旋转细胞培养系统对老年人表皮干细胞增殖和干性维持的影响

doi:10.12307/2025.079

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2698-2705.doi: 10.12307/2025.079

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

旋转细胞培养系统对老年人表皮干细胞增殖和干性维持的影响

张敏1，2，董溪溪3，黄萌1，2，王朝祥1，2，张鲁岳1，2，曹均凯2

1解放军医学院，北京市 100853；2中国人民解放军总医院第一医学中心，北京市 100853；3中国人民解放军总医院第五医学中心，北京市 100071

收稿日期:2024-02-27 接受日期:2024-05-11 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 曹均凯，主任医师，副教授，博士生导师，中国人民解放军总医院第一医学中心口腔科，北京市 100853
作者简介:张敏，女，1990年生，解放军医学院在读硕士，主要从事组织工程和再生医学的研究。
基金资助:
国家重点研发计划资助(2020YFC2008900)，项目负责人：曹均凯

Effect of rotating cell culture system on proliferation and stemness maintenance of epidermal stem cells in the elderly

Zhang Min1, 2, Dong Xixi3, Huang Meng1, 2, Wang Chaoxiang1, 2, Zhang Luyue1, 2, Cao Junkai2

1Medical School of Chinese PLA, Beijing 100853, China; 2First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 3Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100071, China

Received:2024-02-27 Accepted:2024-05-11 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Cao Junkai, Chief physician, Associate professor, Doctoral supervisor, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
About author:Zhang Min, Master candidate, Medical School of Chinese PLA, Beijing 100853, China; First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Supported by:
National Key Research & Development Program Foundation, No. 2020YFC2008900 (to CJK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

旋转细胞培养系统：一种具有氧合膜的无气泡的三维动态体外培养系统，可用于培养贴壁细胞或悬浮细胞。该系统使研究人员能够培养出多种高密度的细胞；同时在其他培养方法中不易培养的细胞，在该培养系统中可以更容易地进行培养。
表皮干细胞：是位于皮肤基底层、毛囊隆突处和皮脂腺的慢周期性细胞，具有自我更新和强大的增殖能力。表皮干细胞不仅可以通过向上迁移不断分化成为表皮细胞，维持表皮的更新和稳态；同时也可向下参与毛囊的形成和更新，是皮肤组织工程具有应用前景的种子细胞。

摘要
背景：由于人口老龄化和老年疾病的增加，对老年人表皮干细胞的研究和利用变得越来越重要。但由于老年人表皮干细胞的增殖和干性能力较弱，限制了其在生物医学和临床研究的应用。
目的：探讨旋转细胞培养系统培养的老年人表皮干细胞的增殖和干性维持能力。
方法：采用传统平面培养方法获取儿童(7-12岁)和老年人(60岁以上)表皮干细胞，经细胞形态学和细胞免疫荧光鉴定后，通过流式细胞术、CCK-8、细胞克隆形成实验分析儿童和老年人表皮干细胞增殖能力的差异；采用旋转细胞培养系统和3D TableTrix®微载体培养儿童和老年人表皮干细胞，通过活/死染色、细胞倍增效率、细胞倍增时间以及实时定量聚合酶链反应检测细胞增殖情况以及干性标志物的表达。
结果与结论：①在平面培养条件下，儿童组表皮干细胞较老年组具有更强的增殖能力；②与平面培养相比，经旋转细胞培养系统动态培养的老年人表皮干细胞的细胞倍增效率更高(P < 0.01)，细胞倍增时间更短(P < 0.01)；③旋转细胞培养系统动态培养促使老年人表皮干细胞自组装形成基于微载体支架的三维细胞球，具有和儿童组表皮干细胞相似的增殖情况；④动态培养后的老年人表皮干细胞在干性标记物基因(ITGA6和ITGB1)、基底细胞标记物基因(K5)和分化标记物基因(K10和K1)表达上可达到和儿童组相近的表达水平。结果表明：旋转细胞培养系统动态培养不仅可以提高老年人表皮干细胞的培养效率，促进细胞增殖和自组装成三维细胞球，而且可维持老年人表皮干细胞一定的干性，未发生完全终末分化。

https://orcid.org/0000-0001-6601-4905 (曹均凯)；https://orcid.org/0000-0001-5795-2238 (张敏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人表皮干细胞, 老年人, 旋转细胞培养系统, 微载体, 三维动态培养, 干性, 增殖

