不同时间按压刺激对大鼠骨骼肌形态学及肿瘤坏死因子α、核因子κB的影响

doi:10.12307/2025.650

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (17): 3588-3595.doi: 10.12307/2025.650

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不同时间按压刺激对大鼠骨骼肌形态学及肿瘤坏死因子α、核因子κB的影响

石培丽1，林森2，赵文腾1，彭亚力1，胡亚哲1

1华中师范大学体育学院，湖北省武汉市 430079；2武汉体育学院体育科技学院，湖北省武汉市 430205

收稿日期:2024-07-15 接受日期:2024-08-19 出版日期:2025-06-18 发布日期:2024-11-01
通讯作者: 胡亚哲，博士，副教授，硕士生导师，华中师范大学体育学院，湖北省武汉市 430079
作者简介:石培丽，女，1999年生，山西省临汾市人，汉族，华中师范大学体育学院在读硕士，主要从事运动损伤的预防与治疗研究。
基金资助:
华中师范大学科研发展基金(20206982475)，项目负责人：胡亚哲

Effects of pressor stimulation at different times on rat skeletal muscle morphology and tumor necrosis factor alpha and nuclear factor kappaB

Shi Peili1, Lin Sen2, Zhao Wenteng1, Peng Yali1, Hu Yazhe1

1School of Physical Education and Sports, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei Province, China; 2School of Sports Science and Technology, Wuhan Sports University, Wuhan 430205, Hubei Province, China

Received:2024-07-15 Accepted:2024-08-19 Online:2025-06-18 Published:2024-11-01
Contact: Hu Yazhe, PhD, Associate professor, Master’s supervisor, School of Physical Education and Sports, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei Province, China
About author:Shi Peili, Master candidate, School of Physical Education and Sports, Central China Normal University, Wuhan 430079, Hubei Province, China
Supported by:
Research and Development Fund of Central China Normal University, No. 20206982475 (to HYZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
按压刺激：使用机械压力持续作用于某部位而产生的刺激性。
炎性因子：也被称为炎症因子，是指参与炎症反应的各种细胞因子。这些细胞因子在炎症反应中扮演着重要角色，通过细胞间的信息传递和调控，影响细胞的生理活动。

背景：研究发现不同时间长度按压点刺激正常肌肉，将产生不同的生理反应。
目的：探讨在不同时间机械压力按压下，大鼠骨骼肌内炎性因子肿瘤坏死因子α及核因子κB表达的变化。
方法：健康SPF级SD雄性大鼠20只，随机分为空白对照组、10 s按压组、20 s按压组及30 s按压组，每只大鼠的单侧右腿用于实验。空白对照组不予干预，各按压组大鼠经2%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后，使用自制机械压力装置，将压强固定在200 kPa，分别持续按压大鼠股薄肌10，20，30 s，随后即刻取右后肢按压处肌肉组织。苏木精-伊红染色观察骨骼肌组织形态学变化及肌纤维横截面积的变化，免疫组织化学检测骨骼肌肿瘤坏死因子α及核因子κB表达水平。
结果与结论：①苏木精-伊红染色结果显示，各按压组大鼠骨骼肌肌纤维排列松散，肌纤维横截面积和直径变小，骨骼肌间隙变大。与空白对照组相比，各按压组骨骼肌肌纤维的横截面积显著减小(P < 0.05)，3个按压组之间骨骼肌肌纤维的横截面积差异无显著性意义(P > 0.05)。10 s按压组肌纤维间隙中未见明显红细胞，20 s按压组间隙中出现少量红细胞，30 s按压组骨骼肌肌纤维间毛细血管扩张，间隙中出现红细胞。②30 s按压组的骨骼肌肿瘤坏死因子α的表达水平显著高于空白对照组(P < 0.05)。③各组间的骨骼肌核因子κB的表达水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)。④结果说明，压强固定在200 kPa时，骨骼肌经过按压会发生形态学变化，肌纤维横截面积减少，但按压10，20，30 s骨骼肌形态学及骨骼肌纤维横截面积无显著差异。随着时间点的变化，按压骨骼肌至30 s时，炎性因子肿瘤坏死因子α启动，但对核因子κB没有影响，推测短时间内炎性因子可出现表达，而转录因子未见明显变化。
https://orcid.org/0009-0001-5199-5541(石培丽)；https://orcid.org/0000-0003-2848-7562(胡亚哲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨骼肌, 炎性因子, 肿瘤坏死因子α, 核因子κB, 工程化细胞因子, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that different durations of pressure application on normal muscles can produce varying physiological responses.
OBJECTIVE: To explore the expression levels of inflammatory factors tumor necrosis factor α and nuclear κB in skeletal muscle under different pressure durations.
METHODS: Twenty healthy male SPF-grade Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: control group, 10-second pressure group, 20-second pressure group, and 30-second pressure group. The right leg of each rat was used for the experiment. The control group received no intervention, while rats in each pressure group were anesthetized by intraperitoneal injection of 2% pentobarbital sodium (35 mg/kg), and the thin femoral muscle of the rats was pressed continuously at a constant pressure of 200 kPa using a homemade mechanical pressure device for 10, 20, and 30 seconds, respectively. Muscle tissue at the pressing site of the right hind limb was collected immediately after pressure. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the morphological changes of skeletal muscle tissues and changes in the cross-sectional area of muscle fibers, and immunohistochemistry was used to detect the expression levels of tumor necrosis factor α and nuclear factor κB in rat skeletal muscle.

RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining results revealed that the pressure groups showed loosely arranged skeletal muscle fibers, reduced cross-sectional area and diameter, and enlarged intermuscular spaces. Compared with the control group, the cross-sectional area of muscle fibers was significantly reduced in the pressure groups (P < 0.05), but there was no significant difference between the three pressure groups (P > 0.05). The 10-second pressure group showed no significant presence of red blood cells in the interstitial spaces, while the 20-second pressure group exhibited a small amount of red blood cells, and the 30-second pressure group showed capillary dilation with red blood cells in the interstitial spaces. The expression level of tumor necrosis factor α in the 30-second pressure group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). The expression level of nuclear factor κB in skeletal muscle showed no significant difference among groups (P > 0.05). To conclude, skeletal muscle undergoes morphological changes and reduced cross-sectional area after pressure at 200 kPa, but there is no significant difference among the 10-, 20-, and 30-second pressure groups. As the duration of pressure increases to 30 seconds, the inflammatory factor tumor necrosis factor α is activated, but nuclear factor κB remains unaffected, suggesting that inflammatory factors may express under short-term pressure, while transcription factors show no significant change.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: skeletal muscle, inflammatory factor, tumor necrosis factor α, nuclear factor κB, engineered cytokine, engineered tissue construction

中图分类号:

石培丽, 林森, 赵文腾, 彭亚力, 胡亚哲. 不同时间按压刺激对大鼠骨骼肌形态学及肿瘤坏死因子α、核因子κB的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(17): 3588-3595.

Shi Peili, Lin Sen, Zhao Wenteng, Peng Yali, Hu Yazhe. Effects of pressor stimulation at different times on rat skeletal muscle morphology and tumor necrosis factor alpha and nuclear factor kappaB[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(17): 3588-3595.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验过程中大鼠无脱落，进入结果分析20只。
2.2 不同时间按压刺激对大鼠骨骼肌形态学的变化
2.2.1 苏木精-伊红染色的变化结果可得，大鼠肌肉组织整体病变程度较轻。空白对照组大鼠肌纤维束呈红色，其细胞核则呈现为蓝染，分布在肌束的周围；横切面可见大鼠骨骼肌肌细胞排列整齐，肌纤维被纤维结缔组织形成的膜环绕，肌节结构完整，肌纤维束形态粗壮且饱满，具有较宽的直径，同时肌束之间的间隙紧密。10 s按压组和20 s按压组大鼠骨骼肌肌纤维排列松散，肌纤维横截面积和直径变小，骨骼肌间隙变大，肌纤维间隙中未见明显红细胞或出现少量红细胞。30 s按压组大鼠肌纤维排列松散，骨骼肌肌纤维横截面积和直径变小，间隙变大，骨骼肌肌纤维间毛细血管扩张，间隙中出现红细胞，见图1。
2.2.2 骨骼肌肌纤维横截面积的变化不同时间按压下，空白对照组骨骼肌肌纤维的横截面积显著高于10 s按压组、20 s按压组和30 s按压组(均P < 0.05)；而3个按压组之间骨骼肌肌纤维的横截面积比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1，图2。

