2.1   地塞米松和三七总皂苷对RAW264.7细胞系的细胞毒性   通过MTT法检测三七总皂苷和地塞米松对RAW264.7细胞的毒性。结果表明，当RAW264.7细胞孵育1 d时，0-156.25 μg/mL范围内的三七总皂苷对RAW264.7细胞增殖没有显著影响；在孵育3，7 d时，312.5-5 000 μg/mL范围内的三七总皂苷对RAW264.7细胞增殖都具有抑制作用，见图1A；在孵育7 d时，三七总皂苷的IC20值为
1 736.58 μg/mL，所以选择该质量浓度进行后续研究。1，10 μmol/L地塞米松在1，3，7 d对RAW264.7细胞增殖具有显著的抑制作用，而0.001-0.1 μmol/L范围的地塞米松对RAW264.7细胞的生长没有抑制作用，见图1B，故选择地塞米松的最大浓度为0.1 μmol/L进行后续实验。




2.2   三七总皂苷可抑制破骨细胞分化，促进破骨细胞凋亡   RAW264.7在0.1 μmol/L地塞米松和50 ng/mL RANKL的环境中，用不同浓度(0，347.32，578.86，1 736.58 μg/mL)的三七总皂苷培养7 d，然后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，结果表明随着三七总皂苷质量浓度的增加，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞数量减少，见图2A。与抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果一致，三七总皂苷质量浓度越高，TUNEL阳性细胞数量越多，见图2B，C。这些结果表明三七总皂苷可以抑制RANKL依赖性破骨细胞的形成并促进其凋亡。



2.3   破骨细胞来源外泌体的特征和差异表达miRNA的鉴定   从1 736.58 μg/mL三七总皂苷预处理的破骨细胞和未处理的破骨细胞中提取外泌体后，在透射电镜下可以观察到典型的囊泡样外泌体，见图3A。纳米颗粒跟踪分析显示，外泌体直径在30-200 nm范围内，见图3B，与先前研究中报道的外泌体大小一致[15]。为了确定三七总皂苷对破骨细胞外泌体中miRNA表达的影响，对提取的外泌体进行miRNA测序。测序完成后，使用“limma”包最终筛选出20个差异表达miRNA[P < 0.05，|log2FC(倍数变化)|≥1]。与未处理的破骨细胞外泌体相比，三七总皂苷诱导的破骨细胞外泌体中存在10个上调的差异表达miRNA和10个下调的差异表达miRNA，见图3C。在这些差异表达miRNA中，有4个上调的差异表达miRNA(miR-23b-3p、miR-98-5p、miR-182-5p、miR-296-3p)和7个下调的差异表达miRNA(miR-17-3p、miR-25-3p、miR-126a-3p、miR-133a-3p，miR-185-5p、miR-425-5p、miR-451a)已被证明影响成骨细胞的功能。因此，三七总皂苷可能通过调节破骨细胞衍生外泌体中这些差异表达miRNA的表达来促进成骨细胞分化。




2.4   候选mRNA的鉴定   在GSE46400中，共鉴定出1 147个差异表达基因(P < 0.05和|log2FC|≥1)，其中576个上调差异表达基因和571个下调相关差异表达基因，见图4A。通过StarBase和TargetScan在8 048个靶标mRNA(去除相同基因) 预测出11种成骨相关的差异表达miRNA，见表1。Venn图显示，已经鉴定了400个候选mRNA(4个上调的差异表达miRNA对应于155个下调的候选mRNA，7个下调的差异表达miRNA对应于238个上调的候选mRNA)用于进一步分析，见图4B，C。此外，通过CytoScape 3.9.1构建并可视化了“差异表达miRNA-候选mRNA网络”，见图4D，E。







2.5   通过GO分析和KEGG分析筛选候选mRNA   对候选差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以进一步探索成骨相关差异表达miRNA的功能，见图5A，B。结果表明，在生物过程(biological process，BP)类别中，候选差异表达基因主要富集于细胞周期、细胞分裂、细胞增殖的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控和有丝分裂细胞周期。细胞组分(cellular component，CC)分析表明，候选差异表达基因在细胞质、核质、细胞核、溶酶体、染色体和着丝粒区均显著富集。对于分子功能(molecular function，MF)，候选差异表达基因与蛋白质结合、ATP结合、核苷酸结合、蛋白激酶结合、单链DNA依赖性ATP依赖性DNA解旋酶活性有关。KEGG通路富集分析表明，候选差异表达基因主要富集在与铁死亡相关的PI3K-Akt信号通路、p53信号通路中[16-17]。以上分析结果表明，成骨相关的差异表达miRNA可能影响成骨细胞铁死亡的过程。



