证。验证骨质疏松模型构建成功后，将去势组剩余18只大鼠随机分为3组，均构建骨质疏松性股骨骨折模型，骨折端分别注射PBS(PBS组)、1.5×1011 particles/mL(低浓度外泌体组)、3×1011 particles/mL(高浓度外泌体组)外泌体。骨折术后4周行影像学及组织学观察评估骨折愈合和骨组织血管生成情况。
结果与结论：①大体标本观察：与PBS组相比，外泌体组骨折愈合速度明显增快，骨折端骨痂生成量显著增加；②X射线片评分：外泌体组显著高于PBS组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③Micro-CT三维成像：与PBS组相比，外泌体组骨折愈合加快，骨痂生成量显著增加；外泌体组骨体积分数显著高于PBS组，差异有显著性意义(P < 0.01)；④苏木精-伊红染色和Masson染色：与PBS组相比，外泌体组有更多的骨小梁生成，有更多的新生骨组织生长；⑤免疫组织化学染色：与PBS组相比，外泌体组骨钙素与CD31的表达更加显著；高浓度外泌体组较低浓度外泌体组新生血管密度更大，骨痂生成量更多，骨折愈合增快，呈现浓度依赖性。结果表明，人脐带间充质干细胞来源外泌体可通过促进血管生成和成骨，最终促进骨质疏松性骨折修复，其机制可能与CD31和骨钙素表达增加有关。

https://orcid.org/0000-0001-6516-4178 (田荣华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨质疏松性骨折, 人脐带间充质干细胞, 外泌体, 骨折愈合, 骨钙素, CD31

Abstract: BACKGROUND: Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells are widely used for bone repair and reconstruction, significantly enhancing osteogenesis and promoting angiogenesis.
OBJECTIVE: To explore the mechanisms of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of osteoporotic fractures.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were extracted using tissue block culture method. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells were extracted using ultracentrifugation method for identification. Thirty 12-week-old female SD rats were randomly divided into sham-operated group (n=6) and ovariectomized group (n=24). Osteoporosis model was established by castration in the ovariectomized group. 12 weeks after modeling, 6 rats in the ovariectomized group and 6 rats in the sham-operated group were randomly selected for Micro-CT and hematoxylin-eosin staining to verify the models. After verification, the remaining 18 rats in the ovariectomized group were randomly assigned to three groups to establish osteoporotic fracture models. The fracture end was separately injected with PBS (PBS group), exosomes at 1.5×1011 particles/mL (low-concentration exosome group), and 3×1011 particles/mL (high-concentration exosome group). Four weeks after operation, fracture healing and bone angiogenesis were evaluated by imaging and histological observations.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In the gross specimens, compared with the PBS group, the exosome group had faster fracture healing and more callus formation. (2) The X-ray score of fracture healing in the exosome group was significantly higher than that in the PBS group, and the difference was significant (P < 0.05). (3) Micro-CT three-dimensional imaging: Compared with the PBS group, the fracture healing in the exosome group was accelerated and the callus formation was significantly increased; the bone volume fraction in the exosome group was significantly higher than that in the PBS group, and the difference was significant (P < 0.01). (4) Hematoxylin-eosin staining and Masson’s trichrome staining showed that bone trabeculae and the new bone tissue in the exosome group were more than those in the PBS group. (5) Immunohistochemical staining showed that the expression of CD31 and osteocalcin in the exosome group was significantly higher than that in the PBS group. The high-concentration exosome group had a higher density of new blood vessels, more callus formation, and faster fracture healing than the low-concentration exosome group, showing a concentration-dependent manner. The results show that exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells can promote the repair of osteoporotic fracture by enhancing the angiogenesis and osteogenesis. The mechanism may be related to the increased expression of CD31 and osteocalcin.

Key words: osteoporotic fracture, human umbilical cord mesenchymal stem cell, exosome, fracture healing, osteocalcin, CD31

中图分类号:

卜宪敏, 梁迪, 张斌, 徐英杰, 丁豪, 吴彬, 田荣华 . 人脐带间充质干细胞来源外泌体治疗SD大鼠骨质疏松性股骨骨折[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6634-6641.

