硅酸盐生物活性玻璃纤维对磷酸钙骨水泥性能的影响

doi:10.12307/2025.473

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (28): 5994-6002.doi: 10.12307/2025.473

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

硅酸盐生物活性玻璃纤维对磷酸钙骨水泥性能的影响

卢雨征1，2，熊英杰2，单验博2，叶健廷2，武艳斌2，宋继鹏1，张垚1，2，林万程1，2，瓮琪瑞2，程萱2，孟昊业2，许文静2，彭江2，丁立祥1

1首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京市 100038；2解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所，北京市 100853

收稿日期:2024-04-15 接受日期:2024-07-06 出版日期:2025-10-08 发布日期:2024-12-07
通讯作者: 彭江，博士，教授，解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所，北京市 100853 丁立祥，博士，教授，首都医科大学附属北京世纪坛医院脊柱外科，北京市 100038
作者简介:卢雨征，男，1990年生，北京市人，汉族，首都医科大学在读博士，医师，主要从事骨科相关的骨缺损修复材料研究。
基金资助:
京津冀基础研究合作专项项目(22JCZXJC00130)，项目负责人：许文静

Effect of silicate bioactive glass fiber on properties of calcium phosphate bone cement

Lu Yuzheng1, 2, Xiong Yingjie2, Shan Yanbo2, Ye Jianting2, Wu Yanbin2, Song Jipeng1, Zhang Yao1, 2, Lin Wancheng1, 2, Weng Qirui2, Cheng Xuan2, Meng Haoye2, Xu Wenjing2, Peng Jiang2, Ding Lixiang1

1Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; 2Research Institute of Orthopedic Medicine Department of Fourth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Received:2024-04-15 Accepted:2024-07-06 Online:2025-10-08 Published:2024-12-07
Contact: Peng Jiang, PhD, Professor, Research Institute of Orthopedic Medicine Department of Fourth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China Ding Lixiang, PhD, Professor, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China
About author:Lu Yuzheng, Doctoral candidate, Physician, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; Research Institute of Orthopedic Medicine Department of Fourth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Supported by:
Beijing-Tianjin-Hebei Basic Research Cooperation Special Project, No. 22JCZXJC00130 (to XWJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

磷酸钙骨水泥：由固相(一种或多种磷酸钙粉末)按一定比例与液相(水、血液、含钙或磷酸盐的溶液)混合反应后形成的生物材料。磷酸钙骨水泥具有一定的可降解性和良好的生物相容性，其固化后的最终产物主要为羟基磷灰石或二水磷酸氢钙。
生物活性玻璃：是一种具有良好骨诱导能力、生物活性并可自行降解的生物材料，能对机体组织进行修复与再生。

背景：磷酸钙骨水泥的力学性能差、成骨能力弱等问题阻碍了其进一步发展。硅酸盐生物活性玻璃因具有良好的生物活性及成骨能力而备受青睐，同时其纤维结构能够加强材料的力学强度。

目的：探究硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥的力学性能、生物相容性及成骨效果。
方法：将不同质量百分比(0%，10%，20%)的硅酸盐生物活性玻璃纤维分别加入磷酸钙骨水泥固相中，与液相混合后固化48 h，得到磷酸钙骨水泥与硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥，表征骨水泥的力学性能、凝固时间及离子析出情况。将3组骨水泥浸提液分别与MC3T3-E1细胞共培养，通过CCK-8检测、活死染色、鬼笔环肽染色评估材料的细胞相容性；成骨诱导后，通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、RUNX2免疫荧光染色及RT-PCR检测评估材料的成骨诱导能力。

结果与结论：①随着硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，骨水泥的抗压强度与抗弯强度均升高，凝固时间延长；将骨水泥浸泡于模拟体液中均可检测到硅离子、钙离子、磷离子析出，并且随着硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，骨水泥释放的硅离子、磷离子质量浓度升高，钙离子质量浓度降低；②活死染色、鬼笔环肽染色结果显示，硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥对MC3T3-E1细胞无毒性作用；CCK-8检测结果显示，硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥可促进MC3T3-E1细胞的增殖；③随着骨水泥中硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性及细胞外钙沉积均增加，RUNX2蛋白表达增加，碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2 mRNA表达增加；④结果表明，硅酸盐生物活性玻璃纤维可增强磷酸钙骨水泥的力学性能与成骨诱导能力，其中以20%硅酸盐生物活性玻璃纤维的效果更明显。

https://orcid.org/0009-0002-4321-8141 (卢雨征)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 骨缺损, 骨水泥, 硅酸盐生物活性玻璃, 磷酸钙骨水泥, 骨移植

