甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶促进腹壁缺损修复

doi:10.12307/2025.409

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (10): 2074-2082.doi: 10.12307/2025.409

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甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶促进腹壁缺损修复

刘忠钰1，2，李文娅2，范永鸿2，吕双3，裴娟3，陈娅琴4，刘倍余2，孙红玉1，2

1西南医科大学临床医学院肝胆外科，四川省泸州市 646000；2 中国人民解放军西部战区总医院基础医学实验室，四川省成都市 610083；西南交通大学，3临床医学院，4生命科学与工程学院，四川省成都市 610031

收稿日期:2023-12-20 接受日期:2024-03-06 出版日期:2025-04-08 发布日期:2024-08-22
通讯作者: 孙红玉，博士，副主任技师，西南医科大学临床医学院肝胆外科，四川省泸州市 646000；中国人民解放军西部战区总医院基础医学实验室，四川省成都市 610083
作者简介:刘忠钰，男，1998年生，四川省泸州市人，汉族，硕士，主要从事真皮细胞外基质水凝胶制备与腹部创伤修复研究。
基金资助:
西部战区总医院联合攻关项目(2019LH04)，项目名称：腹部创伤分级救治及器官功能修复系列研究，项目负责人：孙红玉；西部战区总医院青年孵化项目(2021-XZYG-C17)，项目名称：仿贻贝抗冻释氧粘附水凝胶高原快速止血和伤口愈合的研究，项目负责人：刘倍余

Methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel promotes repair of abdominal wall defects

Liu Zhongyu1, 2, Li Wenya2, Fan Yonghong2, Lyu Shuang3, Pei Juan3, Chen Yaqin4, Liu Beiyu2, Sun Hongyu1, 2

1Department of Hepatobiliary Surgery, School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Laboratory of Basic Medicine, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China; 3College of Clinical Medicine, 4School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, Sichuan Province, China

Received:2023-12-20 Accepted:2024-03-06 Online:2025-04-08 Published:2024-08-22
Contact: Sun Hongyu, PhD, Associate chief technician, Department of Hepatobiliary Surgery, School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Laboratory of Basic Medicine, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
About author:Liu Zhongyu, Master, Department of Hepatobiliary Surgery, School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Laboratory of Basic Medicine, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
Supported by:
Joint Research Project of General Hospital of Western Theater Command, No. 2019LH04 (to SHY); Western Theater Command General Hospital Youth Incubation Project, No. 2021-XZYG-C17 (to LBY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
真皮细胞外基质：将猪新鲜真皮层经物理、化学或生物酶消化等方法进行脱细胞处理，去除组织中可能引起免疫排斥反应的细胞及抗原分子，保留细胞外基质，主要成分包括胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖和透明质酸等，可促进组织修复与再生。
甲基丙烯酰化改性：是将蛋白质中的氨基基团接枝上甲基丙烯酰基，这种改性允许脱细胞基质在紫外光引发下交联形成稳定的凝胶结构。

背景：目前用于填充腹壁缺损部位的合成高分子材料(如聚丙烯或聚酯)不仅缺乏可降解性和生物活性，还难以适应复杂形状伤口需求，因此，找到免疫原性低、组织相容性好的生物活性材料成为腹壁缺损修复研究的热点。
目的：制备甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶，探讨其在腹壁缺损中的潜在应用价值。
方法：①依次用0.25%胰蛋白酶、1%Triton X-100对猪真皮进行脱细胞处理，获得真皮细胞外基质；胃蛋白酶消化真皮细胞外基质，经甲基丙烯酸酐改性后光交联形成甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶，扫描电镜观察水凝胶的微观形貌，测试其流变学性能、溶胀性等理化性质；②将L929成纤维细胞接种到甲基丙烯酰化改性的真皮细胞外基质水凝胶中，检测细胞相容性；③将12只SD大鼠随机分为2组(n=6)，创建保留腹膜的腹壁缺损模型，聚丙烯组缺损部位填充聚丙烯材料，水凝胶组缺损部位填充甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶，两组创面皮肤均用聚丙烯材料覆盖，观察创面愈合情况并进行组织学分析。
结果与结论：①采用酶解法对猪真皮进行脱细胞后具有良好的脱细胞效果，并且原有的糖胺聚糖及胶原蛋白保留较好。扫描电镜下可见甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶为疏松多孔结构，孔径在70-120 µm之间，该水凝胶的溶胀比为(16.88±3.24)%，吸水率为(94.24±1.11)%，流变学性能测试表明该水凝胶状态稳定且具有剪切变稀特点，具备可注射性；②CCK-8检测与Live/Dead染色结果显示，甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶具有良好的细胞相容性；③动物实验结果显示，实验组术后7，10，14 d的皮肤创面愈合率高于对照组(P < 0.05)；皮肤与肌层组织苏木精-伊红、Masson染色显示，与聚丙烯组比较，水凝胶组术后14 d的皮肤创面上皮化情况、毛囊生成、胶原纤维排列及新生血管情况更好，术后28 d的皮肤创面新生组织结构与正常组织相近，并且瘢痕增生较少，术后28 d时可见少量肌肉组织再生；④结果表明，甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶可促进腹壁缺损大鼠的皮肤创面愈合和肌肉组织再生。
https://orcid.org/0009-0001-2608-7760 (刘忠钰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 猪真皮, 真皮细胞外基质, 甲基丙烯酰化改性, 水凝胶, 光固化, 腹壁缺损, 皮肤愈合, 肌肉组织再生