Bu Xianmin, Liang Di, Zhang Bin, Xu Yingjie, Ding Hao, Wu Bin, Tian Ronghua. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells in treatment of osteoporotic femoral fractures in SD rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(31): 6634-6641.

图/表（结果） 2

2.1 人脐带间充质干细胞传代培养及hucMSCs-exo鉴定结果 经传代培养，可见人脐带间充质干细胞贴壁生长，状态良好，形态呈梭形或长梭形。纳米粒度分析仪检测外泌体粒径为40-100 nm，透射电子显微镜观察到hucMSCs-exo呈现典型的椭圆形形态，细胞膜结构完整，见图1。以上结果表明，已成功提取外泌体。
2.2 实验动物数量分析 实验选用 SD大鼠30只，造模后无死亡，全部进入结果分析。
2.3 骨质疏松模型鉴定结果 Micro-CT扫描及骨组织定量分析显示，与假手术组相比，去势组大鼠骨小梁数量明显减少，结构排列紊乱，间隙增宽。与假手术组相比，骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量均显著减少，差异有显著性意义(P < 0.01)；骨小梁分离度增加，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。苏木精-伊红染色显示，与假手术组相比，去势组大鼠骨小梁厚度降低，数量减少，骨小梁稀疏，结构紊乱，小梁间充斥大量脂滴，见图3。
2.4 各组大鼠股骨骨折端骨痂生成情况 在骨折术后4周，大体观察到骨折端周围的组织愈合良好。PBS组与外泌体组之间未发现明显的愈合差异。此外，在外泌体组中未观察到免疫排斥反应现象。PBS组骨折端纤维组织连接，少量骨痂形成，骨折端无明显愈合迹象；低浓度外泌体组可见骨折端部分骨痂形成；高浓度外泌体组骨折端大量骨痂形成，骨折基本愈合，见图4。
2.5 各组大鼠骨折愈合X射线片评分 PBS组骨折线清晰可见，少量骨痂形成，骨折端无明显愈合迹象；低浓度外泌体组骨折线模糊，骨折端周围可见较多骨痂形成；高浓度外泌体组骨折线基本消失，骨折端大量骨痂形成，骨折基本愈合。PBS组、低浓度外泌体组、高浓度外泌体组骨折愈合X射线片评分分别为0.83±0.40，1.67±0.51，3.17±0.40，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.6 各组大鼠Micro-CT扫描及骨体积分数 PBS组骨折线清晰可见，骨折端周围可见少量骨痂形成，骨折端愈合迹象不明显，骨折未愈合；低浓度外泌体组可见部分骨折线模糊，骨折端周围可见较多骨痂形成；高浓度外泌体组骨折线基本消失，骨折端大量骨痂形成，骨折基本愈合。组间比较感兴趣区域骨体积分数差异有显著性意义(P < 0.01)，见图6。
2.7 各组大鼠股骨组织形态学观察 苏木精-伊红染色可见，与PBS组相比，外泌体组有更多骨痂生成，其中高浓度外泌体组新生骨组织面积最大，有大量骨小梁生成，骨小梁排列趋向规则。Masson三色染色可见，与PBS组相比，外泌体组胶原纤维组织更加致密，排列趋向规则，新生骨组织较多，见图7。
2.8 各组大鼠股骨组织CD31和骨钙素表达水平 免疫组织化学染色可见，外泌体组CD31、骨钙素表达水平高于PBS组，见图8。