Abstract: BACKGROUND: The development of calcium phosphate bone cement is limited due to its poor mechanical properties and weak osteogenic ability. Silicate bioactive glass is highly favored due to its excellent biological activity and osteogenic ability. Simultaneously, fiber structures can enhance the mechanical strength of materials.
OBJECTIVE: To investigate the mechanical properties, biocompatibility, and osteogenic effect of silicate bioactive glass fiber composite calcium phosphate bone cement.
METHODS: Different mass percentages (0%, 10%, and 20%) of silicate bioactive glass fiber were added to the solid phase of calcium phosphate bone cement, mixed with the liquid phase and cured for 48 hours to obtain silicate bioactive glass fiber composite calcium phosphate bone cement. The mechanical properties, setting time, and ion precipitation of the cement were characterized. The three groups of bone cement extracts were co-cultured with MC3T3-E1 cells. The cell compatibility of the materials was evaluated by CCK-8 assay, live/dead staining, and phalloidin staining. After osteogenic induction, the osteogenic induction ability of the materials was evaluated by alkaline phosphatase staining, alizarin red staining, RUNX2 immunofluorescence staining, and RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the increase of silicate bioactive glass fiber content, the compressive strength and flexural strength of bone cement increased, and the setting time was prolonged. When bone cement was immersed in simulated body fluid, the precipitation of silicon ions, calcium ions, and phosphorus ions could be detected. Moreover, with the increase of silicate bioactive glass fiber content, the mass concentration of silicon ions and phosphorus ions released by bone cement increased, and the mass concentration of calcium ions decreased. (2) Live/dead staining and phalloidin staining results exhibited that silicate bioactive glass fiber composite calcium phosphate bone cement had no toxic effect on MC3T3-E1 cells. CCK-8 assay results showed that silicate bioactive glass fiber composite calcium phosphate bone cement could promote the proliferation of MC3T3-E1 cells. (3) With the increase of silicate bioactive glass fiber content in bone cement, the alkaline phosphatase activity and extracellular calcium deposition of MC3T3-E1 cells increased, the expression of RUNX2 protein increased, and the expression of alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin, and RUNX2 mRNA expression increased. (4) The results indicate that silicate bioactive glass fibers can enhance the mechanical properties and osteogenic induction ability of calcium phosphate bone cement, among which 20% silicate bioactive glass fibers have a more obvious effect.

Key words: bone defect, bone cement, silicate bioactive glass, calcium phosphate bone cement, bone graft

中图分类号:

卢雨征, 熊英杰, 单验博, 叶健廷, 武艳斌, 宋继鹏, 张垚, 林万程, 瓮琪瑞, 程萱, 孟昊业, 许文静, 彭江, 丁立祥. 硅酸盐生物活性玻璃纤维对磷酸钙骨水泥性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(28): 5994-6002.

Lu Yuzheng, Xiong Yingjie, Shan Yanbo, Ye Jianting, Wu Yanbin, Song Jipeng, Zhang Yao, Lin Wancheng, Weng Qirui, Cheng Xuan, Meng Haoye, Xu Wenjing, Peng Jiang, Ding Lixiang. Effect of silicate bioactive glass fiber on properties of calcium phosphate bone cement[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(28): 5994-6002.