Abstract: BACKGROUND: Synthetic polymers, such as polypropylene and polyester, used for the treatment of abdominal wall defects not only lack biodegradability and bioactivity but also fail to meet the demands of complex and irregular wounds. Therefore, finding bioactive materials with low immunogenicity and good histocompatibility has become a hot spot in the repair of abdominal wall defects.
OBJECTIVE: To prepare methacryloyl modified dermal extracellular matrix hydrogel and explore its potential application in abdominal wall defect.
METHODS: (1) The porcine dermis was acellular with 0.25% trypsin and 1% Triton X-100 in turn to obtain the dermal extracellular matrix. After pepsin digestion and methacrylic anhydride modification, the methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel was formed by photocrosslinking. The microscopic morphology of the hydrogel was observed by scanning electron microscope, and its rheological properties, swelling properties and other physical and chemical properties were tested. (2) Mice fibroblasts (L929) were inoculated into methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel to detect the cell compatibility. (3) Totally 12 SD rats were randomly divided into two groups (n=6) to create abdominal wall defect model with peritoneum preserved. The defect site of the polypropylene group was filled with polypropylene material, and the hydrogel group was filled with methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel. The wound skin of both groups was covered with polypropylene material. The wound healing was observed and histological analysis was carried out.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Enzymatic hydrolysis had a good decellularization effect on porcine dermis after decellularization, and the original glycosaminoglycans and collagen were well retained. Scanning electron microscope observation revealed that the dermal extracellular matrix hydrogel presented loose and porous structure. The aperture was between 70 and 120 µm. The swelling ratio was (16.88±3.24)% and the water absorption was (94.24±1.11)%. The rheological property test showed that the methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel was stable and had shear thinning characteristics, with injectability. (2) CCK-8 assay and live/dead staining showed that methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel had good cell compatibility. (3) The results of animal experiments showed that the skin wound healing rate of the experimental group was higher than that of the control group at 7, 10, and 14 days after operation (P < 0.05). Hematoxylin-eosin and Masson staining of skin and muscle tissue exhibited that compared with the polypropylene group, the skin wound epithelialization, hair follicle formation, collagen fiber arrangement, and neovascularization were better in the hydrogel group 14 days after surgery. The skin wound new tissue structure was similar to the normal tissue at 28 days after surgery, and scar hyperplasia was less. A small amount of muscle regeneration was observed on day 28 after operation. (4) The results show that the methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel can promote wound skin healing and muscle tissue regeneration in rats with abdominal wall defect.

Key words: porcine dermis, dermal extracellular matrix, methacrylated, hydrogel, photocuring, abdominal wall defect, skin repair, muscle tissue regeneration

中图分类号:

刘忠钰, 李文娅, 范永鸿, 吕双, 裴娟, 陈娅琴, 刘倍余, 孙红玉. 甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶促进腹壁缺损修复[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(10): 2074-2082.

Liu Zhongyu, Li Wenya, Fan Yonghong, Lyu Shuang, Pei Juan, Chen Yaqin, Liu Beiyu, Sun Hongyu. Methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel promotes repair of abdominal wall defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(10): 2074-2082.