2.3 各组骨骼肌肿瘤坏死因子α表达水平的变化结果显示，30 s按压组的骨骼肌肿瘤坏死因子α的表达水平显著高于空白对照组(P < 0.05)，而10 s按压组和20 s按压组的骨骼肌肿瘤坏死因子α的表达水平与空白对照组相比，差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表2，图3，4。

2.4 各组骨骼肌核因子κB表达水平的变化结果显示，3个按压组的骨骼肌核因子κB的表达水平与空白对照组相比，差异均无显著性意义(P > 0.05)，3个按压组之间核因子κB的表达比较差异也无显著性意义(P > 0.05)，见表3，图5，6。

2.5 肿瘤坏死因子α与核因子κB表达的相关性分析进一步分析2种因子的相关性，发现肿瘤坏死因子α与核因子κB之间不存在相关性(r=-0.2475，P > 0.05)，见图7。

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引言

压力是推拿的基本力学作用形式之一[1]。推拿按摩治疗效果的实现，归根结底是通过机械压力于人体皮肤及肌肉组织的刺激作用[2]。
骨骼肌是人体中最为关键的肌肉组织之一，它们不仅支撑着人体的结构，还参与各种重要的生理和生化过程。在人体内，骨骼肌占据了约40%的体质量且含体内50%-75%的蛋白质总量[3]，这强调了骨骼肌在维持蛋白质平衡和代谢中的核心角色。骨骼肌修复中的必经过程包括炎症反应和纤维化[4]。肿瘤坏死因子α是参与炎症反应的重要促炎因子之一，具有多种生物活性，由单核-巨噬细胞、T细胞以及内皮细胞等分泌，其水平异常升高提示机体存在炎症反应[5]。缺血再灌注中肿瘤坏死因子α是引发炎症级联反应的主要启动因子[6]，当其水平异常升高时能够直接对细胞产生作用，导致组织细胞溶解[7]。定量的肿瘤坏死因子α预处理后，人脐带间充质干细胞的免疫系统能够得到调节，抗炎功能得到强化[8]。通过以上研究可以看出肿瘤坏死因子能够起到调节机体的免疫系统及增强机体的抵抗力作用，以便识别和抵抗外来的病原体和毒素，并保护机体免受微生物侵袭。这些功能说明了肿瘤坏死因子α在维持机体健康预防疾病和对抗疾病中作用不可小视。
核因子κB是属于核因子κB/Rel蛋白家族的一类关键转录调节因子，几乎存在于所有细胞类型中[9]。核因子κB具备调控基因表达、炎症蛋白、细胞生长与凋亡的功能，同时能够推动基因转录。核因子κB路径可以通过3种主要机制被激活，最常见的一种是应答前炎症因子如白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的刺激。肿瘤坏死因子是激活核因子κB的主要炎性细胞因子[10]，肿瘤坏死因子α作为外部信号，能增强自身的mRNA转录，从而提升肿瘤坏死因子α水平，增加的肿瘤坏死因子α又能进一步激活核因子κB，核因子κB又可以促进肿瘤坏死因子α的表达，形成类似瀑布式的连锁反应。肿瘤坏死因子α的激活导致核因子κB信号通路的刺激对启动炎症反应和其他重要的细胞过程至关重要。
推拿是通过医生或专业人员使用手法或工具，结合自身力量和技巧，针对人体的特定穴位和患处进行操作，以调整患者身体的生理状态，达到预防和治疗疾病的效果。推拿手法中点按法的疗效较好且使用频次较高，究其本质，点按法也属于再灌注活动之一[11]。当前大多数学者研究发现对受伤的肌肉进行按摩会产生有益的生理反应。目前对推拿改变未损伤肌肉的作用机制研究较少，不同时间点按刺激可能引起的反应目前尚不清楚。