图/表（结果） 8

2.1 各组骨水泥力学性能检测结果随着硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，磷酸钙骨水泥的抗压强度与抗弯强度升高，组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，P < 0.000 1)，见表2，图2。

2.2 各组骨水泥凝固时间检测结果随着硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，磷酸钙骨水泥的凝固时间延长，组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.000 1)，见表2。
2.3 各组骨水泥微观形貌观察结果扫描电镜下可见磷酸钙骨水泥截面有水化产物密集堆叠，10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥截面硅酸盐生物活性玻璃纤维嵌入基质内，基质内分布Ca、C、P等元素，见图3。

2.4 各组骨水泥离子析出情况各组骨水泥体外浸泡于模拟体液1周后均可检测到硅离子、钙离子、磷离子析出，并且随着硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，骨水泥释放的硅离子、磷离子质量浓度升高，钙离子质量浓度降低，见图4。

2.5 各组骨水泥的细胞相容性 CCK-8检测结果显示，培养1 d，3组间细胞增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养3，5 d，10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组细胞增殖快于磷酸钙骨水泥组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组细胞增殖快于10%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组(P < 0.05，P < 0.01)，见图5A。
活死染色结果显示3组均未见到明显死细胞，表明3组骨水泥无细胞毒性，见图5B。鬼笔环肽染色结果显示，相较于磷酸钙骨水泥组，10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组MC3T3-E1细胞形态呈纺锤形且更为延展，见图5C。

2.6 各组骨水泥的体外成骨诱导性能
2.6.1 碱性磷酸酶染色及定量分析碱性磷酸酶染色结果显示，10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组碱性磷酸酶染色深度明显强于磷酸钙骨水泥组，并且以20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组染色深度最强；定量分析结果显示，10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组碱性磷酸酶活性高于磷酸钙骨水泥组(P < 0.000 1)，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组碱性磷酸酶活性高于10%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组(P < 0.001)，见图6A，B。
2.6.2 茜素红染色茜素红染色结果显示，磷酸钙骨水泥组及10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组矿化结节形成依次增加，见图6C，表明了材料诱导的晚期细胞外钙沉积。

2.6.3 RUNX2免疫荧光染色及定量分析 10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组细胞核内RUNX2染色强度高于磷酸钙骨水泥组，并且20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组RUNX2染色强度最高，见图7。

2.6.4 RT-PCR检测结果与磷酸钙骨水泥组比较，10%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组碱性磷酸酶、骨桥蛋白及骨钙素mRNA表达均升高(P < 0.05)，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组碱性磷酸酶、RUNX2、骨桥蛋白及骨钙素mRNA表达均升高(P < 0.05，P < 0.001)；与10%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组比较，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组碱性磷酸酶、RUNX2、骨桥蛋白mRNA表达均升高(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，见图8。