2.6   铁死亡相关基因的筛选与验证   从Ferrdb V2数据库[18]以及候选mRNA中收集了包括“铁死亡驱动因子”“铁死亡标记物”和“铁死亡抑制因子”在内的484个铁死亡相关基因，以进一步探究破骨细胞来源外泌体对成骨细胞铁死亡的影响。Venn图揭示了24个相交的铁死亡相关基因，见图6A，其中TFRC在激素性股骨头坏死中下调，PTGS2、NFE2L2、LAMP2、TLR4和ZFP36在激素性股骨头坏死中上调，与成骨细胞中各基因的表达趋势一致，见图6B。最终，构建了12个网络( miR-98-5p/PTGS2，miR-23b-3p/PTGS2，miR-425-5p/TFRC，miR-133a-3p/TFRC，miR-185-5p/TFRC，miR-23b-3p/NFE2L2，miR-23b-3p/LAMP2，miR-98-5p/LAMP2，miR-182-5p/LAMP2，miR-182-5p/TLR4，miR-23b-3p/ZFP36，miR-182-5p/ZFP36)并通过cytoscape进行可视化，见图6C，D，这些网络可能与三七总皂苷调控破骨细胞外泌体来源miRNA的表达来调节成骨细胞铁死亡有关。

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激素性股骨头坏死多是由于长期大量使用激素所致，其显著特征为股骨头塌陷及并发关节炎[1]。激素性股骨头坏死常见于20-50岁人群，严重影响关节功能和生活质量[2]。尽管激素性股骨头坏死的病理机制尚未明确，但有诸多研究表明与脂质代谢、内皮细胞损伤、氧化应激等因素相关[3]。在这些病因中，破骨细胞的活化和成骨细胞的死亡是近期研究的热点。激素所激活的破骨细胞在很大程度上是引起骨吸收和股骨头塌陷的重要原因[4-5]。另外，激素还会对成骨细胞造成损害，如成骨细胞的铁死亡等，抑制骨修复和骨重建过程，最终导致激素性股骨头坏死[6]。外泌体是近年来研究的热点之一，有研究显示破骨细胞来源外泌体中含有的微小RNA(microRNA，miRNA)可能通过调节某些基因进而抑制成骨细胞的分化[7]。因此，破骨细胞来源外泌体中miRNA调节成骨细胞活性及分化可能是导致激素性股骨头坏死的关键机制。
铁死亡是一种由谷胱甘肽过氧化物酶4控制的细胞内微环境的氧化还原状态失调引起的一种调节性细胞死亡，铁螯合剂和亲脂性抗氧化剂可以抑制该过程。铁死亡的调控机制涉及多种代谢事件和信号通路，并在诸多疾病中起重要作用，包括缺血性疾病、神经退行性疾病、癌症、肾脏疾病等[8]。梁学振等[9]通过生物信息学分析挖掘筛选得到PTGS2、STAT3可能是诊断生物标志物的Hub基因，为研究激素性股骨头坏死铁死亡的机制提供了新见解。章家皓等[10]则通过收集临床不同分期的激素性股骨头坏死患者的外周血、股骨头组织等样本，采用ELISA、Western blot等检测手段观察氧化应激及铁死亡相关指标，发现激素可上调氧化应激水平，诱导成骨细胞铁死亡并抑制成骨功能，进而可能导致激素性股骨头坏死发生。然而目前在激素性股骨头坏死研究领域中与铁死亡相关的研究仍相对较少，因此研究铁死亡在激素性股骨头坏死领域的作用，有利于进一步阐明激素性股骨头坏死的发病机制。
三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins，PNS)是从中药三七中分离提取出的有效中药成分，包含多种单体皂苷，具有活血祛瘀、通脉活络、抑制血小板聚集和增加脑血流量的作用[11]。研究表明，三七总皂苷干预兔激素性股骨头缺血性坏死，对骨细胞形态结构有修复作用[12]。三七总皂苷还可抑制破骨细胞活性，促进成骨，在骨坏死中发挥保护作用[13]。该研究通过构建激素性股骨头坏死铁死亡相关调控网络，初步阐述三七总皂苷可能通过调控破骨细胞外泌体中miRNA的表达抑制成骨细胞铁死亡，以发挥治疗激素性股骨头坏死的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   转录组学实验。
1.2   时间及地点   实验于2023年3-6月在广西中医药大学科学实验中心中医基础实验室完成。
1.3   材料   三七总皂苷(YZ-110870，Solarbio)；地塞米松(D8040，Solarbio)；RANKL(462-TR-010/CF，R&D)；无外泌体胎牛血清(U312-003，LONSERA)；DMEM高糖培养基(SH30081.LS，Hyclone)；青霉素-链霉素溶液(BL505A；BIOSHARP)；Raw264.7细胞(TIB-71，ATCC)；MTT细胞增殖试剂盒(11465007001，Sigma)；二甲基亚砜(S11368，Invitrogen)；多聚甲醛(A0009951，Richjoint)；抗洒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(CTCC-JD005，PuHebio)；TUNEL检测试剂盒(T2195，Solarbio)；TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，USA)。
1.4   方法   
1.4.1   Raw264.7细胞培养和处理   将Raw264.7细胞接种在96孔板中(细胞浓度为5×107 L-1，每孔100 μL)，使用含体积分数10%无外泌体胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养24 h后，更换成含有不同质量浓度的三七总皂苷(78.125，156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/mL)或不同浓度地塞米松(0.001，0.01，0.1，1，10 μmol/L)的DMEM培养基进行药物干预。使用含有50 ng/mL RANKL的DMEM培养基(含体积分数10%无外泌体胎牛血清)培养Raw264.7细胞7 d以诱导破骨细胞分化，每2 d换液1次，持续7 d。