因此，研究假设不同时间点按法应用于肌组织时，对骨骼肌形态学会产生变化及肌肉损伤修复中的相关炎性因子肿瘤坏死因子α及核因子κB发生变化。课题组前期研究结果显示压强在600 kPa骨骼肌出现明显出血情况，骨骼肌发生损伤，压强200-400 kPa出现充血，但骨骼肌并未造成损伤，所以此次实验选取压强200 kPa进行研究；同时前期研究结果表明10 s的按压时间较短，需要更大刺激，因此实验固定压强，探讨时间的延长会发生何种生理反应，并设定30 s是其临界点。
在临床实践中，很多情况下是对亚健康状态的人体进行手法推拿，合理的时间与压强能做到临床效果更好且不损伤骨骼肌生理功能。因此探讨不同时间、不同压强对正常骨骼肌的生理作用具有重要意义，可为临床推拿疗效与时间压强之间的合理关系，提供科学标准化理论依据，从而更好地指导临床实践。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计通过随机数字表法分组，进行随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析，两种因子间的相关性采用Pearson相关分析。
1.2 时间及地点实验于2024年1-3月在华中师范大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用SPF级雄性SD大鼠20只，8周龄，大鼠体质量为(190.0±9.5) g，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2020-0018。对大鼠采取分笼饲养，室温保持在20-22 ℃、相对湿度为40%-70%，光照周期为12 h，自由进食、饮水。为确保笼内的清洁卫生，每2 d更换1次垫料。
实验方案经华中师范大学科学伦理审查委员会批准同意(批准号：CCNU-IACUC-2024-026)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验主要药品及试剂 HARRIS苏木素染色液购自贝索生物，山羊血清购自博士德生物，肿瘤坏死因子α、核因子κB抗体购自赛默飞，山羊抗兔IGG-HRP购自ABCAM公司，DAB显色试剂盒购自福建迈新。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组及方案将20只大鼠随机分为4组，空白对照组5只、10 s按压组5只、20 s按压组5只、30 s按压组5只，每只大鼠的单侧右腿用于实验。根据推拿按摩按压法的特点，受压时间设为10，20，30 s。根据前期实验结果[12]，该研究按压刺激压强选取200 kPa。大鼠经2%戊巴比妥钠(35 mg/kg)(四川省维克奇生物科技有限公司)腹腔注射麻醉后，使用压力装置对大鼠后肢进行压力刺激，此压力装置基于文献报道的自制压力装置进行[13-14]，该装置包含施压柱、支撑架、砝码，施压柱上方为正方形平面，可放置相应砝码，施压柱下方装有硅胶头(直径为1.3 cm)，施压柱整体(含硅胶头)质量为260 g。于施压柱上施加质量，使施压柱持续压迫股薄肌10，20，30 s，保持装置和受压部位的稳定。施压对应的时间并进行实验记录。
最终大鼠后肢所承受压强计算公式为：P=F/S=(m1+m2)×g/πr²。
式中：F为施加于大鼠骨骼肌上的压力，m1=0.26 kg
(施压柱质量)，m2：200 kPa所对应的质量，g=9.8 N/kg；S：面积，S=πr²=1.327×10-4m2。
1.4.2 动物取材大鼠单侧股薄肌施压结束后，麻醉下颈椎脱臼法处死后进行取材，随后将取下的样本装在多聚甲醛固定液的EP管中冻存，后进行石蜡包埋及免疫组织