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引言

骨组织可依靠自身能力修补小于临界尺寸的骨缺损[1]，但临床操作中面对较大范围的骨缺损则需要生物材料的填充。在20世纪80年代发展起来的磷酸钙骨水泥因具有可塑性和原位硬化等优点而被众多学者所重视[2]。磷酸钙骨水泥是由固相(一种或多种磷酸钙粉末)按一定比例与液相(水、血液、含钙或磷酸盐的溶液)混合反应后形成的生物材料，其固化后的最终产物主要为羟基磷灰石或二水磷酸氢钙。其中，羟基磷灰石的无机成分、钙磷比与正常骨组织基本相同，故磷酸钙骨水泥与人体组织有良好的生物相容性。然而，磷酸钙骨水泥机械硬度差、成骨能力弱、降解速度慢等问题严重影响了其临床使用[3-4]。为了弥补不足，将磷酸钙骨水泥与其他无机物构建复合材料是一良好的解决方案。
生物活性玻璃为第三代生物材料，能够促进组织的自我修复，通过诱导细胞在分子水平上的响应达到促进组织再生的目的[5]。生物活性玻璃的主要特点是具有较高的生物活性、骨诱导性及降解能力，植入体内后通过Si离子的释放在材料表面与生物环境发生特殊的化学反应，使材料与骨组织形成牢固的化学键合，最终诱导新骨形成[6]。生物活性玻璃本身不适合直接用作支架基质材料，但生物活性玻璃纤维可增强基础材料的抗压应力，促使裂纹和边缘钝化并减少临界长度的裂纹数量，由此显著提高材料的韧性和强度[7-8]。
此次实验以磷酸钙骨水泥为基础，加入硅酸盐生物活性玻璃纤维，制备出硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥，在保证磷酸钙骨水泥原有特性的同时增强力学强度，又充分发挥了生物活性玻璃的生物活性及骨诱导能力，期望硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥可以作为一种新型的骨移植和骨修复材料。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备、表征及体外细胞学实验，组间比较进行单因素向方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年10月至2023年12月在解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所完成。
1.3 材料磷酸钙骨水泥(上海瑞邦生物材料有限公司)；硅酸盐生物活性玻璃纤维(含11.1%-12.0% Na2O、15.0%-17.1% K2O、2.8%-3.3% MgO、12.7%-15.2% CaO、2.7%-3.8% P2O5、1.0%-1.4% B2O3、0%-0.6% TiO2、48.5%-52% SiO2，直径75 μm、长度3 mm，纳通科技集团)；维卡仪(无锡中科建材有限公司)；电子万能试验机(MTS Model E43，创诚致佳公司)；扫描电子显微镜(thermo scientific Apreo 2S，能谱Ultra Dry 检测器，美国)；电感耦合等离子体发射光谱仪(安捷伦，725ES，USA)；MC3T3-E1细胞(博赛乐生物，北京)；青-链霉素双抗(Gibco，15070063)；胰酶 (Gibco，15050065)；α-MEM培养液、胎牛血清(Gibco，美国)；CCK-8试剂盒(碧云天，C0038)；死活染色试剂(碧云天，C2015M)；酶标仪(Biotek，美国)；碱性磷酸酶BCIP/NBT染色试剂盒、茜素红染料、F-actin(碧云天，中国)；Anti-RUNX2、山羊抗免IgG H&L (abcam，英国)；体视显微镜(Nikon DS-Ri2)；山羊血清(Solarbio，中国)；FastPure细胞/组织总RNA分离试剂盒(Vazyme，中国)；5×RT Master Mix (TOYOBO，日本)；Stepone Real-time PCR System (Applied Biosystems，中国)；全景共聚焦成像仪(3DHISTECH，匈牙利)；Triton X-100(Sigma，美国)。
1.4 实验方法

1.4.1 硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥的制备磷酸钙骨水泥的固液比为2.5 g/mL。分别将不同质量百分比的硅酸盐生物活性玻璃纤维(0%，10%，20%)加入至磷酸钙骨水泥固相粉末中，与液相混合搅拌成糊状后移入特氟龙模具中(图1)，在37 ℃、100%湿度下固化48 h，得到磷酸钙骨水泥与10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥。体外细胞实验用骨水泥样品采用60Co灭菌。硅酸盐生物活性玻璃纤维质量百分比超过20%难以制备骨水泥样品，因此实验选择加入10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维。