1.4.2   MTT实验   通过MTT法检测三七总皂苷和地塞米松干预后RAW264.7细胞的细胞活力。将Raw264.7细胞分别与不同质量浓度的三七总皂苷和不同浓度的地塞米松在96孔板中孵育1，3，7 d，然后加入10 μL MTT，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中避光培养4 h，弃除孔内液体，加入150 μL二甲基亚砜，在振荡器上室温振荡10 min，通过微孔板读取器在492 nm波长下测量吸光度值，根据吸光度值分析细胞活力。
1.4.3   抗酒石酸酸性磷酸酶染色   将Raw264.7细胞接种于96孔板中(细胞浓度为5×107 L-1，每孔100 μL)，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h，然后加入含50 ng/mL RANKL的DMEM培养基(含体积分数10%无外泌体胎牛血清)，同时用0.1 μmol/L地塞米松和不同质量浓度(347.32，578.86和1 736.58 μg/mL)的三七总皂苷干预，每2 d换液1次，持续7 d。孵育结束后，使用40 g/L多聚甲醛固定10 min，用去离子水洗涤3次，每次3 min，向每个板孔中加入100 μL抗酒石酸酸性磷酸酶工作溶液，并在37 ℃下避光孵育10 min，用去离子水洗涤3次，每次3 min，最后在倒置显微镜下观察细胞形态。
1.4.4    TUNEL测定   将TUNEL染色工作液加入上述干预7 d的细胞中，在37 ℃下孵育30 min，用PBS冲洗细胞2次，每次5 min，在室温下使用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，加入Hoechst染色液，在室温下避光孵育15 min，PBS洗涤3次，每次5 min，最后用荧光显微镜观察细胞凋亡情况，通过Image J软件分析荧光强度。
1.4.5   外泌体分离和鉴定   通过差速超速离心法从1 736.58 μg/mL三七总皂苷预处理的破骨细胞和未处理的破骨细胞中提取外泌体。在4 ℃下分别以300，2 000，10 000，100 000×g离心10，10，30，70 min，每次离心后，取上清液用于下一步操作，最终离心获得的透明沉淀物为外泌体溶液。将15 μL外泌体溶液置于铜格栅上1 min，在室温下加入15 μL 2%乙酸铀酰染色溶液进行染色，在透射电镜下观察外泌体的形态。用1×PBS稀释外泌体样品后，根据制造商说明书用NanoSight NS300测量纳米颗粒尺寸。
1.4.6   小RNA文库的构建   采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits试剂盒制备小RNA测序文库。将构建好的文库作为cDNA合成模板，使用Illumina Hiseq2500进行PCR扩增。通过去除3’-adaptors、含有5’-adaptors的读段，保留碱基长度在18-26个核苷酸的序列。使用RFam和Repbase数据库对得到的序列与已知基因组进行比对以预测miRNA。
1.4.7   差异表达miRNA的选择和靶标mRNA的预测   使用转录组TPM法(Transcripts Per Million)对每个样本的miRNA表达水平进行归一化。使用R软件(4.2.0版本)中的limma包检测样品间差异表达miRNA，显著性阈值设置为P < 0.05，|log2 FC|≥1。使用StarBase v2.0网站(http://starbase.sysu.edu.cn/) 以及TargetScan 8.0网站(http://www.targetscan.org//)对差异表达miRNA的靶标mRNA做预测以进一步研究。
1.4.8   数据收集和差异表达基因的分析   在公共基因组学GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中检索筛选出与成骨分化相关的数据集GSE46400。数据集的样本是在0.1 μmol/L地塞米松中培养14 d后，同时诱导或不诱导成骨细胞的MC3T3-E1细胞系。在该研究中，基于P < 0.05和|log2FC|≥1，通过 GEO2R 网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)确定了差异表达基因。此外，用含有30个激素性股骨头坏死样本和10个非激素性股骨头坏死样本的GSE123568数据集，来验证枢纽基因的表达。
1.4.9   构建“差异表达miRNA-候选mRNA网络”和“差异表达miRNA-铁死亡相关基因网络”  使用VennDiagram R包在预测的靶标mRNA和差异表达基因中筛选候选mRNA[14]。然后，通过Cytoscape软件(3.6.1版)构建“差异表达miRNA-候选mRNA网络”，以探索候选mRNA与差异表达miRNA的相关性。在候选mRNA中，通过筛选出铁死亡相关基因来构建“差异表达miRNA-铁死亡相关基因网络”。
1.4.10   GO和KEGG富集分析   使用g:Profiler来进行基因本体(gene ontology，GO)分析、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，以进一步了解候选mRNA的生物学功能，以P < 0.05为差异有显著性意义。