Abstract: BACKGROUND: Due to the aging population and the increase in elderly diseases, research and utilization of epidermal stem cells in the elderly have become increasingly important. However, due to the weak proliferation and drying ability of epidermal stem cells in the elderly, their application in biomedical and clinical research is limited.
OBJECTIVE: To investigate the ability of rotating cell culture system to promote the proliferation and maintenance of epidermal stem cells in elderly individuals.
METHODS: Epidermal stem cells were obtained from children (7-12 years old) and the elderly (over 60 years old) using traditional planar culture methods. After identification by cell morphology and cell immunofluorescence, the differences in proliferation ability of epidermal stem cells between the children and the elderly were analyzed by flow cytometry, CCK-8 assay, and cell clone formation assay. Elderly epidermal stem cells were cultured using a rotating cell culture system and 3D TableTrix® microcarriers. The cell proliferation and expression of stemness markers were detected by Live/Dead staining, cell doubling efficiency, cell doubling time, and real-time quantitative polymerase chain reaction.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under planar culture conditions, the children group had stronger proliferative ability than the elderly group. (2) Compared with planar culture, the dynamic cultivation of elderly epidermal stem cells using a rotating cell culture system had a higher population doubling (P < 0.01) and a shorter population doubling time (P < 0.01). (3) The dynamic cultivation of rotating cell culture system promoted the self-assembly of elderly epidermal stem cells to form 3D human epidermal stem cell spheres based on microcarrier scaffolds, which had similar epidermal stem cell proliferation as the children group. (4) After dynamic culture, the expression of stemness marker genes (ITGA6 and ITGB1), basal cell marker genes (K5) and differentiation marker genes (K10 and K1) of elderly epidermal stem cells reached the same level as that of children. The results showed that the dynamic cultivation of rotating cell culture system can not only improve the efficiency of elderly epidermal stem cell culture, promote cell proliferation and self-assembly into 3D cell spheres, but also maintain a certain stemness of elderly epidermal stem cells without complete terminal differentiation.

Key words: human epidermal stem cell, the elderly, rotating cell culture system, microcarriers, 3D dynamics culture, stemness, proliferation

中图分类号:

张敏, 董溪溪, 黄萌, 王朝祥, 张鲁岳, 曹均凯. 旋转细胞培养系统对老年人表皮干细胞增殖和干性维持的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2698-2705.

Zhang Min, Dong Xixi, Huang Meng, Wang Chaoxiang, Zhang Luyue, Cao Junkai. Effect of rotating cell culture system on proliferation and stemness maintenance of epidermal stem cells in the elderly[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2698-2705.

图/表（结果） 4

2.1 儿童和老年人表皮干细胞的形态学观察和细胞免疫荧光鉴定结果 如图1A所示，儿童组和老年组表皮干细胞形态无明显差异，均呈边缘透亮的多边形细胞形态，细胞核较大，细胞排列紧密呈铺路石样。在老年组中小而紧密的细胞之间，夹杂着一些大而扁平的细胞。原代细胞长至融合时，对儿童组和老年组表皮干细胞的特异性标记物CK19、Integrin-β1和p63进行细胞免疫荧光鉴定，如图1B所示，3个标记物均强表达，且儿童组几乎全部表达。结合细胞学形态观察，实验成功分离培养了老年人和儿童表皮干细胞。
2.2 平面培养的儿童和老年人表皮干细胞的增殖情况 如图2A所示，儿童组第1代细胞中有65.3%表达CD49fbri/CD71dim，29.8%表达CD49fbri/CD71bri，老年组则有31.7%表达CD49fbri/CD71dim，63.7%表达CD49fbri/CD71bri。经统计分析，两组细胞CD49fbri/CD71dim表达率差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2B。以上结果表明，传代后细胞的干性表达有所降低，但儿童组仍较老年组具有更强的增殖能力，老年组增殖能力较弱。如图2C所示，CCK-8检测发现儿童组第1代表皮干细胞在第1，3，5，7天时的增殖能力均高于老年组，差异有显著性意义(P < 0.05)。两组第1代细胞在接种相同细胞数的情况下，儿童组可在7 d达到约90%的细胞融合，而老年组则需12 d，细胞增殖速度明显较慢。
2.3 平面培养的儿童和老年人表皮干细胞克隆形成能力 为了进一步检验两组细胞增殖能力的差异，对儿童组第3代表皮干细胞和老年组第1代表皮干细胞进行了细胞克隆形成实验。如图3所示，老年组表皮干细胞形成的细胞克隆小而稀疏，而儿童组在第3代仍可形成远大于老年人的细胞克隆。经统计分析，儿童组第3代表皮干细胞克隆形成效率大于老年组第1代表皮干细胞，具有更强的细胞克隆能力。

2.4 旋转细胞培养系统对儿童和老年人表皮干细胞增殖的影响 在第1，7，10，14天时观察两组细胞活死染色情况，结果发现两组细胞增殖状态相似，见图4，均呈现大量活细胞(绿色)增殖，未见有大量死细胞(红色)。另外，两组细胞均在第7天进入迅速增殖阶段，并在三维动态培养条件下，诱导细胞自组装成紧密的基于微载体支架的三维细胞球，形成了大小不等且形状不规则的三维立体结构，在第14天逐渐生成最大的三维细胞球而达到培养融合。

2.5 旋转细胞培养系统三维动态培养对老年人表皮干细胞培养效率的影响 基于以上实验，老年人表皮干细胞在旋转细胞培养系统三维动态培养条件下展现了良好的增殖能力，进一步通过培养14 d的细胞倍增和细胞倍增时间评价老年人表皮干细胞三维动态培养的扩增效率。结果发现，与平面培养相比，三维动态培养的细胞倍增效率更高(P < 0.01)，细胞倍增时间更短(P < 0.01)，见图5，表明旋转细胞培养系统三维动态培养更有利于老年人表皮干细胞增殖，可以提高老年人表皮干细胞的增殖效率。