化学实验。实验取材者接受过实验动物从业资格证培训。
1.4.3 骨骼肌组织苏木精-伊红染色用石蜡包埋骨骼肌组织，制作3 μm厚度的切片，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察，使用NanoZoomer S360数字切片扫描设备对切片进行图像采集，后使用NDP.view 2及图像分析软件进行处理，观察横切下骨骼肌标本的组织形态学变化。
在NDP.view 2软件中，对苏木精-伊红染色的片子进行5点取样，每只大鼠采集5个图片，采取相同倍数导出图片，使用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件测量其面积。颜色选取模式为HSI模式，H值设置为210-266，I值设置为18-253，S不变，范围为 0-255，将肌纤维标记为红色，间质未被标记，然后进行测量，得出骨骼肌肌细胞的横截面积。
1.4.4 肌肉肿瘤坏死因子α、核因子κB免疫组织化学检测石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，加一抗(肿瘤坏死因子α抗体稀释倍数1∶100；核因子κB 抗体稀释倍数1∶200)4 ℃孵育过夜，滴加山羊抗兔二抗，稀释倍数1∶100，置于37 ℃环境下孵育45 min，DAB显色后复染细胞核，显微镜下观察细胞核的着色情况以确保染色效果符合要求。脱水封固后显微镜镜检。使用Nano Zoomer S360数字切片扫描设备对切片进行图像采集，后使用NDP.view 2图像分析软件进行片子的截取。每张片子使用5点取样法，采集5个图片，细胞质或细胞膜呈棕黄色染色为阳性表达。半定量分析：采用Image-ProPlus 6.0分析软件测定图像积分吸光度(IOD)值。
1.5 主要观察指标 ①大鼠骨骼肌形态学的变化；②骨骼肌肿瘤坏死因子α的表达；③骨骼肌核因子κB表达水平的变化；④肿瘤坏死因子α与核因子κB表达的相关性分析。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，随后采用GraphPad Prism 9.5软件对数据结果进行图像绘制。实验中所有计量资料采用x±s表示，符合正态分布数据均使用单因素方差分析(One-way Analysis of Variance)。各因子之间的相关性采用Pearson相关分析。P < 0.05时为差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经华中师范大学数学与统计学学院统计学专家审核。