1.5   主要观察指标   ①适合Raw264.7在激素环境中培养的地塞米松浓度；②适合Raw264.7培养的三七总皂苷质量浓度；③成骨相关差异miRNA的筛选及其调控网络构建；④铁死亡相关差异基因的筛选及其调控网络构建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

外泌体是一种含有微RNA、代谢产物、蛋白质等诸多生物活性分子的脂质双层囊泡，可以从一个细胞分泌转移到另一个细胞，从而参与各种生理病理过程[19]。值得注意的是，破骨细胞来源外泌体可能调控成骨细胞分化在骨代谢中发挥重要作用。有研究表明破骨细胞可通过ephrinA2-EphA2信号通路识别并调控成骨细胞分化[20]，破骨细胞和成骨细胞之间可能存在生物活性分子的传递交流。有进一步的研究证明破骨细胞来源外泌体中的miR-214可通过ephrinA2-EphA2轴靶向成骨细胞中的ATF4从而调节骨代谢过程[21]。因此，破骨细胞来源外泌体通过调控成骨细胞在激素性股骨头坏死病理机制中发挥作用。
铁死亡是一种近年来提出的新型铁依赖的细胞程序性死亡形式。铁死亡可由铁过载或者由谷胱甘肽过氧化物酶4的失活所导致，进而引起脂质氢过氧化物的积累以及细胞膜氧化损伤[8]。铁死亡与激素性股骨头坏死密切相关。研究发现地塞米松激活p53/SLC7A11/GPX4信号通路诱导MC3T3-E1细胞铁死亡可能是发生激素性股骨头坏死的原因[22]。另有研究发现沉默信息调节因子6可以逆转地塞米松诱导的成骨细胞铁死亡并恢复骨形成能力以防止激素性股骨头坏死的发生[23]。因此，逆转成骨细胞铁死亡可能是治疗激素性股骨头坏死的重要方法。
三七总皂苷是中国传统药材三七的重要有效成分，因众多的药理作用而被广泛运用[24]。三七总皂苷有很好的促进成骨作用。HU等[25]发现三七总皂苷能促进小鼠体内骨钙素的表达，说明可以促进成骨、提高骨量。另一项研究发现三七总皂苷可以同时增强成骨细胞活性和抑制破骨细胞分化[26]，随后三七总皂苷也被证明可用于治疗激素性股骨头坏死[27]。
在此次研究中，通过细胞实验验证了三七总皂苷可以抑制破骨细胞分化，并且促进破骨细胞凋亡；然后，进一步对破骨细胞来源外泌体进行miRNA测序，并筛选出相关的差异基因；对数据集GSE46400进行生信分析，从中筛选出11个与成骨相关的差异表达miRNA，进而预测相对应的mRNA，还构建了“差异表达miRNA-候选mRNA网络”。对候选mRNA进行GO和KEGG富集分析，发现主要富集在细胞周期、细胞分裂、细胞增殖的正调控以及与铁死亡相关的PI3K-Akt信号通路、p53信号通路，说明细胞分化以及成骨细胞铁死亡可能对激素性股骨头坏死的发生发展过程具有重要作用。最后构建了12个铁死亡相关网络( miR-98-5p/PTGS2，miR-23b-3p/PTGS2，miR-425-5p/TFRC，miR-133a-3p/TFRC，miR-185-5p/TFRC，miR-23b-3p/NFE2L2，miR-23b-3p/LAMP2，miR-98-5p/LAMP2，miR-182-5p/LAMP2，miR-182-5p/TLR4，miR-23b-3p/ZFP36，miR-182-5p/ZFP36)，表明破骨细胞来源外泌体中miRNA可能通过介导成骨细胞铁死亡相关基因进而诱发激素性股骨头坏死。
miR-23b-3p是一种微小RNA分子，属于非编码RNA。miR-23b-3p的主要功能：抑制多种癌症相关基因的表达，发挥抑癌作用；参与各种细胞过程的调控，如增殖、凋亡、迁移等；在糖尿病、心血管疾病等多种疾病中表达异常；可用作疾病的诊断生物标志物和治疗靶点；调控炎症反应，影响细胞免疫应答。研究表明，在绝经后骨质疏松模型小鼠体内，miR-23b-3p的敲低可以增加Runx2、骨钙蛋白、Osterix的表达和提高碱性磷酸酶的活性从而促进人间充质干细胞的成骨分化[28]，其可能是诊断和治疗包括股骨头坏死在内的多种疾病的靶点。