图/表（结果） 10

2.1 真皮细胞外基质组织学染色分析如图1所示，苏木精-伊红染色结果显示，猪真皮中存在大量蓝染细胞核，真皮细胞外基质中蓝色细胞核消失，剩下大量红色胶原蛋白纤维；Masson染色结果显示，猪真皮中存在大量红色肌纤维，真皮细胞外基质中红色肌纤维已消失，剩下组织中可见明显的蓝色胶原蛋白纤维；DAPI细胞核染色结果显示，猪真皮组织中分布大量蓝色细胞核，真皮细胞外基质中蓝色细胞核已被完全去除。

2.2 真皮细胞外基质DNA残留检测在DNA琼脂糖凝胶电泳中，猪真皮可见明亮条带，而真皮细胞外基质中DNA条带几乎完全消失(图2A)。在DNA定量检测中，猪真皮组织中的DNA含量为(731.0±369.7) ng/mg，真皮细胞外基质中残留的DNA含量仅为(10.77±2.72) ng/mg，真皮细胞外基质中的DNA含量显著低于猪真皮(P < 0.001)(图2B)，表明真皮细胞基质中DNA基本去除[9]。

2.3 真皮细胞外基质中糖胺聚糖及胶原蛋白含量检测猪真皮中糖胺聚糖的含量为(3.32±0.04) μg/mg，真皮细胞外基质中糖胺聚糖的含量为(3.00±0.05) μg/mg，较猪真皮中的糖胺聚糖含量下降(P < 0.001)；猪真皮中胶原蛋白含量为(287.6±32.9) μg/mg，真皮细胞外基质中胶原含量为(343.8±52.2) μg/mg，两组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)[9]，见图3。

2.4 d-ECMMA结构的表征结果甲基丙烯酸酐主要通过与蛋白中的氨基残基反应而使得真皮细胞外基质被修饰改性。核磁氢谱(1H NMR)检测结果显示，d-ECMMA在5.37×10-6及5.60×10-6处可见新增的甲基丙烯酰胺基团的信号峰(图4A)，计算5.37×10-6和5.60×10-6两处峰的积分面积与氨基在2.9×10-6处峰面积积分比值[12-13]，可得甲基丙烯酸酐的取代度约为90%。
傅里叶变换红外光谱检测结果显示，d-ECMMA在 970 cm-1处出现烯烃中C-H的弯曲振动峰[13]，而光交联成胶后C=C双键打开，此处峰消失(图4B)。

2.5 d-ECMMA水凝胶的理化性质表征结果
2.5.1 水凝胶的制备与形貌观察将d-ECMMA在添加苯基-2，4，6三甲基苯甲酰亚磷酸锂引发剂后于紫外光照射下成胶，溶液由流动的液体转变为凝胶状态(图5A)，说明水凝胶制备成功。将水凝胶冻干，液氮脆断后用场发射扫描电镜观察其截面，可见水凝胶为疏松多孔结构(图5B)。根据电镜图计算水凝胶的孔径分布，其孔径主要分布于70-120 μm之间(图5C)。

2.5.2 水凝胶的吸水和溶胀性能测试检测结果显示，d-ECMMA水凝胶的溶胀比为(16.88±3.24)%，吸水率为(96.24±1.11)%。较高的含水量利于水凝胶发挥支持细胞生长的作用[14]。
2.5.3 水凝胶的流变性能检测如图6A所示，在温度从37 ℃到4 ℃变化时，d-ECMMA水凝胶的储能模量G’与损耗模量G”变化均较小，说明水凝胶的状态较为稳定，这与模量随温度变化的水凝胶有明显区别[10]。在角频率为 0.1-100 Hz振荡测试条件下，真皮细胞外基质水凝胶和d-ECMMA水凝胶均表现出黏弹性(G′ > G″)，但d-ECMMA水凝胶的G′大于真皮细胞外基质水凝胶，而G″小于真皮细胞外基质水凝胶，见图6B，这表明d-ECMMA水凝胶具有更高的弹性模量。此外，d-ECMMA水凝胶的黏度随着剪切速率的增大而降低(图6C)，这表明其具有剪切变稀特性[15] 。d-ECMMA水凝胶能够以注射的方式进行应用，而不会在注射时出现堵塞现象(图6D)。

2.6 d-ECMMA水凝胶的细胞相容性 CCK-8检测结果显示，随着培养时间的延长，两组细胞增殖吸光度值升高，水凝胶组培养第3，5天的细胞增殖吸光度值高于空白组 (P < 0.01)，见图7A，说明d-ECMMA水凝胶有利于L929成纤维细胞的生长。
Live/Dead染色结果显示，培养第1，3，5天，两组L929成纤维细胞均无明显死亡，但与空白组相比，水凝胶组大多数细胞铺展面积较小(图7B)，这是细胞在水凝胶中生长的典型特征[16]。以上结果说明d-ECMMA水凝胶细胞相容性良好，能够较好地支持成纤维细胞生长。