2.6 旋转细胞培养系统三维动态培养对老年人表皮干细胞基因表达水平的影响 经三维动态培养后老年人和儿童表皮干细胞的干性标记物基因(ITGA6和ITGB1)、基底细胞标记物基因(K5)和分化标记物基因(K10和K1)表达均无差异，见图6。说明三维动态培养维持了老年人表皮干细胞一定的干性，未发生完全终末分化，同时可使得老年人表皮干细胞达到和儿童组相近的基因表达水平，进一步说明了该系统对老年人表皮干细胞培养的优势。

参考文献

[1] VIETRI RUDAN M, WATT FM. Mammalian Epidermis: A Compendium of Lipid Functionality. Front Physiol. 2022;12:804824.
[2] YANG R, YANG S, ZHAO J, et al. Progress in studies of epidermal stem cells and their application in skin tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):303.
[3] MESA KR, KAWAGUCHI K, COCKBURN K, et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 2018;23(5):677-686.e4.
[4] WANG J, CHEN Y, HE J, LI G, et al. Anti-Aging Effect of the Stromal Vascular Fraction/Adipose-Derived Stem Cells in a Mouse Model of Skin Aging Induced by UVB Irradiation. Front Surg. 2022;9:950967.
[5] DOSHIDA Y, SANO H, IWABUCHI S, et al. Age-associated changes in the transcriptomes of non-cultured adipose-derived stem cells from young and old mice assessed via single-cell transcriptome analysis. PLoS One. 2020;15(11):e0242171.
[6] GE Y, MIAO Y, GUR-COHEN S, et al. The aging skin microenvironment dictates stem cell behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(10): 5339-5350.
[7] RÜBE CE, BÄUMERT C, SCHULER N, et al. Human skin aging is associated with increased expression of the histone variant H2A.J in the epidermis. NPJ Aging Mech Dis. 2021;7(1):7.
[8] GIANGRECO A, QIN M, PINTAR JE, et al. Epidermal stem cells are retained in vivo throughout skin aging. Aging Cell. 2008;7(2):250-259.
[9] ZOUBOULIS CC, ADJAYE J, AKAMATSU H, et al. Human skin stem cells and the ageing process. Exp Gerontol. 2008;43(11):986-997.
[10] HABANJAR O, DIAB-ASSAF M, CALDEFIE-CHEZET F, et al. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.
[11] VOLLMERS A, WALLACE L, FULLARD N, et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Rev Rep. 2012;8(2): 402-413.
[12] CUI Y, YIN Y, ZOU Y, et al. The Rotary Cell Culture System increases NTRK3 expression and promotes neuronal differentiation and migratory ability of neural stem cells cultured on collagen sponge. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):298.
[13] NEWLAND B, EHRET F, HOPPE F, et al. Static and dynamic 3D culture of neural precursor cells on macroporous cryogel microcarriers. MethodsX. 2020;7:100805.
[14] GRIMM D, WEHLAND M, CORYDON TJ, et al. The effects of microgravity on differentiation and cell growth in stem cells and cancer stem cells. Stem Cells Transl Med. 2020;9(8):882-894.
[15] LIU D, PAVATHUPARAMBIL ABDUL MANAPH N, AL-HAWWAS M, et al. Coating Materials for Neural Stem/Progenitor Cell Culture and Differentiation. Stem Cells Dev. 2020;29(8):463-474.
[16] OYEN BL, HSIEH CC, HSU PJ, et al. Three-Dimensional Spheroid Culture of Human Mesenchymal Stem Cells: Offering Therapeutic Advantages and In Vitro Glimpses of the In Vivo State. Stem Cells Transl Med. 2023;12(5):235-244.
[17] LEI XH, NING LN, CAO YJ, et al. NASA-approved rotary bioreactor enhances proliferation of human epidermal stem cells and supports formation of 3D epidermis-like structure. PLoS One. 2011;6(11): e26603.
[18] YAN X, ZHANG K, YANG Y, et al. Dispersible and Dissolvable Porous Microcarrier Tablets Enable Efficient Large-Scale Human Mesenchymal Stem Cell Expansion. Tissue Eng Part C Methods. 2020;26(5):263-275.
[19] WANG B, LIU W, LI JJ, et al. A low dose cell therapy system for treating osteoarthritis: In vivo study and in vitro mechanistic investigations. Bioact Mater. 2021;7:478-490.
[20] ZHANG Y, NA T, ZHANG K, et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. J Tissue Eng Regen Med. 2022;16(10):934-944.
[21] GIBLER P, GIMBLE J, HAMEL K, et al. Human Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Culture and Analysis Methods for Adipose Tissue Modeling In Vitro: A Systematic Review. Cells. 2021;10(6):1378.
[22] LEGIAWATI L, SUSENO LS, SITOHANG IBS, et al. Stem Cells as a Therapeutic Choice in Dermatological Disorders. Curr Stem Cell Res Ther. 2023;18(8):1069-1075.
[23] ZHAO X, LI X, WANG Y, et al. Stability and biosafety of human epidermal stem cell for wound repair: preclinical evaluation. Stem Cell Res Ther. 2023;14(1):4.
[24] GONZALES KAU, FUCHS E. Skin and Its Regenerative Powers: An Alliance between Stem Cells and Their Niche. Dev Cell. 2017;43(4):387-401.