miR-98-5p也是一种微小RNA分子，主要功能为参与调控细胞周期进程，抑制肿瘤细胞增殖；抑制肿瘤转移和肿瘤血管生成；调节胰岛素信号通路，参与糖尿病发生；对抗心肌细胞肥大，保护心血管健康；调控炎症反应，维持正常免疫功能等。miR-98-5p在成骨分化的过程中下调[29]。抑制miR-98-5p可以激活PI3K/AKT/GSK3β信号通路从而增强成骨分化能力[30]。miR-98-5p对PI3K/AKT/GSK3β信号通路的调控作用有利于阐明两者在骨修复过程中的具体机制。
miR-425-5p在多种癌症中都发挥着重要的作用。在胶质母细胞瘤中，miR-425-5p被认为是一种促进胶质母细胞瘤干细胞生存的因素，因此，抑制miR-425-5p的表达可能是一种治疗胶质母细胞瘤的潜在策略。此外，研究还发现miR-425-5p在胃癌组织和细胞中显著上调，沉默miR-425-5p可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。不仅如此，miR-425-5p在肺癌、食管癌和胃癌等多种癌症中的表达都有所改变，这些研究表明它可能与肿瘤的进展和转移有关。另外，miR-425-5p还是骨质疏松的潜在治疗靶点，因为miR-425-5p可以靶向结合annexin A2促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化[31]。但目前miR-425-5p在股骨头坏死领域中的研究相对较少。
miR-133a-3p在许多生物过程中如细胞的增殖、分化、分裂、凋亡和信号转导等过程中都起着重要的调控作用。研究发现miR-133a-3p的异常表达可能参与肌源性分化和骨骼肌生长的调控，还可调控骨髓间充质干细胞的成骨分化并与骨髓间充质干细胞异常分化引起的人类疾病密切相关[32-33]；WANG等[34]研究发现长链非编码RNA MEG3可靶向miR-133a-3p抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。然而目前关于miR-133a-3p的相关研究仍在癌症肿瘤领域居多，对于股骨头坏死领域还有待进一步研究及报道。
miR-185-5p在近年来的研究中已经被证实参与了成骨分化和细胞矿质化，但是miR-185-5p在成骨细胞中增殖的调控机制尚不清楚。研究表明长链非编码RNA H19可通过miR-185-5p/IGF1信号轴促进成骨细胞基质矿化[35]；PART1/miR-185-5p/RUNX3信号轴也在成骨分化中发挥重要作用[36]。同时miR-182-5p可以通过Rap1/MAPK信号通路的表达下调促进成骨细胞的增殖和分化[37]。以上研究发现为miR-185-5p与成骨乃至骨疾病的关系提供了线索。
前列腺素内过氧化物合酶2 (prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)是铁死亡的关键调节因子，铁死亡的必要条件和基本特征就是铁依赖性的丙二醛等脂质过氧化物的生成、细胞内谷胱甘肽消耗和活性氧的蓄积[38]。PTGS2也称为环氧化物水解酶2，亦是铁死亡下游的一个标志物。PTGS2在谷胱甘肽过氧化物酶4调节的铁死亡过程中可以充当一个脂质过氧化的标记[39]。在股骨头坏死领域，梁学振等[9]发现PTGS2和STAT3有望成为潜在的诊断生物标志物，为探索激素性股骨头坏死铁死亡相关的作用机制提供新思路。
转铁蛋白受体(transferrin receptor，TFRC)在人体内编码转铁蛋白受体蛋白1 (transferrin receptor protein 1，TFR1)，控制细胞内铁水平。TFR1将铁从细胞外环境导入细胞，形成细胞内铁池，在铁死亡中起关键作用[40]。有研究显示TFRC对于小鼠精子生成过程中的减数分裂进程至关重要[41]。此外，TFRC还被证实为胰腺癌免疫疗法和肝细胞癌免疫微环境中的新型预后生物标志物。同时，基于HRAS、MAPK3和TFRC新的预后标志物也与肝癌的铁死亡和免疫微环境有关[42]；王宁等[43]研究发现铁死亡相关基因TFRC在胃癌组织中呈高表达，胃癌发生发展及预后可能与该基因密切联系。尽管TFRC在肿瘤方面的重要性已经得到了广泛的关注，但在骨病领域的具体机制仍然需要进一步研究。