2.7 d-ECMMA水凝胶促进大鼠腹壁缺损修复观察结果 2.7.1 实验动物数量分析 12只腹壁缺损造模SD大鼠均进入结果分析。
2.7.2 两组大鼠腹壁缺损部位皮肤愈合情况实验建立保留腹膜的腹壁缺损大鼠模型，应用聚丙烯材料和d-ECMMA水凝胶填充/覆盖创面 (图8A)。定期观察两组大鼠腹壁缺损部位皮肤创面愈合情况，发现两组动物的皮肤创面均可随时间延长逐渐愈合，术后第7天，水凝胶组创面肉芽组织生长红润、柔软、触之易出血，无明显渗出液，聚丙烯组创面表面深浅不一，有少量渗出液存在(图8B)；术后第10天，水凝胶组皮肤创面面积明显更小(图8C)；术后第14天，水凝胶组皮肤创面愈合情况更佳，瘢痕组织显著减少。计算皮肤创面愈合率情况可知，从术后第7天开始，水凝胶组皮肤创面愈合率均高于聚丙烯组(P < 0.05或P < 0.01)，见图8D，可见d-ECMMA水凝胶对皮肤创面愈合具有较好的促进作用。
两组术后第14，28天的皮肤创面组织苏木精-伊红与Masson染色结果，见图9。

苏木精-伊红染色结果显示：术后第14天，聚丙烯组真皮基质排列杂乱，炎症细胞大量浸润；水凝胶组皮肤创面有炎症细胞少，创面周围有少许毛囊和皮脂腺生成，真皮部分基质更加整齐，创面上皮化程度更高，表明水凝胶组创面修复较聚丙烯组更好，创面再上皮化程度更高。术后第28天，两组创面基本修复，但水凝胶组创面上皮化更接近正常组织。
Masson染色结果显示：术后第14天，水凝胶组可见较多新生血管生成，胶原纤维大量沉积且排列整齐；聚丙烯组仅有少许血管生成，创面内胶原纤维排列紊乱且细小稀疏。术后第28天，水凝胶组胶原纤维排列较聚丙烯组更接近于正常皮肤。
2.7.3 肌层缺损修复情况移走皮肤组织，观察大鼠腹壁肌肉缺损修复情况，结果如图10A所示，术后第14天两组肌肉缺损处未见明显修复，术后第28天水凝胶组肌层组织缺损处凹坑相比聚丙烯组明显减小。术后第28天两组大鼠腹壁缺损部位肌肉组织苏木精-伊红与Masson染色结果显示，水凝胶组肌肉缺损部位的纤维结缔组织中可见较多肌纤维组织，肌纤维被结缔组织连接与包围，成束排列；聚丙烯组肌肉缺损部位的纤维结缔组织中可见少量肌纤维组织，形态与水凝胶组表现一致(图10B)，表明d-ECMMA水凝胶及聚丙烯材料均促进了肌肉组织再生，均展示出促腹壁缺损愈合的作用。

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引言

腹壁缺损是指因战创伤、肿瘤切除、感染等所致的腹部组织缺损，因其容易合并腹腔感染、肠梗阻、坏死等并发症而影响创面愈合，严重时甚至造成患者死亡[1]。目前临床上多采用人工合成高分子材料(如聚丙烯或者聚酯)来填充腹壁缺损部位进行治疗，但这些材料填充性差、可降解性不佳、生物活性低，容易导致创口愈合慢或不愈合、疝气复发甚至感染、肠梗阻等并发症[2-3]。因此，找到免疫原性低、组织相容性好的生物活性材料成为腹壁缺损修复研究的热点。
真皮细胞外基质水凝胶是将脱细胞真皮基质经冻干、酶消化制成的温敏性水凝胶材料，其富含的细胞外基质成分可促进细胞增殖和迁移[4]。目前真皮细胞外基质水凝胶多用于急慢性皮肤创面修复，具有良好的生物相容性和生物活性，能够促进组织再生修复，并且能很好地填充缺损处的不规则伤口，在更深创面(腹壁肌层、内脏等)的修复中存在应用潜力[5-6]。与此同时，甲基丙烯酸酐改性的水凝胶不仅能保留细胞外基质的生物活性，还能赋予材料可调节的理化性能。PARTHIBAN等 [7]利用甲基丙烯酸酐对骨的脱细胞基质进行改性，光交联后制备了甲基丙烯酰化骨脱细胞基质水凝胶，相较于未经改性的细胞外基质水凝胶具有更好的力学性能，并且保留了原有细胞外基质的优异生物学性能，允许内皮细胞血管化并在较短时间诱导血管网络的形成。甲基丙烯酰化改性后的脱细胞基质在添加光引发剂后可在紫外光照下快速交联成胶，而脱细胞基质原有的结构和成分几乎不受影响，可为细胞增殖和迁移提供支持，在组织再生领域具有较好的应用前景[8]。经甲基丙烯酸酐改性后的真皮细胞外基质水凝胶可能是用于腹壁缺损修复的一种良好替代材料。
此次实验制备了甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质(methacrylated dermal extracellular matrix， d-ECMMA)水凝胶，通过紫外光固化成胶后在大鼠保留腹膜的腹壁缺损创面中观察其促修复作用，以期为临床修复腹壁缺损提供新的选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计制备d-ECMMA水凝胶，检测其理化性质和生物学功能，采用t检验进行两组间的比较分析。
1.2 时间及地点实验于2022年1月至2023年12月在中国人民解放军西部战区总医院中心实验室完成。
1.3 材料