[25] CHERMNYKH E, KALABUSHEVA E, VOROTELYAK E. Extracellular Matrix as a Regulator of Epidermal Stem Cell Fate. Int J Mol Sci. 2018;19(4): 1003.
[26] TJIN MS, CHUA AWC, TRYGGVASON K. Chemically defined and xenogeneic-free culture method for human epidermal keratinocytes on laminin-based matrices. Nat Protoc. 2020;15(2):694-711.
[27] NANBA D. Human keratinocyte stem cells: From cell biology to cell therapy. J Dermatol Sci. 2019;96(2):66-72.
[28] FLORA P, EZHKOVA E. Regulatory mechanisms governing epidermal stem cell function during development and homeostasis. Development. 2020;147(22):dev194100.
[29] LI A, SIMMONS PJ, KAUR P. Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(7):3902-3907.
[30] NANBA D, TOKI F, TATE S, et al. Cell motion predicts human epidermal stemness. J Cell Biol. 2015;209(2):305-315.
[31] PICERNO A, STASI A, FRANZIN R, et al. Why stem/progenitor cells lose their regenerative potential. World J Stem Cells. 2021;13(11):1714-1732.
[32] ANIL-INEVI M, SARIGIL O, KIZILKAYA M, et al. Stem Cell Culture Under Simulated Microgravity. Adv Exp Med Biol. 2020;1298:105-132.
[33] AL-AZAB M, SAFI M, IDIIATULLINA E, et al. Aging of mesenchymal stem cell: machinery, markers, and strategies of fighting. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):69.
[34] BARRANDON Y, GRASSET N, ZAFFALON A, et al. Capturing epidermal stemness for regenerative medicine. Semin Cell Dev Biol. 2012;23(8): 937-944.
[35] MAJOR GS, DOAN VK, LONGONI A, et al. Mapping the microcarrier design pathway to modernise clinical mesenchymal stromal cell expansion. Trends Biotechnol. 2024. doi: 10.1016/j.tibtech.2024.01.001.
[36] CASAJUANA ESTER M, DAY RM. Production and Utility of Extracellular Vesicles with 3D Culture Methods. Pharmaceutics. 2023;15(2):663.
[37] ZHANG Y, GAO S, LIANG K, et al. Exendin-4 gene modification and microscaffold encapsulation promote self-persistence and antidiabetic activity of MSCs. Sci Adv. 2021;7(27):eabi4379.
[38] ZHANG J, LI C, MENG F, et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 2022;13(1):3.
[39] LIU Y, WANG R, DING S, et al. Engineered meatballs via scalable skeletal muscle cell expansion and modular micro-tissue assembly using porous gelatin micro-carriers. Biomaterials. 2022;287:121615.
[40] BOONEKAMP KE, KRETZSCHMAR K, WIENER DJ, et al. Long-term expansion and differentiation of adult murine epidermal stem cells in 3D organoid cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(29):14630-14638.
[41] MARCHINI A, GELAIN F. Synthetic scaffolds for 3D cell cultures and organoids: applications in regenerative medicine. Crit Rev Biotechnol. 2022;42(3):468-486.
[42] FOGLIETTA F, CANAPARO R, MUCCIOLI G, et al. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sci. 2020;254:117784.
[43] TSAI AC, JESKE R, CHEN X, et al. Influence of Microenvironment on Mesenchymal Stem Cell Therapeutic Potency: From Planar Culture to Microcarriers. Front Bioeng Biotechnol. 2020;8:640.
[44] AYVAZ I, SUNAY D, SARIYAR E, et al. Three-Dimensional Cell Culture Models of Hepatocellular Carcinoma - a Review. J Gastrointest Cancer. 2021;52(4):1294-1308.