核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-like 2，NFE2L2)是一种细胞保护基因，可以激活活性氧解毒酶、谷胱甘肽过氧化物酶等与铁代谢相关的酶，抑制铁死亡带来的氧化损伤[44]。此外，NFE2L2基因及相关信号通路在多种癌症类型中都发挥着重要的作用，这些研究揭示了NFE2L2基因突变与肺癌、头颈癌、胶质瘤等多种癌症的关联性，并进一步探讨了在调控肿瘤细胞放射抗性、促进肿瘤微环境改变以及影响免疫疗法效果等方面的作用[45-46]；NFE2L2基因还被发现与一些代谢疾病和内分泌疾病有关，如糖尿病、高血压、甲状腺疾病等[47]。尽管目前的研究在铁死亡相关的癌症、代谢性疾病方面已经取得了一些进展，但关于NFE2L2基因及信号通路在股骨头坏死发生发展中的具体机制仍鲜有报道。
溶酶体相关膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2，LAMP2)是一种铁死亡抑制基因。研究显示高表达LAMP2会升高胞浆半胱氨酸浓度，导致谷胱甘肽含量升高，抗氧化能力增强，抑制线粒体脂质过氧化，进而抑制铁死亡的发生[48]。此外，许多研究围绕LAMP2基因展开，揭示了其在Danon病、心肌病、食管癌等多种疾病中的重要作用[49-51]。LAMP2还被发现参与调控自噬过程，影响细胞的生存和死亡[52]。LAMP2基因的突变或剪接改变也可能导致疾病的发生，其表达模式也可能受到微RNA的调控[53]。尽管目前关于LAMP2基因的研究已经取得了一些进展，但具体的作用机制仍然存在许多未知之处，同时，如何利用这些研究成果来开发新的治疗方法也是一个值得探讨的问题。总的来说，LAMP2基因是一个具有巨大潜力的研究对象。
Toll样受体(toll-like receptor，TLR)是一类参与免疫应答的膜表面受体，其中TLR4在多种疾病中发挥着重要作用。近年来，越来越多的研究揭示了TLR4在各种生理和病理过程中的关键作用，包括但不限于癌症、COVID-19、过敏性鼻炎、糖尿病视网膜病变、急性肾损伤等。有研究显示铁死亡细胞以TLR4-TRIF依赖性方式吸引中性粒细胞，表明TLR4信号在铁死亡中发挥关键作用[54]。另一项研究则发现抑制TLR4可以降低氧化应激和铁死亡水平[55]。
锌指蛋白36(zinc finger protein 36，ZFP36)是一种RNA结合蛋白，也是一种新的转录后铁死亡调节因子，近年来在肿瘤生物学领域引起了广泛关注。ZFP36在多种癌症中，如鳞状细胞癌、骨肉瘤、肝癌和前列腺癌等，都发挥着重要的调控作用。例如，它可以通过抑制Wnt/CTNNB1信号转导途径来降低某些癌症的表达，同时还与PRC1结合以抑制肿瘤生长并增加化疗药物的敏感性[56-57]。另一方面，ZFP36也与多种基因表达调控机制有关，还可以调节免疫应答和炎症反应，通过与ISG15等基因相互作用，为治疗前列腺癌提供新的视角[58]。此外，ZFP36可以改变细胞对脂质过氧化、氧化应激、细胞凋亡和免疫刺激的反应[59]，这说明该基因在细胞铁死亡的发生发展中起重要作用。
在此次实验中，采用MTT法检测出不同浓度地塞米松和不同质量浓度三七总皂苷对RAW264.7细胞的毒性作用；其次使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定了诱导成功的破骨细胞；接着使用TUNEL实验观察不同质量浓度三七总皂苷对地塞米松环境下破骨细胞凋亡的影响，发现三七总皂苷能够抑制破骨细胞的生成，并且促进破骨细胞的凋亡；然后从三七总皂苷处理和未给予三七总皂苷处理的破骨细胞中成功提取出外泌体并进行了鉴定，通过构建小微RNA文库，找到10个能够影响成骨细胞的功能差异miRNA，构建并可视化差异表达miRNA-候选mRNA网络，最后构建了铁死亡相关的调控网络，这为进一步研究激素性股骨头坏死提供了新思路。然而在此次研究中也有不足之处：首先，没有进行三七总皂苷干预成骨细胞的实验，没有验证三七总皂苷对激素环境下成骨细胞的挽救作用；其次，对于铁死亡，没有进一步进行qPCR和Western blot的实验验证；其三，没有进行动物实验以进一步验证该研究的可靠性。