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引言

骨质疏松症是一种以骨量减少、微观结构破坏和脆性骨折为特征的骨代谢疾病[1]。据统计，全世界约有2亿骨质疏松症患者，在中国50岁以上人群中患病率为19.2%(男性6.0%，女性32.1%)，65岁以上人群中患病率则高达32.0%(男性10.7%，女性51.6%)[2-3]。据报告，每年骨质疏松症导致的骨折数量超过890万，随着社会人口老龄化，骨质疏松症已成为严重的公共健康问题[4]。双膦酸盐是目前治疗骨质疏松症的主要药物，然而，其治疗效果欠佳且不良反应较多[5]。因此，仍然需要寻找一种更安全可靠的替代疗法治疗骨质疏松症。
骨组织是高度血管化的结缔组织，血管生成对于骨发育、再生和重塑必不可少[6]。骨组织血管生成障碍与骨质疏松的病理进程密切相关[7]，因此，各种促血管生成的治疗方法被广泛应用于骨组织修复再生研究。外泌体作为一种无细胞治疗途径，近年来研究证实在促进血管生成方面具有巨大的潜力。外泌体是大小30-100 nm的有双层脂膜分子结构的囊泡，可从多种类型细胞中释放，内含多种调节受体细胞行为的生物活性成分，是细胞间信息通讯的重要递质[8]。外泌体与其母细胞生物学功能相似，具有良好的生物相容性、低免疫原性和低细胞毒性[9]。研究表明，人脐带间充质干细胞来源外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cells exosomes，hucMSCs-exo)在促进血管生成和多种组织修复重建中效果显著，如类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症和骨坏死等[10-11]。然而，hucMSCs-exo治疗骨质疏松性骨折的机制尚未明确。该研究通过构建骨质疏松性大鼠骨折模型，探究hucMSCs-exo治疗骨质疏松性骨折的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2021年4月至2022年1月在济宁医学院及济宁医学院附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要仪器及试剂 石蜡包埋机(德国，Leica EG-1160)；切片机(德国，Leica RM2245)；全自动染色机(德国，Leica ST5010)；封片机(德国，Leica CV5030)；倒置光学显微镜(日本，OLYMPUS CKX53)；Micro-CT(瑞士，SCANCO Medical AG)；Micro-CT(中国，Nemo NMC-100)；苏木精-伊红染液(北京索莱宝)；Masson三色染色液(北京索莱宝)；CD31、骨钙素一抗(武汉赛维尔)；山羊抗兔二抗(武汉赛维尔)。
1.3.2 脐带组织 脐带组织来自济宁医学院附属医院足月妊娠健康新生儿，经产妇及家属知情同意。
1.3.3 实验动物 30只12周龄雌性SD大鼠，体质量(200±10) g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20190003，单独网笼饲养，温度(25±2) ℃，12 h光/暗周期，可自由获取水与食物，实验前适应环境1周。
该研究经济宁医学院附属医院伦理委员会批准( 批准号：2020B115)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞分离培养及hucMSCs-exo提取 在无菌条件下收集新鲜脐带组织，去除脐动静脉，清洗后剪成小组织块，平铺于培养皿，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，隔日换液，细胞生长融合度约为90%时进行1∶2传代。将人脐带间充质干细胞传代培养至第3-5代，选取生长状态良好的细胞接种于不含血清的DMEM培养基中培养48 h，收集细胞培养上清液，通过高速离心法提取hucMSCs-exo，在4 ℃条件下1 500×g离心5 min，取上清，2 000×g离心10 min，取上清，10 000×g离心30 min，取上清，100 000×g离心1 h，保留沉淀，得到最终的外泌体。纳米粒度分析仪检测外泌体粒径，透射电子显微镜观察外泌体形态。将鉴定及定量后的外泌体于-80 ℃保存，用PBS根据实验所需浓度进行稀释，用于后续实验。