1.3.1 实验动物 8周雄性SD大鼠12只，体质量250-280 g，购自北京斯贝福实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。动物购进后在中国人民解放军西部战区总医院动物实验中心常规适应性饲养2周，温度为(22±2) ℃、湿度为40%-60%，12 h 光/暗循环，自由进食。实验方案已通过中国人民解放军西部战区总医院动物伦理委员会批准(批准号：2021EC2-20)。

1.3.2 主要仪器与材料猪皮(成都市金牛区天回镇土门社区农贸市场购得)；聚丙烯疝修补材料WS-P-15×15(常州医疗器材有限公司，注册证号为国械注准20163130370)。0.25%胰蛋白酶(美国 Hyclone公司)；Triton X-100(安徽兰杰柯科技有限公司)；甲基丙烯酸酐(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；羟脯氨酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；组织糖胺聚糖总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)；苯基-2，4，6三甲基苯甲酰亚磷酸锂、便携式紫外光固化机或手电筒(苏州永沁智能设备有限公司)；血液/细胞/组织基因组 DNA提取试剂盒(G3633)、小鼠L929成纤维细胞、小鼠L929专用培养基、苏木精及伊红染液、DAPI染色液、Masson染液试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)；Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

液体核磁(德国-Bruker-400M)；场发射扫描电镜(美国-FEI-NOVA NANOSEM 230)；傅里叶变换红外光谱(美国-赛默飞，iS5)；流变仪(美国TA Discovery 旋转流变仪，HR-10)；冷冻干燥机(北京盛超科创生物科技有限公司)；冷冻研磨机(美国 SPEX SamplePrep公司)；倒置相差荧光显微镜(日本Olympus公司)；病理切片机(赛默飞世尔科技有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 真皮细胞外基质的制备采用0.25%胰蛋白酶/1%Triton X-100对猪真皮进行脱细胞处理[9]。主要过程如下：新鲜猪皮去除上皮组织和脂肪后用0.25%胰蛋白酶消化6 h；去离子水漂洗并用体积分数70%乙醇浸泡10-12 h；体积分数3%H2O2处理15 min，再次用去离子水洗
涤；用含1%TritonX-100的0.26%EDTA/0.69%Tris溶液作用过夜；去离子水洗涤后用0.1%过氧乙酸/体积分数4%乙醇浸泡2 h；去离子水洗涤后置于PBS中4 ℃保存。
1.4.2 真皮细胞外基质脱细胞与细胞外基质保留情况