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文题释义：

激素性股骨头坏死：是一种由于长期大量使用激素导致的股骨头坏死。激素性股骨头坏死的发病机制尚不完全清楚，可能与激素导致的血管内皮损伤、微血栓、骨质疏松、干细胞成脂增多等有关，但具体的发生发展机制还有待进一步研究。#br#

铁死亡：是一种新型的细胞死亡方式，与细胞凋亡、坏死和自噬不同，它依赖于细胞内铁的累积和脂质过氧化。铁死亡的调控机制涉及多种代谢事件和信号通路，在多种疾病中扮演重要角色，包括神经退行性疾病、缺血性损伤、肾脏疾病等。

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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

激素性股骨头坏死是由长期使用类固醇药物引起的一种特殊类型的骨坏死。近年来，随着对激素性股骨头坏死研究的深入，发现了许多新的治疗和预防方法。这些方法包括了细胞自噬相关基因的研究、冲击波疗法、降低血清4-羟壬烯酸水平等。此外，许多天然药物也被证明具有保护作用，如人参皂苷、白藜芦醇、黄芪苷等。尽管有许多新的治疗方法被提出，但激素性股骨头坏死的发病机制仍不完全清楚。铁死亡作为一种新型的细胞程序性死亡方式，近年来在生物医学领域引起了广泛的关注。它是一种由铁离子引发的、非凋亡性的细胞死亡过程，除与多种疾病的发生发展密切相关外，还与一些生理过程有关，如骨质疏松、自噬、线粒体功能等。目前，关于铁死亡的研究不仅局限于基础生物学领域，更扩展到了临床医学和公共卫生领域。同时，铁死亡也与自身免疫疾病、糖尿病并发症、肠道菌群失调等多种疾病有着密切的关系。这些研究为我们理解铁死亡在疾病发生发展中的作用提供了新的视角，也为我们探索激素性股骨头坏死的发生机制提供了新思路。

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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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