引言

表皮是哺乳动物皮肤的最外层，是维持生命必不可少的重要屏障[1]。表皮干细胞作为一种独特的细胞群，可通过自我更新和强大的增殖能力形成新的表皮细胞替代衰老、受损的表皮细胞，维持表皮稳态，并参与损伤后表皮的修复再生[2-3]。除了修复创面、烧伤和瘢痕以外，其在抗衰老和抗氧化方面同样扮演不可或缺的角色[4]。研究显示年轻人的表皮干细胞通常具有更高的增殖能力，能够更快地扩增和形成较大的细胞群落[5]，而老年人皮肤中位于基底层和隆突部位的表皮干细胞数量和功能在衰老过程中逐渐下降，增殖能力也有所降低，且易受紫外线影响[6-7]。同时，不同年龄阶段的表皮干细胞可能有不同的分化倾向[6]。有学者认为表皮干细胞具有抗衰老的本质，皮肤衰老则是受局部环境和全身因素的影响[8-9]。因此，表皮干细胞衰老相关的特性还需进一步探索。
传统平面培养方法虽简便易行，但空气、营养物质和代谢废物扩散不均匀，而且无法模拟体内的三维环境和生物力学刺激，难以完全重现细胞在体内的功能和特性，因此，需要不断改进和优化表皮干细胞的分离和培养技术，提高培养条件的稳定性和控制性。研究表明，表皮干细胞在传统平面培养条件下会迅速失去干性标记物表达，而在三维(3-dimensional，3D)培养条件下其干性标记物可正常表达[10-11]。旋转细胞培养系统是一种动态培养细胞的技术，创造了三维均质的培养环境，可增强细胞间相互作用[12]。使用三维培养可以显著延长干细胞和前体细胞的培养时间，获得更多的细胞数量和产物[13]。与传统二维培养条件相比，三维培养后的造血干细胞可生成更多的血细胞并可在较长时间内维持增殖[14]。三维培养还促进了神经干细胞和祖细胞增殖，改善细胞的生长环境，增强细胞的增殖能力[15-16]。既往研究表明，美国宇航局批准的旋转生物反应器在含血清培养体系中支持表皮干细胞增殖，并能够形成多层表皮结构[17]。因此，旋转细胞培养系统可抑制细胞分化并能够提供维持干细胞功能的培养条件。就人源细胞来说，大多研究取自30岁以下成年人或者儿童的标本，而此研究首次纳入老年皮肤标本，且提供了优化培养条件和促进细胞发挥功能的方案。
在悬浮动态培养系统中，需要微载体支架给贴壁细胞提供锚定和生长的场所。随着材料的进步，新型的明胶类产品微载体3D TableTrix®问市，获得了美国食品药品监督管理局和中国药品审评中心药用辅料资质[18]，现已被用于间充质干细胞的大规模培养和骨性关节炎相关研究中[19-20]。目前还没有使用3D TableTrix®对老年人表皮干细胞进行三维培养的相关研究。该研究首先对儿童和老年人表皮干细胞进行平面培养，初步探究老年人表皮干细胞的体外增殖能力，然后进一步采用旋转细胞培养系统联合3D TableTrix®可生物降解微载体对儿童和老年人表皮干细胞进行动态培养，以便提供关于皮肤老化和再生机制的重要信息，从而为开发针对这些问题的治疗方法和美容护肤产品提供帮助。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照细胞实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年6月至2024年2月在军事科学院完成。
1.3 材料 7-12岁儿童皮肤标本取自解放军总医院第七医学中心泌尿外科包皮环切术后的废弃正常组织；60岁以上老年皮肤标本取自解放军总医院第一医学中心老年人颌面部整形术后的正常皮肤标本。经解放军总医院医学伦理委员会批准(批准号：S2023-738-01)和患者及家属的知情同意。
主要试剂和仪器：Dispase II酶、0.25%胰蛋白酶、0.05%胰蛋白酶(Gibco，美国)；Ⅳ型胶原溶液(Sigma，美国)；KGM-GOLD培养基(Lonza，美国)；兔抗人CK19、Integrin-β1、p63抗体(Abcam，英国)；CD49f-PE抗体、CD71-APC抗体(BioLegend，美国)；3D FloTrix®Digest裂解液(华龛，中国)；倒置显微镜、激光共聚焦显微镜(Nikon，日本)；自动计数仪(Invitrogen，美国)；酶标仪(Multiskan FC，美国)；PrimeScript RT-PCR试剂盒(TaKaRa，日本)；旋转细胞培养系统(Synthecon，美国)；HARV反应容器(高纵横比生物反应容器，Synthecon，美国)；3D TableTrix®干细胞微载片(华龛，中国)；非TC 6孔板(Nest，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 表皮干细胞的分离、纯化和培养 ①取得标本当日，将新鲜标本用体积分数75%乙醇快速漂洗2次，用含双抗的冷PBS漂洗2次。在低温下修剪多余皮下脂肪及结缔组织，用外科手术刀片切成宽3.0-4.0 mm小皮条，无菌PBS清洗干净后转移至含10 mL Dispase II酶的大皿中，4 ℃过夜。当日用2.0-3.0 mL 100 μg/mL Ⅳ型胶原溶液包被T75培养瓶，封口膜封口后4 ℃过夜。次日吸去多余胶原溶液，PBS洗3次，晾干备用。②次日晨，在解剖显微镜下用显微镊分离小皮条的真表皮。将获得的表皮用眼科剪剪碎，加入预热的0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化3 min，吹打数次后收集上清液于终止消化液。加入新鲜温胰蛋白酶继续37 ℃消化2.0-3.0 min，全部终止消化并充分吹打，70 μm细胞滤网过滤，1 000 r/min离心5 min，吸弃上清液，PBS重悬。自动细胞计数仪计数后，按照5×104/cm2的密度接种到预铺 Ⅳ型胶原的培养瓶中，37 ℃培养箱孵育15-20 min，吸弃未贴壁的细胞，加入新鲜的KGM-Gold培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱培养。24 h后首次换液，以后每2 d换1次液并镜下观察细胞生长状态。③当细胞融合达到75%-80%时，用0.05%胰蛋白酶消化5-8 min，以1∶3传代培养，选用第1-3代细胞用于以下实验。
1.4.2 表皮干细胞的鉴定
(1)免疫荧光染色：激光共聚焦培养皿中的原代细胞培养12-14 d后，吸弃培养基，PBS迅速洗1次，每个培养皿中立即加入1 mL 40 g/L多聚甲醛室温固定30 min；吸弃多聚甲醛，PBS洗5 min×3次；每皿加入1 mL 0.1%Triton X-100室温打孔15 min，PBS洗5 min×3次；每孔加入1 mL山羊血清封闭非特异性抗体1 h；去除封闭血清，每孔分别加入0.5 mL兔抗人CK19(1∶200)、Integrin-β1(1∶200)和p63(1∶100)抗体稀释液，于湿盒内4 ℃孵育过夜；吸弃一抗溶液，PBS洗5 min×3次；每孔加入山羊抗兔的二抗(1∶500)，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次；用抗荧光淬灭封片液(含DAPI)复染细胞核并封固，室温下孵育10 min；激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录。