讨论

3.1 不同时间按压刺激大鼠骨骼肌形态学的变化苏木精-伊红染色结果表明，3个按压组的骨骼肌肌纤维排列松散，肌纤维横截面积和直径变小，骨骼肌间隙变大，随着按压时间延长肌纤维间隙中由未见明显红细胞到可见红细胞，但未见肌纤维破裂及出血。
判断骨骼肌是否损伤可通过微观角度进行判断，肌肉损伤程度可通过肌纤维、线粒体等的变化进行分辨[15]。从形态学观察骨骼肌损伤是临床及基础实验中较为常用的方法之一，因此，此次实验也通过观察骨骼肌微结构来判断是否发生损伤。
长期持续的压力作用导致肌纤维溶解、断裂，以及坏死碎片的出现[16]。国外学者对正常大鼠骨骼肌进行不同负荷的机械刺激(1.4 N低负荷；4.5 N中等负荷；11 N高负荷)，每次30 min，每天1次，连续4 d；组织学分析结果显示，在不同负荷水平之间，未观察到细胞完整性的形态学差异，如纤维坏死和成核中心的出现；然而，与其他组相比，11 N高负荷组的细胞间隙面积有显著差异，细胞外空间占总面积的百分比增大，可能是由于某些组织损伤导致肌肉水肿增加所致；通过计算间质细胞的数量，在4.5 N中等负荷和11 N高负荷组大鼠肌肉中观察到细胞数量增加，表明细胞数量的增加可以由施加负荷的大小来决定[17]。上述研究都证实了在发生钝挫伤、压力刺激等骨骼肌微结构会发生变化，与此次的研究结果一致。骨骼肌受压后，肌纤维会出现排列紊乱、水肿，肌纤维横截面积变小等变化，在此次实验中有所体现。3个按压组之间的形态学差异不显著，随着时间增加到30 s时，骨骼肌纤维中出现轻微充血，这也证实30 s的按压能够引起毛细血管扩张但并没有出现破裂而引起血流量的增加，这有利于缓解肌痉挛。此次研究发现，与空白对照组相比，各按压组的骨骼肌肌纤维面积都有所减小，且与空白对照组的面积相比差异有统计学意义。随着按压时间的增加(10，20，30 s)，按压组骨骼肌肌纤维面积变化不显著，差异无显著性意义。
骨骼肌对环境有着强适应性，对机械刺激极其敏感，单个肌肉纤维的大小可随着机械刺激的变化而增加或减少[18]。卢悦(2022)[12]在研究中发现压强不变的情况下，10 s按压组和30 s按压组的大鼠骨骼肌细胞间隙面积均无明显差异，与此次研究结果间接性一致。国外学者研究压力的变化对骨骼肌间隙面积变化，结果发现随着压力的增加，间隙面积增加，与空白组、低负荷、中等负荷相比，高负荷组差异有显著性意义[17]。与此次研究设计存在差异，但研究结果间接一致，国外学者对肌纤维间隙面积进行计算且研究的是压力刺激的增大对间隙面积的影响，而此次研究的是时间点的变化对骨骼肌肌纤维横截面积的影响，按压时间的持续也增加了其刺激量。
研究人员对受损的肌肉施加了不同强度的机械负荷刺激，包括0.15，0.3和0.6 N，并持续长达14 d；同时对照组小鼠并未接受任何治疗；观察发现，这3种不同强度的机械负荷刺激均能有效减少间质纤维化和胫骨前肌中受损的肌纤维数量，而3种不同强度的刺激条件之间并未显示出明显的差异，肌纤维的横截面积表明肌肉生长和收缩强度，经过机械负荷刺激的骨骼肌纤维面积变大[19]。该研究与此次研究结果存在一致性，随着力量的变化，肌纤维面积并未出现显著性差异，而此次研究时发现随着时间的变化，肌纤维横截面积也未出现显著性变化。骨骼肌肌纤维的面积减小，证明在机械压力刺激下骨骼肌肌纤维的面积会发生变化，但各按压组之间面积的差异无显著性意义，骨骼肌在按压10 s之后，面积便没有发生显著性变化，分析其原因为骨骼肌肌纤维的伸展性，骨骼肌的伸展是有限度的，在到达一定程度后即到达自身承受限度，不再发生变化。
因此，研究表明30 s的按压时长与10 s无差异，亦在骨骼肌的弹性伸展范围之内，说明按压时间与强度在一个合理范围内，仅表现了骨骼肌的弹性伸展，并未出现破裂，但推测具有一定的临界值，若超出此值将出现肌纤维的破裂。提示临床推拿点按要在一个合理的压强与时间范围内，既达到推拿的生理作用，又不出现肌肉损伤，这对临床实践具有指导意义。