1.4.2 骨水泥的力学性能测试取3组骨水泥，每种骨水泥检测3个样本，采用电子万能试验机分别进行抗压测试与三点弯实验。
抗压测试：在特氟龙模具中(φ5 mm×10 mm)制备骨水泥，抛光样本后置于电子万能试验机上，采用1 mm/min的加载速度进行抗压测试。
三点弯实验：在特氟龙模具(50 mm×7 mm×3 mm)制备骨水泥，将样品置于电子万能试验机20 mm支撑跨度上，十字头速度为1 mm/s，当位移值达到最大值3 mm时自动终止实验，计算抗弯强度作为骨水泥的韧性指标。
1.4.3 骨水泥凝固时间测试将骨水泥置于圆柱形模具中，置于温度37 ℃、湿度100%的烘箱中进行固化，使用维卡仪测试3组骨水泥的凝固时间。采用300 g、1 mm针头进行测试，针头垂直于骨水泥表面自由滑落，从骨水泥混合结束开始计时，到针头未能在骨水泥3个独立区域产生可见压痕(不超过1 mm)的时间，记录为固化时间。每个标本重复3次，计算平均值[9]。
1.4.4 骨水泥微观结构观察及离子浓度析出分析将3组骨水泥在在真空干燥环境下喷金(10 s)，使用扫描电子显微镜观察骨水泥横截面形态，X射线能谱分析样品元素组成。将3组骨水泥(n=3)分别浸泡于模拟体液(浸泡比例为0.2 g/mL)中，保持37 ℃恒温水浴，每2 d更换模拟体液。
浸泡1周后，采用电感耦合等离子体发射光谱仪分析溶液中钙离子、硅离子、磷离子质量浓度变化。
1.4.5 骨水泥的细胞相容性检测在4 ℃环境下，将骨水泥按照0.2 g/mL的比例浸泡于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的α-MEM培养液中浸提72 h，得到骨水泥浸提液。
CCK-8检测：将MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，细胞密度为2×103/孔，接种12 h细胞贴壁后，分别加入磷酸钙骨水泥浸提液及10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥浸提液，每孔100 µL，每组3复孔。培养1，3，5 d后，每孔加入10 µL CCK-8溶液和90 µL α-MEM培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育1-1.5 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
细胞活死染色：将MC3T3-E1细胞接种于24孔板中，细胞密度为8×103/孔，接种12 h细胞贴壁后，分别加入磷酸钙骨水泥浸提液及10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥浸提液，每孔500 µL，每组3复孔。培养3 d后，每孔加入300 μL Calcein AM/PI染色试剂避光孵育30 min，使用PBS清洗孔板，置于体视显微镜下观察活细胞(Calcein AM为绿色荧光)和死细胞的图像(PI为红色荧光)。
鬼笔环肽荧光染色：将MC3T3-E1细胞接种于24孔板中，细胞密度为8×103/孔，接种12 h细胞贴壁后，分别加入磷酸钙骨水泥浸提液及10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥浸提液，每孔500 µL，每组3复孔。培养3 d后，使用40 g/L多聚甲醛溶液在冰上固定15 min，用0.5%Triton X-100对细胞透化10 min；吸取3 μL荧光标记的鬼笔环肽溶液滴于细胞爬片表面，室温下避光孵育20 min；使用DAPI染色液标记细胞核染色5 min，置于全景共聚焦成像仪下观察细胞形态。
1.4.6 骨水泥的体外成骨诱导能力在4 ℃环境下，将骨水泥按照0.2 g/mL的比例浸泡于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素、50 μmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油和100 nmol/L地塞米松的α-MEM培养液(成骨诱导培养液)中浸提72 h，得到骨水泥成骨诱导浸提液。
碱性磷酸酶染色：将MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，细胞密度为8×103/孔，1 d后弃原培养液，分别加入磷酸钙骨水泥成骨诱导浸提液及10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥成骨诱导浸提液，每孔100 µL。成骨诱导7 d后，将细胞与碱性磷酸酶BCIP/NBT染色工作液在室温下避光孵育40 min，吸去洗净液体后置于体视显微镜下观察并拍照；同时，加入裂解液裂解细胞，1 200 r/min离心5 min后取上清液，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测量样本总蛋白浓度，通过碱性磷酸酶检测试剂盒检测样本中碱性磷酸酶蛋白的表达量，最后标准化单位蛋白中碱性磷酸酶表达量。
茜素红染色：细胞接种与分组培养同碱性磷酸酶染色。成骨诱导21 d后，室温下每孔加入100 μL茜素红染料染色孵育60 min，置于体视显微镜下观察细胞晚期成骨钙化效果。
RUNX2免疫荧光染色：将MC3T3-E1细胞接种于已放置爬片的24孔板中，细胞密度为5×103/孔，分别加入磷酸钙骨水泥成骨诱导浸提液及10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥成骨诱导浸提液，每孔500 µL。成骨诱导7 d后，用0.3%Triton X-100破膜，洗涤后抗原修复5 min；用山羊血清阻断假阳性，3 h后加入RUNX2一抗(稀释比例1∶100)4 ℃孵育过夜，避光复温半小时；洗涤后加入荧光二抗(稀释比例1∶200)孵育2 h，加DAPI染色5 min，用水性封固剂封固，置于全景共聚焦成像仪下观察。利用Image J软件计算荧光强度。

RT-PCR检测：将MC3T3-E1细胞接种于6孔板中，细胞密度为2×103/孔，分别加入磷酸钙骨水泥成骨诱导浸提液及10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥成骨诱导浸提液，每孔1 mL，每组重复3次。成骨诱导7 d后，使用FastPure细胞/组织总RNA分离试剂盒提取细胞RNA，检测RNA含量后，使用5×RT Master Mix反转录成cDNA，采用2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix在Stepone Real-time PCR System上对成骨基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、RUNX2和骨钙素进行定量实时聚合酶链反应，以GAPDH为内参，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，重复40个循环。采用2-ΔΔCt方法进行基因表达分析。引物序列见表1所示。