1.4.2 动物分组 30只SD大鼠随机分为假手术组(n=6)和去势组(n=24)。去势组通过经典的去势法建立骨质疏松模型[12]，假手术组进行相同手术步骤，但保留卵巢，术后12周，去势组随机选取6只大鼠与假手术组大鼠行Micro-CT检查及苏木精-伊红染色，进行模型验证。模型验证后去势组剩余18只骨质疏松症大鼠构建骨质疏松性骨折模型[13]，然后随机分为3组(n=6)，对骨折端进行不同处理。PBS组骨折端注射100 µL PBS；低浓度外泌体组骨折端注射100 µL浓度为 1.5×1011 particles/mL的hucMSCs-exo；高浓度外泌体组骨折端注射100 µL浓度为 3.0×1011 particles/mL的hucMSCs-exo，均为造模后即刻注射。注射后4周取材，进行X射线拍片、Micro-CT扫描、苏木精-伊红染色、Masson三色染色及免疫组织化学染色观察血管生成及骨折愈合情况。
1.4.3 骨质疏松模型构建 大鼠术前禁食12 h，戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，背部剃毛备皮，俯卧位固定，消毒铺巾。去势组取背部纵行切口，逐层钝性分离，进入腹腔，结扎输卵管，切除双侧卵巢。假手术组行相同手术程序，但不结扎切除卵巢。术后保暖，复苏后单独饲养，术后连续3 d给予青霉素钠抗感染，盐酸曲马多镇痛。
1.4.4 骨质疏松模型鉴定 去势术后常规饲养12周，麻醉后颈椎脱臼处死大鼠，取左侧股骨，剔除多余组织，置于40 g/L多聚甲醛溶液固定48 h，使用Micro-CT(SCANCO Medical AG，uCT100，瑞士)进行三维图像扫描(参数设置：管电压 80 kV，管电流500 μA，曝光时间800 ms)，分析如下指标：骨密度、骨小梁数目、平均骨小梁厚度、平均骨小梁分离度。扫描后标本流水冲洗24 h，10%EDTA脱钙6周，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，切片(片厚5 μm)，行苏木精-伊红染色。
1.4.5 骨质疏松骨折模型构建 骨质疏松模型造模成功后，大鼠麻醉后备皮，取仰卧位，先取左下肢髌骨旁切口，暴露股骨髁间，置入1.2 mm克氏针，给予股骨内固定；再于左下肢外侧股骨中点纵行切开皮肤，逐层钝性分离组织，暴露股骨，于中段锯断股骨，复位后用生理盐水冲洗；术中按分组对骨折端进行不同处理，PBS组骨折端注射100 µL PBS；低浓度外泌体组骨折端注射100 µL浓度为 1.5×1011 particles/mL的hucMSCs-exo；高浓度外泌体组骨折端注射100 µL浓度为 3.0×1011 particles/mL的hucMSCs-exo；术后逐层缝合，消毒，单独饲养，常规抗感染、镇痛。
1.4.6 骨折愈合X射线片影像学评估 骨折术后4周，根据骨折愈合X射线片评分标准对骨折愈合情况进行影像学量化评估[14]。评分标准：0分，骨折线清晰可见，无明显骨膜反应；1分，骨折断端边缘趋向模糊，骨膜轻度反应，无骨痂可见；2分，断端边缘模糊，骨膜反应浅淡，骨痂少量，密度较淡，边缘不整齐；3分，断端边缘仍可见，但接近消失，骨膜反应较深，骨痂量增多，但尚未填满缺损，密度增深，边缘较清；4分，断端边缘完全消失，骨膜反应密度近似骨影，骨痂填满缺损，与骨皮质密度相同并相互连接。
1.4.7 Micro-CT三维扫描重建计算骨体积分数 骨折术后4周，股骨远端感兴趣区域用高分辨率Micro-CT(Nemo NMC-100，中国)进行扫描(参数设置：管电压90 kV，管电流 60 μA)，使用Avatar 1.6.3软件重建扫描图像，计算骨体积分数(BV/TV)。