3.2 不同时间按压刺激对骨骼肌炎性因子肿瘤坏死因子α、核因子κB表达水平的影响研究结果显示，与空白对照组相比，30 s按压组的肿瘤坏死因子α的表达水平显著升高，而10 s按压组、20 s按压组肿瘤坏死因子α的表达差异无显著性意义。推测其原因可能是机体受到压力刺激时，肿瘤坏死因子α的表达就会上升，但需要持续性的按压刺激至30 s时，才有显著性意义，说明在30 s及以上时间的按压肌组织会诱导发生氧化应激反应，产生炎性因子，引起炎症细胞聚集。
肿瘤坏死因子α是一种由单核-巨噬细胞分泌的多肽类细胞因子，具备多重生物功能，是参与炎症反应中的关键促炎因子之一。在正常的生理条件下，肿瘤坏死因子α的表达水平相对较低；然而，在感染、炎症等病理状态下，其表达水平会显著提高。特别是在组织损伤的早期阶段，肿瘤坏死因子α的水平不仅会上升[20]，并且因其促进细胞坏死的功能而持续保持高位[21]。研究发现，过高的肿瘤坏死因子α水平可能对成肌细胞和肌细胞产生凋亡效应，从而可能引发肌肉萎缩现象[22]。此外，有研究表明在创伤和失血性休克情况下，肿瘤坏死因子α成为严重创伤后最关键的细胞炎性因子，具有广泛的生物学作用，包括刺激多种细胞因子的产生和释放，如白细胞介素1β和白细胞介素6；同时，肿瘤坏死因子α还能诱发活性氧与各类酶的释放，推动粒细胞在肺毛细血管中的汇集与活化过程，进而参与创伤后的细胞炎症反应调控，然而，这一过程也可能导致多器官组织的损伤[23]。
CRANE(2012)等[24]学者对骨骼肌损伤后10 min内进行了按摩治疗，且肿瘤坏死因子α蛋白表达还出现了降低，而此次研究也是探究短时间按压的作用机制，可见肿瘤坏死因子α在短时间内也是会产生生物学效应的。肿瘤坏死因子α是一种强效的致炎细胞因子，它在创伤早期即表现出显著的反应，即使是微小的创伤，也足以触发肥大细胞释放肿瘤坏死因子α[25]。此外中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞可迅速对损伤做出反应，通过释放肿瘤坏死因子α迅速增加受损区域的肿瘤坏死因子α浓度。这一发现强调了肿瘤坏死因子α在促进炎症反应和加速损伤恢复过程中的关键作用。这在此次研究中也得到很好的体现，在按压骨骼肌10 s后，肿瘤坏死因子α的表达就开始上升；按压20 s后，即使未出现上升，但与对照组相比，仍是上升的趋势；按压30 s，肿瘤坏死因子α的表达具有统计学意义，随着时间的增长(10-30 s)肿瘤坏死因子α的表达也逐渐增加，可见肿瘤坏死因子α对外界压力刺激极为敏感。
有研究表明，低浓度的肿瘤坏死因子α有助于缺血预处理的保护；相反，高浓度的肿瘤坏死因子α会导致心肌功能障碍和梗死发生，并引发肥大、纤维化和细胞凋亡，最有可能通过肿瘤坏死因子受体1激活[26]。另一学者也证实了在心肌梗死的病理过程中，肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子受体的激活表现出复杂且矛盾的作用。过度的肿瘤坏死因子α表达和随后的心肌细胞肿瘤坏死因子受体1激活是有害的，而较低的肿瘤坏死因子α浓度和随后的心肌细胞肿瘤坏死因子受体2激活具有保护作用[27]。除了受体亚型外，肿瘤坏死因子α的作用还取决于其浓度、暴露持续时间和定位，以及受影响个体的性别和年龄。此次研究选取短时间，同时结合短时间下形态学的变化及肿瘤坏死因子α的表达，推测30 s的按压既不会引起骨骼肌出血，也会引起肿瘤坏死因子α的表达，在骨骼肌中可能会起到有益的作用。
免疫组化结果显示3个时间点按压组的核因子κB的表达水平与空白对照组相比无显著性差异，各按压组之间核因子κB的表达水平也无显著性差异。30 s按压组核因子κB的表达水平要比空白对照组高，分析其原因为30 s的按压，机体肌组织的氧压环境发生改变，但这个条件不足以激活核因子κB。