(2)流式细胞术鉴定: 原代细胞长至融合后，用0.05%胰酶将细胞消化至单细胞悬液，细胞计数，分装至EP管中并分为阴性对照组(PBS)和双标共染组(CD49f-PE和CD71-APC)。阴性对照组加入200 µL PBS重悬细胞待测，双标共染组100 µL PBS中加入2.5 µL CD49f-PE抗体和2.5 µL CD71-APC抗体共染，室温避光共同孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，用500 µL PBS洗涤2遍，去除未结合的抗体，用200 µL PBS重悬细胞后上机检测。
1.4.3 CCK-8细胞增殖实验 原代细胞长至融合后传代至第1代，按照(1.2-1.4)×104个/孔密度接种在96孔板中，每个时间点设至少4个复孔，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养；老年人表皮干细胞在培养第1，3，5，7，10，13天和儿童表皮干细胞在培养第1，3，5，7天时，吸弃旧培养基，PBS洗1次，每孔加入180 µL KGM-GOLD培养基和20 µL CCK-8试剂，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育1 h；孵育后的变色溶液转移至新的96孔板中，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
1.4.4 细胞克隆形成实验 将生长状态良好的儿童组第3代细胞和老年组第1代细胞，按照100个/孔密度接种在包被Ⅳ型胶原的6孔板中，每2 d换1次液，培养14 d后，吸弃培养基，PBS洗1次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min；PBS洗3 min×3次，1%罗丹明染色15 min；PBS洗3 min×2次，用数码相机拍照记录和倒置显微镜观察。以单个克隆细胞数≥32个细胞为1个克隆，细胞克隆形成率=(克隆数/种入细胞数)×100%。
1.4.5 旋转细胞培养系统的3D动态培养 采用旋转细胞培养系统和3D TableTrix®微载体在KGM-GOLD培养基下进行3D动态培养。①孔板准备：在培养板底面未处理的(非TC)6孔板各孔中放置一片3D TableTrix®微载体片，孔板的间隙内加入适量的PBS或者去离子水，以保证培养板内的湿润环境；②静态接种：将300 µL第1代儿童表皮干细胞悬液和老年人表皮干细胞悬液以2.5×106个/片细胞密度均匀加在单片3D TableTrix®微载体上，将其完全浸润，且无多余细胞悬液外流，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱孵育2 h，每孔加入5 mL KGM-GOLD培养基，轻轻搅动使微载体均匀散开，置于细胞培养箱中继续培养22 h；取出6孔板，将细胞和微载体小心转移至10 mL HARV反应容器中，加满新鲜KGM-GOLD培养基并确保容器内无气泡；③动态培养：将HARV反应容器安装在旋转细胞培养系统设备上，初始先以5 r/min逆时针旋转动态培养3 d，第4天开始转速调至10 r/min，继续动态培养4 d，第8天转速增加到15 r/min，继续动态培养7 d。每隔两三天用5 mL注射器更换1/2培养基。
1.4.6 细胞倍增效率和细胞倍增时间 老年人第1代表皮干细胞在平面培养达到融合以及旋转细胞培养系统培养14 d后，检测细胞倍增效率和细胞倍增时间。传统平面培养达到细胞融合后通过0.05%胰酶将细胞消化至单细胞悬液，自动细胞计数仪计数。旋转细胞培养系统培养14 d后，收集负载表皮干细胞的微载体于50 mL离心管中，加入1/5培养基体积的3D FloTrix®Digest裂解液(5X)，37 ℃孵育25-30 min，每5 min吹打数次，加速微载体裂解。待溶液变清亮微载体完全溶解后，1 000 r/min离心5 min，用1 mL PBS重悬，自动细胞计数仪计数。细胞倍增和细胞倍增时间计算公式如下：细胞倍增=3.32×log(Nt/N0)；细胞倍增时间= lg2/(lgNt-lgN0)×t，其中Nt为收获时的细胞计数，N0为接种时的细胞计数，t为培养时间(h)。
1.4.7 活/死细胞染色检测细胞增殖和黏附情况 在旋转细胞培养系统三维动态培养1，7，10，14 d时，取200 µL负载第1代儿童表皮干细胞和老年人表皮干细胞的微载体至96孔板中，用100 µL预热的温PBS洗1次，静置3 min后弃上清，注意不要吸走微载体。将0.5 µL Calcein-AM和2 µL碘化丙啶按说明书稀释到1 mL PBS中，现用现配，每孔加入200 µL混合液，37 ℃避光孵育15 min；用500 µL PBS洗1次；每孔保留200 µL PBS，荧光显微镜观察拍照。
1.4.8 实时定量聚合酶链反应 对旋转细胞培养系统三维动态培养14 d后的第1代老年人表皮干细胞和儿童表皮干细胞自组装形成的三维细胞球进行实时定量聚合酶链反应。采用TRIzol法从三维细胞球中提取总RNA，使用PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒测定mRNA浓度，将1.0-2.0 µL RNA反转录为cDNA；将cDNA稀释5倍后取2 µL采用TB Green®Fast qPCR Mix试剂盒扩增目的基因，扩增程序为PCR 95 ℃ 3 min→(95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s→72 ℃ 15 s) 40个循环。以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔct法对目的基因进行相对定量分析。每组设置3个重复孔。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①倒置显微镜观察儿童和老年人表皮干细胞形态及生长状况；②细胞免疫荧光鉴定儿童和老年人表皮干细胞表面标志物的表达；③流式细胞术、CCK-8、细胞克隆形成实验和活死染色观察儿童和老年人表皮干细胞的增殖、黏附情况；④旋转细胞培养系统三维动态培养和平面培养的老年人表皮干细胞的倍增效率和倍增时间；⑤旋转细胞培养系统动态培养的儿童和老年人表皮干细胞的干性标志基因表达。

