腰椎间盘突出症模型大鼠疼痛的针刺干预

doi:10.12307/2025.250

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
腰椎间盘突出症：指因椎间盘变性、纤维环破裂、髓核突出而刺激或压迫神经根、马尾神经所表现出的一种综合病症，主要表现为腰疼、坐骨神经痛、下肢麻木、疼痛、马尾神经症状等。
JAK2/STAT3信号通路：为细胞内传递信号的主链，在细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及免疫应答等活动中起重要作用。该通路由细胞因子和干扰素触发，能迅速地将细胞外信号转导到细胞核中，可调节机体免疫与多种炎症过程，与其相关的细胞因子可刺激调节人类炎症反应神经痛信号通道。

背景：针灸是缓解腰椎间盘突出症腰痛的有效方法，但其机制目前尚未明确。JAK2/STAT3信号通路相关因子可调节机体炎症反应，参与神经病理性疼痛的过程。
目的：基于JAK2/STAT3信号通路研究针刺对腰椎间盘突出症模型大鼠的作用机制。
方法：采用随机数字表法将40只SD大鼠分为假手术组、模型组、针刺组与针刺+激动剂组，每组10只。模型组、针刺组及针刺+激动剂组采用自体髓核移植法构建L5腰椎间盘突出症模型，造模3 d后，针刺组开始进行针刺治疗(作用于阳陵泉、肾俞、环跳、大肠俞等穴位)，针刺+激动剂组造模后第6，12，18天针刺治疗前向L4/L5椎间隙鞘内注射JAK2激动剂香豆霉素A1，针刺治疗1次/d，20 min/次，连续治疗15 d。造模前及造模后3，6，9，12，15，18 d，检测大鼠机械缩足阈值；造模后18 d，检测血清炎症因子水平，苏木精-伊红染色观察L5-L6组织形态，RT-PCR检测L5-L6组织JAK2、STAT3 mRNA表达，Western Blot检测L5-L6组织JAK2、STAT3、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达。
结果与结论：①模型组大鼠造模后不同时间点的机械缩足阈值均低于假手术组(P < 0.05)，针刺组大鼠造模后9，12，15，18 d的机械缩足阈值均高于模型组(P < 0.05)，针刺+激动剂组大鼠造模后9，12，15，18 d的机械缩足阈值均低于针刺组(P < 0.05)；②与假手术组比较，模型组白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、神经递质P物质、脑部神经肽Y水平均升高(P < 0.05)；与模型组比较，针刺组4种炎症因子水平均降低(P < 0.05)；与针刺组比较，针刺+激动剂组4种炎症因子水平均升高(P < 0.05)；③苏木精-伊红染色显示模型组大鼠腰椎退行性变化明显，针刺组与针刺+激动剂组大鼠腰椎退行性变化减轻，针刺组减轻更明显；④与假手术组比较，模型组JAK2与STAT3 mRNA表达、p-JAK2与p-STAT3蛋白表达均升高(P < 0.05)；与模型组比较，针刺组JAK2与STAT3 mRNA表达、p-JAK2与p-STAT3蛋白表达均降低(P < 0.05)；与针刺组比较，针刺+激动剂组JAK2与STAT3 mRNA表达、p-JAK2与p-STAT3蛋白表达均升高(P < 0.05)；⑤结果表明，针刺干预可通过降低腰椎间盘突出症模型大鼠的炎症反应来缓解疼痛，其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。

https://orcid.org/0009-0001-5295-9227(支芳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: JAK2/STAT3信号通路, 针刺, 腰椎间盘突出症, 病理性疼痛, 机械缩足阈值, 炎症反应

Abstract: BACKGROUND: Acupuncture is an effective method for lumbar pain in lumbar disc herniation, but its mechanism has not yet been clarified. Factors related to the JAK2/STAT3 signaling pathway regulate the body’s inflammatory response and are involved in the process of neuropathic pain.
OBJECTIVE: To study the mechanism of acupuncture on lumbar disc herniation in a rat model based on the JAK2/STAT3 signaling pathway.
METHODS: Forty Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: sham operation group, model group, acupuncture group, and acupuncture+agonist group, with 10 rats in each group. Animal models of L5 lumbar disc herniation was constructed through autologous disc cell transplantation in the model group, acupuncture group, and acupuncture+agonist group. Rats in the acupuncture group and the acupuncture+agonist group received acupuncture treatment (Yanglingquan, Shenshu, Huantiao, and Dachangshu acupoints) at 3 days after modeling, and acupuncture treatment was given once a day, 20 minutes each, for 15 consecutive days. Rats in the acupuncture+agonist group were injected intrathecally with coumermycin A1, a JAK2 agonist, into the L4/L5 intervertebral space, once a day, 20 minutes each, prior to the acupuncture at 6, 12, and 18 days after modeling. Paw withdrawal mechanical threshold was detected before and 3, 6, 9, 12, 15, and 18 days after modeling. At 18 days after modeling, serum inflammatory factor levels were detected, hematoxylin-eosin staining was performed to observe the morphology of L5-L6 tissues, RT-PCR was performed to detect the expression of JAK2 and STAT3 mRNAs in L5-L6 tissues, and western blot was performed to detect the expression of JAK2, p-JAK2 and p-STAT3 proteins in L5-L6 tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: The paw withdrawal mechanical thresholds of rats in the model group at different time points after modeling were lower than those in the sham operation group (P < 0.05), the paw withdrawal mechanical thresholds of rats in the acupuncture group were higher than those in the model group at 9, 12, 15, and 18 days after modeling (P < 0.05), and the paw withdrawal mechanical thresholds of rats in the acupuncture+agonist group were lower than those in the acupuncture group at 9, 12, 15, and 18 days after modeling (P < 0.05). The levels of interleukin 6, tumor necrosis factor α, neurotransmitter substance P, and brain neuropeptide Y were elevated in the model group compared with the sham operation group (P < 0.05); the levels of all four inflammatory factors were reduced in the acupuncture group compared with the model group (P < 0.05); and the levels of all four inflammatory factors were elevated in the acupuncture+agonist group compared with the acupuncture group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that lumbar degeneration was obvious in the model group but reduced in the acupuncture group and the acupuncture+agonist group. Moreover, the reduction was more obvious in the acupuncture group compared with the acupuncture+agonist group. The JAK2 and STAT3 mRNA expression as well as the p-JAK2 and p-STAT3 protein expression were elevated in the model group compared with the sham operation group (P < 0.05), were decreased in the acupuncture group compared with the model group (P < 0.05), and were increased in the acupuncture+agonist group compared with the acupuncture group (P < 0.05). To conclude, acupuncture can alleviate inflammation to exert analgesic effects in the rat model of lumbar disc herniation, and its mechanism of action may be related to the inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Key words: JAK2/STAT3 signaling pathway, acupuncture, lumbar disc herniation, pathologic pain, paw withdrawal mechanical threshold, inflammation