核因子κB是一种在真核细胞中普遍存在的转录因子，具有多方向的基因调控功能，且是Rel蛋白家族的成员。在细胞未被激活的静止状态中，胞浆内的核因子κB P65/P50异源二聚体缺乏生物活性，主要是因为它们与IκB蛋白结合，以此形式广泛存在于细胞内，导致核因子κB处于一种非活跃的状态。然而，当细胞遭遇缺氧或被特定的细胞因子如肿瘤坏死因子α和白细胞介素1刺激时，这些因子会与它们特定的受体发生结合，触发受体结构的改变，进而启动一连串的酶催化反应链，最终激活核因子κB，并对靶基因的转录过程进行调控[28-29]。
此次研究发现，肿瘤坏死因子α和核因子κB之间的相关性时出现上升趋势，但差异无统计学意义，但也侧面印证了骨骼肌尚未出现严重的损伤。而在大鼠压疮深部组织损伤中，正常组织中核因子κB蛋白呈低表达，受压肌肉组织核因子κB活性明显增强[30]。分析其原因为在上述学者的研究中，组织损伤为长时间且较为严重，而此次实验中肌组织未出现损伤。
关于肿瘤坏死因子α和核因子κB之间表达的相关性，多项研究已经展示了在不同细胞类型和疾病模型中，肿瘤坏死因子α的上调可以导致核因子κB活性的增加，它们呈正相关。炎症条件下肿瘤坏死因子α的增加会激活核因子κB信号通路，从而促进炎症细胞因子、细胞黏附分子和促生存因子的表达[31]。这种正相关性在药物干预和遗传操作的实验中也得到了验证，其中通过抑制肿瘤坏死因子α或其信号传导途径可以减少核因子κB的活性[32]。在动物实验中，有学者对两者的相关性进行研究，结果发现，两者呈正相关[30]。也有研究提供了核因子κB调节分化骨骼肌细胞适应性反应的证据，发现肿瘤坏死因子α能够迅速激活分化骨骼肌肌管中的核因子κB，并且肿瘤坏死因子α直接作用于肌肉细胞以诱导蛋白质降解[33]。此次研究中核因子κB的表达并未呈现显著上升，而且肿瘤坏死因子α与核因子κB两者之间不存在相关性，推测由于按压时间仅30 s，机体仅引起肿瘤坏死因子α上升，但其下游因子核因子κB并未出现变化，从而推测肿瘤坏死因子α与核因子κB之间的关联影响并非是直接的，其间可能存在中间传递信号，中间还有其余信号分子影响转递，其具体机制还有待研究。
综上所述，压强固定在200 kPa时，骨骼肌经过按压会发生形态学变化，肌纤维横截面积减少，但按压10，20，30 s，骨骼肌形态学及骨骼肌肌纤维横截面积无显著差异。随着按压时间点的变化，点按骨骼肌至30 s时，炎性因子肿瘤坏死因子α启动，但对核因子κB没有影响，推测短时间内炎性因子可出现表达，而转录因子未见明显变化。
此次针对点按法的时间与压强关系的研究，旨在探讨其合理科学的标准范围，这对临床实践与教学具有指导意义。结果提示，临床上在使用点按法时，实施适度的按压，时间延续至30 s时，不但不会引起骨骼肌出血，而且在这个过程中骨骼肌会产生一定的肿瘤坏死因子α，可能会更有利于点按手法缓解骨骼肌痉挛的作用。
当前大部分学者针对骨骼肌损伤后进行的研究，此次研究基于对未损伤组织和刺激短时间的变化进行的。目前对骨骼肌短时间刺激的研究较短，撰写过程中关于时间点方面可供参考的文献较少。此次实验方法局限于形态学与免疫组织化学的观察，仅研究了固定压强下按压时间延长至30 s骨骼肌炎性因子的变化。在后续研究中，将进一步针对相关蛋白的表达进行Western blot实验分析，探究延长按压时间及压强骨骼肌发生何种变化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

不同时间按压刺激对大鼠骨骼肌形态学及肿瘤坏死因子α、核因子κB的影响

Effects of pressor stimulation at different times on rat skeletal muscle morphology and tumor necrosis factor alpha and nuclear factor kappaB

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