1.5 主要观察指标硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥的凝固时间、微观形貌、力学性能、离子释放、生物相容性及体外诱导成骨效果。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析及绘图，实验数据以x±s表示。组间比较进行单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过首都医科大学生物统计学专家审核。

讨论

理想的骨植入材料应具有：生物降解性，以便实现骨重塑；具有多孔结构，使组织向内生长；一定的力学强度，可用作骨缺损的力学支撑；骨诱导能力，可作为生长因子或细胞的载体[1，10]。磷酸钙骨水泥的生物相容性、原位硬化等能力可部分满足临床的需求，但低断裂韧性和高脆性限制了磷酸钙骨水泥在负重区的进一步应用。通常，骨水泥在没有明显变形情况下的突然断裂表现为脆性破坏，因引起断裂所需的变形很小，所以断裂功也很低。在材料抗压过程中纤维增强可阻碍裂纹扩展，将磷酸钙骨水泥的破坏模式从脆性转变为韧性，这显著降低了材料崩裂的可能[11-12]。加入生物活性玻璃纤维后，复合材料的主裂纹从初始缺口扩展的速度明显滞后，并且缺口尖端钝化可以缓解应变集中，同时复合材料中的部分载荷由纤维承担。生物活性玻璃纤维的弹性模量越高，所承受的载荷越大，因此生物活性玻璃纤维增强的骨水泥具有较高的抗弯能力[13]。此次实验采用硅酸盐生物活性玻璃纤维增强磷酸钙骨水泥的力学性能，扫描电镜下观察到纤维嵌入磷酸钙骨水泥基质内，抗压应力和三点弯曲实验结果表明，随着硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，磷酸钙骨水泥的抗压应力水平和韧性强度均明显增强，这与SHUAI等[14]的研究结果一致。另一方面，随着材料的逐步降解，新生骨可替代材料继续承载周围应力，由此保证了内植物的稳定性[15]。也有研究认为在羟基磷灰石中添加50%生物活性玻璃时结合强度最佳[16]，但此次实验发现，当硅酸盐生物活性玻璃纤维质量百分比超过20%后难以制备骨水泥样本。也有学者认为生物活性玻璃抑制了羟基磷灰石的热分解，显著提高了羟基磷灰石的弯曲强度和断裂韧性[17]。
为满足临床要求，骨水泥的凝固时间是重要考虑因素。随着硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，骨水泥固液比相对减低，凝固时间逐渐延长，从(17.13±0.31) min延长至(22.24±0.34) min，由此保证了更佳的临床操作时间。YU等[18]的研究结果表明，在骨水泥固液比为2.0 g/mL时，当磷酸钙骨水泥中硅酸盐生物活性玻璃的质量百分比从10%变化至20%时，凝结时间可以从21 min增加到25 min，但降低了材料黏度，骨水泥的流动性逐步增加。
生物活性玻璃的生物活性指数在所有生物陶瓷中最高[19]。在生物活性玻璃植入体内后，首先生物活性玻璃表面的Na+与体液中的H+发生离子交换，随后释放二氧化硅离子并形成硅羟团(≡Si-OH)，硅羟团相互聚合并在材料表面形成硅胶层；Ca2+、P4O3-、C3O2-、OH-等离子吸附在材料表面附近形成无定形磷酸钙沉淀，沉淀的无定形磷酸钙晶化形成羟基磷灰石层，各种物质及巨噬细胞、成骨细胞附着于羟基磷灰石层，进一步激活细胞迁移并促进新骨形成[6，20]。还有学者认为生物活性玻璃中存在大量的氧化钠(Na2O)，足以形成碱性环境并促进种植材料的早期溶解，形成富含羟基磷灰石和二氧化硅的生物层[21]。
此次实验CCK-8及死活染色结果证实，硅酸盐生物活性玻璃纤维加入磷酸钙骨水泥后无细胞毒性，具有良好的生物安全性。鬼笔环肽结果也表明硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥浸提液培养的细胞形态及延展性更佳，这可能由于钙离子和硅离子富集的环境对细胞活性产生了正向刺激作用，促进了细胞的生长、附着和增殖[14，22-23]。同样，生物活性玻璃对骨髓间充质干细胞也具有良好的细胞相容性[24]。