1.4.8 苏木精-伊红染色及Masson三色染色 扫描后标本流水冲洗24 h，10%EDTA脱钙6周，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，切片(片厚5 μm)。①苏木精-伊红染色：切片置于二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ5 min；切片依次置于梯度乙醇(体积分数100%，95%，85%，70%，50%)中各5 min；蒸馏水浸洗5 min；苏木精染色5 min；流水缓慢冲洗5 min；1%盐酸乙醇分化10 s，蒸馏水缓慢冲洗2 min；伊红复染3 min；切片依次置于梯度乙醇(体积分数50%，70%，85%，95%Ⅰ，95% Ⅱ，100%Ⅰ，100%Ⅱ)中各1 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min；晾干玻片，使用中性树脂进行封固处理；镜下观察，拍照。②Masson三色染色：切片脱蜡复水；2.5%重铬酸钾室温媒染过夜(15 h)；切片浸于重铬酸钾，烤箱孵育(65 ℃，30 min)，同时将丽春红与1%磷钼酸预热；Weigert铁苏木精浸染处理5 min，使用流水缓慢冲洗至无色状态；1%盐酸乙醇分化1 min，流水稍洗；丽春红浸染6 min；1%磷钼酸浸泡分化1 min；2.5%苯胺蓝染色2-30 s(短时多次)；1%冰醋酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各漂洗分化8 s；脱水，透明，封固；镜下观察，拍照。
1.4.9 免疫组织化学染色 石蜡切片行免疫组织化学染色，观察各组大鼠骨组织血管生成和骨折愈合相关蛋白的表达。切片脱蜡复水；切片置于37 ℃胰蛋白酶中孵育25 min，PBS缓慢冲洗3次(5 min/次)；切片置于体积分数3%过氧化氢溶液室温避光孵育25 min，PBS冲洗3次(5 min/次)，甩干；切片置于牛血清白蛋白覆盖封闭30 min；甩掉封闭液，滴加CD31、骨钙素一抗4 ℃孵育过夜，PBS缓慢冲洗3次(5 min/次)；滴加二抗至覆盖切片上的组织，室温孵育50 min，PBS缓慢冲洗3次(5 min/次)；滴加DAB液(现配现用)，镜下观察至棕黄色染色阳性，PBS冲洗，终止染色；苏木精染色20 s，流水冲洗；脱水，透明，封固；镜下观察，拍照。利用Image J软件统计CD31、骨钙素阳性表达率。
1.5 主要观察指标 ①骨折愈合X射线片评分；②Micro-CT三维扫描图像及骨体积分数；③骨折端新生骨组织面积；④骨组织CD31、骨钙素表达水平。
1.6 统计学分析 计量资料以x±s 表示，使用GraphPad Prism 8.0进行数据分析处理及绘图。去势组与假手术组Micro-CT数据行独立样本 t 检验进行比较；PBS组、低浓度外泌体组、高浓度外泌体组骨折愈合X射线片评分、Micro-CT扫描数据通过单因素方差分析(one-way ANOVA)进行比较，组间采用Bonferronis多重比较。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经济宁医学院附属医院生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松症是以骨量减少、骨组织微结构恶化、骨强度降低为特征，尤其是在绝经后的老年女性群体[15]。骨质疏松症最重要的并发症是骨质疏松性骨折，也被称为脆性骨折，导致再次骨折风险、致残率和死亡率显著增加[16-17]。近年来，hucMSCs-exo在骨组织修复再生领域的应用受到了广泛关注。然而，hucMSCs-exo对骨质疏松性骨折治疗的分子机制至今尚未阐明。该研究通过切除雌性SD大鼠双侧卵巢，构建去势骨质疏松模型，然后构建骨质疏松性骨折模型，探究hucMSCs-exo对骨质疏松性骨折愈合影响的分子机制。
骨质疏松症的传统治疗药物包括雌激素、降钙素、特立帕肽和双膦酸盐等[18-19]。尽管药物有一定的治疗作用，但药物引起的骨折延迟愈合和致癌性已得到证实，其他治疗如钙剂和维生素的补充效果也欠佳[20]。此外，药物治疗通常只是阻止疾病进展，不能有效恢复骨组织结构[21]。因此寻求更加安全有效的生物治疗方法促进骨质疏松性骨折愈合，显得尤为重要。