组织学检测：①包埋、固定及切片：将真皮细胞外基质、猪真皮用40 g/L多聚甲醛溶液固定一两天，经体积分数70%乙醇脱水过夜，依次经体积分数80%，90%，95%，100%，100%乙醇溶液脱水(各1 h)，二甲苯浸泡2次(各20 min)，石蜡包埋后在切片机上切成4 μm薄片。②苏木精-伊红染色：将切片依次在二甲苯(2次)及体积分数100%(2次)，90%，80%，70%，50%乙醇、去离子水中浸泡复水，苏木精-伊红染液染色，脱水、透明化后中性树胶封固，正置显微镜下采图。③Masson染色：将切片梯度复水后，核染液染核60 s，蒸馏水冲洗30 s左右，再用浆染液染色胞浆45 s，蒸馏水冲洗30 s左右，分色液分色8 min，用蓝色复染液染色5 min，用无水乙醇冲洗干净，吹干后中性树胶封固，正置显微镜下采图。④DAPI染色：将切片梯度复水后用DAPI染液染色，梯度脱水，二甲苯透明化处理，中性树胶封固，正置显微镜下采图。
DNA含量测定及琼脂糖凝胶电泳：①使用组织/细胞/血液基因组DNA提取试剂盒提取真皮细胞外基质与猪真皮的DNA。②采用Nanodrop 2000检测DNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5 μL待测DNA溶液于检测基座上，使用电脑上的软件测试260 nm及280 nm处的吸光度值。③琼脂糖凝胶电泳：首先制备1.5%琼脂糖凝胶，然后将制胶玻璃板封好后加入5 μL核酸染料以及琼脂糖凝胶液，混匀倒入内槽玻璃板上胶板待凝胶完全凝固。在点样板加上混合样品7.5 μL和上样缓冲液1×Loading Buffer 2.5 μL，在胶板上的样品小槽上样(每槽10 μL)。凝胶置于电压190 V进行电泳，当电泳指示剂溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1 cm处时，停止电泳。取出凝胶，在紫外灯下观察，DNA存在则显示出荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
糖胺聚糖含量测定：使用组织糖胺聚糖总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒检测猪真皮及真皮细胞外基质组织样品中的糖胺聚糖含量。称取粉碎后的组织200 mg(n=3)，56 ℃水浴锅内水浴6 h，再放入90 ℃水浴10 min，按照二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒说明书操作测定糖胺聚糖含量。
胶原蛋白含量测定：使用羟脯氨酸含量试剂盒检测猪真皮及真皮细胞外基质中总胶原蛋白的含量。准确称取样品80 mg，加入1 mL盐酸溶液(6 mol/L)后置于100 ℃干燥箱中水解5 h，冷却后，将水解液pH值调至 6.0-6.8，参照羟脯氨酸测试盒说明书(酸水解法)操作测定羟脯氨酸含量。胶原蛋白中13%的含量是羟脯氨酸，所以可利用羟脯氨酸含量计算胶原蛋白含量。
1.4.3 d-ECMMA水凝胶的制备
d-ECMMA的制备：①制备真皮细胞外基质溶液[9]：将真皮细胞外基质剪碎后冷冻干燥，使用冷冻研磨机研磨成粉末，加入盐酸-胃蛋白酶原混合溶液中(盐酸浓度0.01 mol/L，胃蛋白酶原质量浓度1 g/L，真皮细胞外基质的质量浓度为10 g/L)，室温搅拌消化72 h后过滤；用NaOH(0.1 mol/L)将溶液pH值调整为7.4，加入10×PBS平衡渗透压，置于4 ℃保存。②制备d-ECMMA[10]：真皮细胞外基质溶液冻干处理后，取0.5 g溶于去离子水中，室温下加入甲基丙烯酸酐共0.5 mL，加入速率0.5 mL/min；用NaOH(5 mol/L)将溶液pH值调节至8-10，搅拌过夜；用稀盐酸中和，再用截留分子质量为3 500 Da的透析袋透析1周，置于-80 ℃冷冻干燥处理3 d。检测d-ECMMA的核磁氢谱(1H NMR)，计算取代度。