硅酸盐生物活性玻璃是一种具有良好骨诱导能力、生物活性并可自行降解的生物材料[16，25-26]。硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥在细胞外液中被动降解后硅离子被逐步释放，同时巨噬细胞、破骨细胞等也可对硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥进行主动降解，进一步介导炎症反应[1]。硅是人体中主要的微量元素之一，在骨骼中的含量为100×10-6，在细胞外基质中的含量可达550×10-6，新生骨中硅含量的增高可促进早期成骨钙化[22]。此次实验将各组骨水泥材料浸泡在模拟体液中1周，结果显示10%，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组硅离子逐步释放，20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组释放的硅离子质量浓度最高可达30.2 mg/L；而模拟体液中的钙离子被吸附，游离的钙离子质量浓度减低。硅离子可促进成骨细胞增殖、分化，上调胰岛素样生长因子Ⅱ的表达、谷氨酸的产生和细胞外基质矿化，硅酸可以刺激胶原Ⅰ的表达和成骨细胞分化，磷酸盐可以刺激基质la蛋白的表达，进一步促进成骨[27-28]。此次实验碱性磷酸酶染色结果显示，可见20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组碱性磷酸酶表达活性较高，这与其他学者的研究结果一致[24，29]。 RUNX2免疫荧光可见加入硅酸盐生物活性玻璃纤维磷酸钙骨水泥组MC3T3-E1细胞核内蛋白的染色强度明显强于磷酸钙骨水泥组，进一步说明了硅酸盐生物活性玻璃的成骨作用。成骨诱导第21天的茜素红染色结果显示20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥组钙结节数量增多，说明硅酸盐生物活性玻璃所释放的二氧化硅及钙离子等可在培养液中诱导成骨细胞形成矿化的钙结节[30]。综合来看，随着磷酸钙骨水泥中硅酸盐生物活性玻璃纤维含量的增加，MC3T3-E1细胞骨形成标志物的表达结果均显示较高的荧光水平，表明硅酸盐生物活性玻璃纤维直接影响成骨细胞的分化及骨组织的激活矿化[31-33]。硅酸盐生物活性玻璃所释放的硅离子浓度区别也可导致了钙化结节形成强度差异[34]。
除此之外，此次实验进一步通过RT-PCR检测MC3T3-E1细胞成骨相关基因的表达。骨桥蛋白、RUNX2、碱性磷酸酶和骨钙素是成骨分化的重要标志物。此次实验结果显示，成骨诱导培养后，随着骨水泥中硅酸盐生物活性玻璃含量的增加，与骨水泥共培养的MC3T3-E1细胞骨桥蛋白、RUNX2、碱性磷酸酶及骨钙素mRNA表达升高，证明了硅酸盐生物活性玻璃溶解产物增强了成骨活性，但是骨钙素mRNA表达差异性有所减低，体现了硅酸盐生物活性玻璃降解后硅离子的早期成骨能力，这与其他学者的报道相似[13，35]。硅离子和钙离子可协同通过激活腺苷酸活化蛋白激酶-细胞外调节蛋白激酶1/2通路，诱导大鼠间充质干细胞的成骨分化细胞[36-38]；另外，生物活性玻璃的溶解产物可作用于邻近骨膜和骨髓中的成骨细胞促进骨生长，表现为骨膜下成骨[39]。
综上所述，实验成功制备了硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥，验证了该材料具一定的生物力学强度和优秀的生物相容性，并且具有促进新骨生成的能力，其中20%硅酸盐生物活性玻璃纤维复合磷酸钙骨水泥在各项评估中被确定为较佳比例，这为后期探索材料对周围血管的影响及相关体内研究奠定了基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

硅酸盐生物活性玻璃纤维对磷酸钙骨水泥性能的影响

Effect of silicate bioactive glass fiber on properties of calcium phosphate bone cement

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