1.6 统计学分析 使用Graphpad Prism软件(9.1.1版)进行统计分析。所有数据均以至少3个独立实验的x±s表示。统计学差异采用方差分析和Tukey多重比较检验。P < 0.05，P < 0.01为差异有显著性意义。该文统计学方法已经通过军事医学院生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

细胞培养对于以干细胞为基础的再生医学无疑是必不可少的，当前研究可通过多能性和组织特异性干细胞的体外培养重建人体组织[21]。皮肤表皮中包含的表皮干细胞以及角质形成细胞具有广泛的应用前景，可用于治疗烧伤、难治性溃疡、白癜风等[22]，同时也是组织工程和再生医学等领域重要的种子细胞，用于促进缺损的皮肤组织再生[23-24]。然而，表皮干细胞培养仍然面临一些挑战。表皮干细胞培养周期相对较长，原代细胞培养可长达2周，其增殖分化更是受细胞外基质、细胞壁龛以及细胞间通讯等因素的影响[24-25]。过长的培养时间无疑降低了临床应用的效率。因此，有效扩增表皮干细胞并维持其增殖潜能以满足临床应用的需求尤为重要。该研究采用无饲养层、无血清培养基，避免了传统培养体系中采用鼠源性成纤维细胞和血清造成动物微生物传播的风险[26]。通过对儿童和老年人表皮干细胞的分离和平面培养，初步研究表明老年人表皮干细胞增殖能力明显弱于儿童组。采用旋转细胞培养系统发现可明显改善老年人表皮干细胞的细胞倍增效率和细胞倍增时间，并维持了细胞的干性。因此，该研究提供了一个有关老年人表皮干细胞的有效培养方案，拓展了其在生物医学研究和临床中的应用范围。
由表皮干细胞分裂的特点可知，暂时扩增细胞是由表皮干细胞的非对称分裂产生，而当皮肤受损或者体外培养时，可加快细胞分裂和增殖[27-28]。研究表明表皮干细胞可表达CD49fbri/CD71dim，有较强的增殖能力；暂时扩增细胞表达CD49fbri/CD71bri，增殖能力较弱[29-30]。流式检测结果显示儿童组第1代细胞中CD49fbri/CD71dim表达率为65.3%，CD49fbri/CD71bri表达率为29.8%；老年组第1代细胞中CD49bri/CD71dim表达率为31.7%，CD49fbri/CD71bri表达率为63.7%。说明经过平面培养传代后，儿童组和老年组部分细胞均发生了克隆转化，细胞增殖能力有所下降，同时也验证了老年组中含有较多的暂时扩增细胞，但儿童组仍较老年组具有更强的增殖能力。CCK-8和细胞克隆形成实验结果表明老年人表皮干细胞的增殖能力弱于儿童组。随着年龄的增长，老年人的干细胞功能会逐渐下降，导致干细胞的自我更新和分化能力减弱[31-32]。体外培养过程中也发现老年人的表皮干细胞比例有所下降，集落形成能力下降[33]，且功能受损[34]，与该研究结果一致。
微载体扩增培养是一种有效提高细胞扩增效率的方案，多应用于间充质干细胞、脂肪干细胞或体细胞的培养中[35]，采用可生物降解材料可减少胰酶的影响，在应用上更具优势[36]。基于以上研究结果，该实验首次采用旋转细胞培养系统和3D TableTrix®可生物降解微载体三维动态培养老年人表皮干细胞，结果发现老年人表皮干细胞在旋转细胞培养系统动态培养体系下具有和儿童组相似的增殖状态。在均质的三维动态培养条件下，逐渐增殖的表皮干细胞自组装形成基于微载体支架材料的三维细胞球，大小不一且形状不规则。该三维细胞球是随着细胞不断克隆增殖，逐渐将多个负载细胞的微载体聚集而成，是细胞和支架材料的有机结合，为组织工程构建提供了基础，也可用于后续体外药筛、毒理等研究。该研究作者推测，细胞间相互作用或者细胞外基质在三维细胞球形成过程中起到了一定的作用，还需续进一步研究探讨。此外，研究表明类似的细胞聚集可保持细胞间黏附、维持细胞活性和三维微环境[19，37]，故有学者提出了微组织的概念，指代在支架材料上生成的具有一定功能和活性的细胞聚集团块[38-39]，与该实验的细胞球相似，但与纯细胞生成的类器官有所区别[40]。旋转细胞培养系统联合微载体可以为贴壁细胞提供自由生长的三维空间，便于细胞形成更复杂的组织结构，这可用于临床上各种组织和器官的修复[41]。此外，旋转细胞培养系统还可以用于疾病模型的建立和药物筛选[42]，通过将患者的细胞培养在旋转细胞培养系统中，可以模拟出患者体内的环境，用于研究疾病的发生和发展机制，以及筛选和评估潜在的治疗药物，这对于个性化医疗和精准药物治疗具有重要意义。
从培养效率上来看，旋转细胞培养系统三维动态培养下的老年人表皮干细胞相较于平面培养具有更高的细胞扩增效率。旋转细胞培养系统可以提供更好的细胞培养环境和均质的培养条件，改善细胞培养的效果[43]。相比于传统的细胞培养方法，旋转细胞培养系统可以提供更好的氧气和营养物质供应，同时排除代谢产物，有效减少细胞死亡率[44]，提高细胞培养的成功率和细胞产量，为皮肤组织工程和再生医学提供可靠的种子细胞。为进一步说明旋转细胞培养系统对老年人表皮干细胞干性维持的影响，通过实时定量聚合酶链反应检测干性标志物基因ITGA6和ITGB1、表皮基底细胞标志物K5以及分化标志物K1和K10的表达，结果显示，三维动态培养能显著维持老年人表皮干细胞球中ITGA6和ITGB1的表达，增加K5的表达水平并降低K1和K10表达水平，老年组和儿童组各基因表达水平无明显差异，为老年人表皮干细胞寿命的延长和干细胞诱导维持提供了新的思路。
该研究还存在一些局限性：首先，初步探究了老年人相较于儿童组的增殖能力差异，尚未纳入其他年龄组(如青年人、中年人等)。未来的研究可考虑拓展研究对象，以更全面地了解表皮干细胞的年龄相关变化。其次，为进一步证明旋转细胞培养系统三维动态培养的优势并推动临床转化应用，还应系统比较其与平面培养体系的各方面性能，并增加对三维动态培养后代谢产物检测和动物实验功能验证，将有助于全面了解三维动态培养对细胞特性和功能的影响。
综上，该研究验证了老年人表皮干细胞增殖能力弱于儿童。采用旋转细胞培养系统三维动态培养老年人表皮干细胞不仅可促进其增殖并形成基于微载体支架材料的三维细胞球，利于模拟细胞体内微环境，而且该系统提高了老年人表皮干细胞的培养效率，具有促进分化祖细胞增殖和维持细胞干性的潜力。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