光交联成胶：将d-ECMMA溶于PBS中，使其终质量浓度为100 g/L，加入光引发剂苯基-2，4，6三甲基苯甲酰亚磷酸锂(5 g/L)混匀，置于紫外光固化机上(405 nm，25 mW/cm2)交联120 s，获得d-ECMMA水凝胶[10]。将真皮细胞外基质、d-ECMMA、d-ECMMA水凝胶冻干后用傅里叶变换红外光谱仪在500-4 000 cm-1的波长范围内进行扫描。将适量真皮细胞外基质溶液置于37 ℃0.5 h后变成凝胶状，即为真皮细胞外基质水凝胶。
1.4.4 d-ECMMA水凝胶的理化性质表征及细胞相容性实验
形貌表征：将d-ECMMA水凝胶冻干，液氮脆断后用导电胶粘在样品台上，喷金30 s，场发射扫描电镜下观察水凝胶的截面形貌。选取3个相同放大倍数下的截面形态图，通过Image J软件对水凝胶的孔径尺寸进行测量，并描述其孔径分布特征。
溶胀性能：将d-ECMMA水凝胶冷冻干燥后称质量，记为m0；加入2 mL PBS浸泡 24 h，除去表面残留水分并称质量，记为m1，每种实验设置5个平行样。溶胀比= (m1-m0)/m0，吸水率= (m1-m0)/m1×100%。
流变性能测定：将d-ECMMA水凝胶置于流变仪上，直径为40 mm，测试其在恒定频率(1 Hz)和恒定应变(0.5%)条件下，由37 ℃到4 ℃时的储能模量(G’)和损耗模量(G”)。检测真皮细胞外基质水凝胶及d-ECMMA水凝胶在频率为0.1-100 Hz 的G’和G”变化趋势；测试d-ECMMA水凝胶在剪切速率0.01-100 rad/s下的黏度。
1.4.5 d-ECMMA水凝胶的细胞相容性在12孔板中光固化交联制备d-ECMMA水凝胶，加入500 μL小鼠L929成纤维细胞专用培养基，将15 μL L929成纤维细胞悬液接种到水凝胶上，细胞浓度5×109 L-1；空白组加入500 μL小鼠L929成纤维细胞专用培养基后将15 μL L929成纤维细胞悬液接种直接接种到12孔板内，细胞浓度5×109 L-1，置于37 ℃细胞培养箱中培养。培养第1，3，5天，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，采用Live/Dead活死细胞染色试剂盒检测存活状态。
1.4.6 d-ECMMA水凝胶对腹壁缺损的修复作用采用随机数字表法将12只SD大鼠分为对照组与实验组，每组6只。两组大鼠术前禁食12 h，经异氟烷吸入诱导麻醉，消毒皮肤后用无菌手术刀切除腹部右侧皮肤及肌肉造成直径1.5 cm的缺损，建立保留腹膜的腹壁缺损模型[11]，聚丙烯组用聚丙烯材料填充缺损部位，使用缝合线将其固定在皮肤及肌肉层之间；水凝胶组在创面及创缘处裸露组织内注射0.4 mL d-ECMMA预凝胶液，使用便携式手电紫外光(405 nm，25 mW/cm2)照射交联5 min固化成胶。2组均在创面皮肤表面使用聚丙烯材料覆盖并用丝线固定，覆盖无菌纱布，定期更换创面纱布敷料。术后第5，7，10，14天，观察各组创面愈合情况，采用Image J 软件分析创面愈合率，创面愈合率= (1-未愈合创面面积/原始创面面积)×100%。术后第14，28天，每组各取3只大鼠麻醉后处死，切取两组创面、创缘全层腹壁组织(术后第28天取材)，40 g/L多聚甲醛固定24 h，然后依次进行脱水、石蜡包埋及切片(4 μm)，最后采用苏木精-伊红及Masson 染色。
1.5 主要观察指标 d-ECMMA水凝胶的理化性质、细胞相容性以及促进大鼠腹部缺损组织愈合的情况。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0软件进行绘图与统计分析，实验结果用x±s表示，采用t检验进行两组间的比较分析，P < 0.05被认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经过中国人民解放军西部战区总医院生物统计学专家审核。