近年来研究发现，外泌体可能成为潜在的治疗途径。外泌体在体内通过传递生物信息可调节受体细胞功能，具有抗炎、促进组织修复等能力，相对于细胞治疗具有低免疫原性、易储存和无致瘤性等优点，且治疗作用与母体干细胞相似[22]。人脐带间充质干细胞具有取材无创性、成本低、收集方便及增殖分化能力强等优点，是细胞治疗和再生医学的首选细胞来源[23-24]。多项研究表明hucMSCs-exo在骨骼、软骨、肾脏、眼部、神经、肝脏、心脑血管和肿瘤等众多疾病的治疗中发挥重要作用[25-27]。hucMSCs-exo可减少失用性骨质疏松症大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡，从而逆转失用性骨质疏松症的进展[28]。外泌体具有免疫调节功能，能抑制炎症反应，促进组织修复[29-30]。该研究骨质疏松性骨折术后4周，取大体标本，观察到骨折端周围的组织愈合良好，在PBS组与外泌体处理组之间未发现明显的愈合差异，在外泌体组中未观察到免疫排斥反应现象，可见hucMSCs-exo促进了骨折修复，骨痂生成量明显增加。X射线片影像学检查显示，外泌体组骨折线模糊，相较于PBS组骨折愈合速度明显增快。Micro-CT扫描可见，PBS组骨折线清晰可见，骨折端只有少许骨痂生成，而外泌体组骨折端可见较多骨痂生成，骨折线几乎消失；组间比较感兴趣区域骨体积分数差异有显著性意义；苏木精-伊红染色及与Masson三色染色表明，外泌体组新生骨组织和骨小梁数量更多，胶原纤维组织排列趋向规律，且更加致密。这与WANG等[31]研究结果相似，其设计了一种动态水凝胶，研究发现加入hucMSCs-exo的水凝胶组有更多的新生骨组织，证明hucMSCs-exo可有效促进大鼠骨愈合。
骨代谢涉及成骨细胞、破骨细胞及骨相关细胞之间的相互作用。蛋白质和RNA分子作为外泌体的重要组成部分，可以参与骨代谢的细胞信号传导[32]。HU等[33]研究表明，hucMSCs-exo通过递送强效促成骨蛋白CLEC11A，促进了骨髓间充质干细胞从成脂到成骨分化的转变，增强骨形成和减少骨吸收来防止骨质疏松小鼠的骨质流失并保持骨强度。LEE 等[34]研究表明脂肪组织来源干细胞外泌体通过递送骨保护素、miR‐21‐5p和let-7b-5p，显著抑制了骨质疏松小鼠破骨细胞分化，促进了骨愈合。
血管生成是各种组织修复再生所必需的条件。骨是一种高度血管化的结缔组织，血管向骨细胞运输氧气、营养物质和生长因子等，同时清除代谢产物，在骨折愈合过程中必不可少[35]。ZHANG等[36]研究发现hucMSCs-exo不仅促进了成骨分化，还促进了血管内皮生长因子和缺氧诱导因子1α的表达，表明hucMSCs-exo对大鼠股骨骨折模型的血管生成和骨愈合有明显的促进作用。此外，研究表明hucMSCs-exo可促进血管内皮生长因子的表达，且外泌体来源miR-21-5p具有促进血管生成和增强成骨的能力[37-38]。免疫组织化学染色可见，外泌体组CD31、骨钙素的表达高于PBS组，表明外泌体组有更多的新生骨组织。以上结果表明hucMSCs-exo促进了血管生成，从而在骨愈合过程中发挥促进成骨分化的作用。
综上，实验结果表明hucMSCs-exo可通过促进骨质疏松性骨折血管生成，促进成骨，最终促进骨折修复，其机制可能与CD31和骨钙素表达增加有关，这一研究有可能为骨质疏松性骨折修复提供一种新的无细胞疗法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞来源外泌体治疗SD大鼠骨质疏松性股骨骨折

Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells in treatment of osteoporotic femoral fractures in SD rats

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