旋转细胞培养系统对老年人表皮干细胞增殖和干性维持的影响

Effect of rotating cell culture system on proliferation and stemness maintenance of epidermal stem cells in the elderly

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李俊, 巩晶晶, 孙国斌, 郭睿, 丁杨, 强立娟, 张晓莉, 方占海. miR-27a-3p激活MAPK信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1609-1617.
[2]	张雨馨, 于聪, 张翠, 丁建军, 陈岩. 轻度认知障碍老人与认知正常老人在不同单双任务下姿势控制能力的差异性[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1643-1649.
[3]	迟文鑫, 张存鑫, 高凯, 吕超亮, 张科峰. 川陈皮素抑制BV2小胶质细胞炎症反应的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1321-1327.
[4]	胡涛涛, 刘兵, 陈诚, 殷宗银, 阚道洪, 倪杰, 叶凌霄, 郑祥兵, 严敏, 邹勇. 过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞促进小鼠皮肤创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1343-1349.
[5]	金凯, 唐婷, 李美乐, 谢裕安. 人脐带间充质干细胞条件培养基及外泌体对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1350-1355.
[6]	李帝均, 酒精卫, 刘海峰, 闫磊, 李松岩, 王斌. 明胶三维微球装载人脐带间充质干细胞修复慢性肌腱病[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1356-1362.
[7]	刘琪, 李林臻, 李玉生, 焦泓焯, 杨程, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1371-1379.
[8]	牛永康, 冯志尉, 王耀斌, 刘众成, 向德剑, 梁晓远, 移植, 詹红伟, 耿彬, 夏亚一. 白藜芦醇激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白促进小鼠MC3T3-E1细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 908-916.
[9]	李慧军, 李黄岩, 张业廷. 身体活动与老年人认知领域研究热点与主题演变[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 1073-1080.
[10]	柳承源, 过倩萍. Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7490-7498.
[11]	方源, 钱智勇, 何源哈达, 王海燕, 沙丽蓉, 李筱贺, 刘婧, 贺雅超, 张凯, 特木日巴根. 蒙药蓝刺头对血管内皮细胞增殖和血管生成能力的潜在作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7519-7528.
[12]	石彤彤, 邓荣霞, 张建光. 天然提取与人工合成羟基磷灰石颗粒理化性能及刺激胶原蛋白分泌的差异[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7278-7285.
[13]	尹航, 宋奎. 藏红花素水凝胶对软骨细胞与MC3T3-E1细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7293-7300.
[14]	刘晨晨, 刘锐泽, 鲍蒙蒙, 方李, 曹立全, 毋江波. 血流限制训练干预老年肌少性肥胖[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6963-6970.
[15]	汪兆艳, 王倩, 刘卫鹏, 杨辉, 栾佐, 屈素清. 纤维连接蛋白对人神经干细胞诱导分化为少突胶质前体细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6661-6666.