讨论

战创伤、腹部手术及感染等均可造成腹壁的缺损，临床上多采用补片对缺损处进行填充修复。无张力补片修补术能明显降低疝气发生率[17]。但目前所用的补片多为合成高分子材料(如聚丙烯、聚酯补片、复合补片等)，存在组织相容性不佳、降解性差、生物活性不足等缺陷，易导致术后伤口感染的发生，同时也使患者会产生明显异物感，舒适性较差[3]，并且这些材料对具有复杂形状的伤口填充效果不理想，难以达到满意的修补效果。而免疫原性低、组织相容性好的生物材料(如脱细胞基质等)可能是腹壁缺损修复的新选择 [18-19]。细胞外基质水凝胶具有类天然的多孔结构以及优异的生物活性[20]。此次实验基于真皮细胞外基质制作了可光交联的水凝胶，用于替代聚丙烯材料进行腹壁缺损部位的填充，发现该凝胶具有优异的生物相容性，可促进创面肌层和皮肤的愈合和组织再生。
真皮细胞外基质具有来源广、免疫原性低和易于制作水凝胶等特点，被广泛应用于组织修复和再生，并且真皮细胞外基质水凝胶可作为载体递送干细胞、药物、生长因子和其他治疗剂发挥治疗效果[6]。但未改性的真皮细胞外基质水凝胶力学性能较弱、成胶时间长，这限制了应用范围，尤其是在腹壁缺损应用中，其需要抵抗腹内压，这需要一定的力学性能[21]。研究表明，通过真皮细胞外基质中蛋白分子的交联可调控其机械和物理化学性能，而不显著影响真皮细胞外基质的固有生化活性和生物相容性[22]。
此次实验使用甲基丙烯酸酐修饰改性真皮细胞外基质，使其能在添加光引发剂后于紫外光照下仅用数秒或数分钟即可交联成胶，该水凝胶具高度多孔结构和高含水量，可支撑细胞黏附和生长。流变学检测结果表明，d-ECMMA水凝胶比普通温敏性的真皮细胞外基质水凝胶具有更高的弹性模量，并且凝胶状态较为稳定，还具有剪切变稀的可注射特性。体外细胞实验证实d-ECMMA水凝胶无细胞毒性，可促进细胞的黏附和增殖，这与既往文献报道一致[23-24]。
创面愈合是一个需要各种生化线索精密调控、多细胞协同参与的复杂过程，一般需经历凝血期、炎症期、增殖期和重塑期在内的4个时期。在这期间，各种生理病理现象相互交织，包括成纤维细胞增生、血管再生、细胞基质沉积、表皮化、伤口收缩及重塑等，任何一个环节停滞或被抑制都有可能导致创面愈合受阻或迁延不愈[25-26]。此次实验在大鼠腹部创建了保留腹膜的腹壁缺损模型，使用d-ECMMA水凝胶和传统的聚丙烯材料填充缺损处进行对比研究。为了更好地观察创面愈合情况和防止垫料等异物进入创口引起伤口感染致愈合不良等并发症，使用聚丙烯材料覆盖保护创口，在大鼠创口干燥封闭(约5 d)后去除。实验结果发现，在创面愈合早期水凝胶组与聚丙烯组无显著差别，这一时期创面组织再生不明显，而其中的填充物会在一定程度上会影响皮肤伤口收缩闭合[27-29]；随后，水凝胶组的皮肤创面愈合明显优于聚丙烯组，表现出较好的促愈合作用；14 d之后，两组皮肤创面虽然都基本愈合，但水凝胶组伤口组织中胶原纤维及毛细血管更多，这有助于创面再上皮化、减轻创面挛缩、促进皮肤组织再生[30]。
腹壁缺损修复包括皮肤、皮下结缔组织修复以及腹壁肌肉结构的重建[28]。皮肤缺损创面软组织修复是最早也是相对更加复杂的，主要包括表皮的再生(皮脂腺、汗腺和毛囊)、血管再生、胶原纤维沉积等[31]。此次实验苏木精-伊红和Masson染色结果显示，术后第14天，水凝胶组皮肤组织上皮化情况、毛囊生成、胶原纤维排列及新生血管情况较聚丙烯组好；术后28天，水凝胶组皮肤创面新生组织结构与正常组织相近，并且瘢痕增生情况较聚丙烯组明显更少，说明其具有更好的促进创面修复的作用。过度炎症会产生促纤维化分子，进而激活成纤维细胞，引起瘢痕增生[32]。研究表明，细胞外基质水凝胶具有一定减轻创面炎症反应的作用，可改善创面愈合微环境并减少源自挛缩和瘢痕组织形成的不良反应[33]。术后第14天的苏木精-伊红染色结果显示，水凝胶组皮肤创面组织中炎症细胞浸润更轻，这可能是后续该组皮肤愈合再生情况更好的原因，具体机制有待进一步研究。肌肉再生通常非常困难且极其缓慢[34-35]。在大鼠腹壁缺损模型中，聚丙烯组术后第28天可见大量纤维结缔组织而肌肉组织较少，水凝胶组已能观察到少量肌肉组织再生，说明d-ECMMA水凝胶有促进肌肉细胞迁移和增殖的能力。然而，实验也存在有一定的局限性，动物实验总体时间只进行了4周，不足以完全评估d-ECMMA水凝胶在腹壁缺损中对肌肉组织的促修复作用，尚需更久时间进行观察。
综上所述，实验通过对真皮细胞外基质进行甲基丙烯酰化改性，制备了光固化水凝胶并成功应用于大鼠腹壁缺损修复，该水凝胶具有疏松多孔结构、可注射性及良好的细胞相容性，在大鼠腹壁缺损模型中促进了皮肤创面愈合和肌肉组织再生。这些结果表明，d-ECMMA水凝胶在替代人工高分子材料进行腹壁缺损修复中潜力巨大，但目前该水凝胶促修复机制尚不完全清楚，还有待进一步进行研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

甲基丙烯酰化改性真皮细胞外基质水凝胶促进腹壁缺损修复

Methacrylated dermal extracellular matrix hydrogel promotes repair of abdominal wall defects

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