中图分类号:

支芳, 朱满华, 熊伟, 林星镇. 腰椎间盘突出症模型大鼠疼痛的针刺干预[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 936-941.

Zhi Fang, Zhu Manhua, Xiong Wei, Lin Xingzhen. Analgesic effect of acupuncture in a rat model of lumbar disc herniation [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(5): 936-941.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 40只大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠腰椎组织病理学比较假手术组大鼠椎间盘结构完整，纤维环整齐排列、界限清晰；模型组大鼠腰椎退行性变化明显，类软骨细胞数量增加，纤维化排列紊乱；与模型组相比，针刺组与针刺+激动剂组大鼠腰椎退行性变化、类软骨细胞数量减少，针刺组较针刺+激动剂组改善明显，见图1。

造模前，各组大鼠机械缩足阈值比较差异无显著性意义(P > 0.05)。造模3，6 d后，模型组大鼠机械缩足阈值明显下降，之后趋于稳定，并且造模后各时间点机械缩足阈值均显著低于假手术组(P < 0.05)。造模3，6 d后，针刺组大鼠机械缩足阈值明显下降，之后呈上升趋势，造模后9，12，15，18 d的机械缩足阈值均高于模型组(P < 0.05)。造模3，6 d后，针刺+激动剂组大鼠机械缩足阈值明显下降，之后呈上升趋势，造模后9，12，15，18 d的机械缩足阈值均低于针刺组(P < 0.05)。
2.4 各组大鼠血清炎症因子水平比较造模后18 d，模型组、针刺组及针刺+激动剂组大鼠血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、神经递质P物质、脑部神经肽Y水平均高于假手术组(P < 0.05)，针刺组及针刺+激动剂组大鼠血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、神经递质P物质、脑部神经肽Y水平均低于模型组(P < 0.05)，针刺+激动剂组大鼠血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、神经递质P物质、脑部神经肽Y水平均高于针刺组(P < 0.05)，见表3。

2.5 各组大鼠腰椎组织JAK2、STAT3 mRNA表达比较造模后18 d，模型组、针刺组及针刺+激动剂组JAK2、STAT3 mRNA表达均高于假手术组(P < 0.05)，针刺组及针刺+激动剂组JAK2、STAT3 mRNA表达均低于模型组(P < 0.05)，针刺+激动剂组JAK2、STAT3 mRNA表达均高于针刺组(P < 0.05)，见表4。

2.6 各组大鼠腰椎组织JAK2、STAT3、p-JAK2及p-STAT3蛋白表达比较造模后18 d，4组间JAK2、STAT3蛋白表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，模型组、针刺组及针刺+激动剂组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均高于假手术组(P < 0.05)，针刺组及针刺+激动剂组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均低于模型组(P < 0.05)，针刺+激动剂组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均高于针刺组(P < 0.05)，见图3、表5。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2021-05-12/2022-03-30在江西中医药大学基地医学研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 40只健康雄性SD大鼠，8周龄，体质量(240±20) g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。采用随机数字表法将40只大鼠分为假手术组、模型组、针刺组与针刺+激动剂组，每组10只。实验方案已通过南昌市洪都中医院伦理委员会审批(JZL-478981)。
1.3.2 试剂与仪器 JAK2、p-JAK2一抗(北京博奥森)；β-actin、STAT3、p-STAT3抗体(美国Abcam)；10%EDTA脱钙液(上海源叶生物)；白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、神经递质P物质及脑部神经肽Y ELISA试剂盒(上海酶联生物)；PVDF膜(0.45 μm，美国Bio-Rad)；BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天)；一次性无菌针灸针(0.33 mm×40 mm，苏州医疗用品厂有限公司)；JAK2激动剂香豆素A1(MedChemExpress)。
1.4 方法
1.4.1 腰椎间盘突出症大鼠模型构建取模型组、针刺组与针刺+激动剂组大鼠，采用自体髓核移植构建腰椎间盘突出症模型[10]。腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，取自体尾椎Co7-8节段髓核2 mg，切开皮肤，钝性分离L4-S2椎旁肌肉，切除右侧L5椎板、L6上关节突及L5下关节突，暴露右侧L5背根神经节及部分硬膜外腔并将尾椎髓核放置在附近，逐层缝合。术后3 d 内每日对切口进行碘伏消毒处理。术后观察各组大鼠行为变化，当右后肢出现跛行、拖曳或避免右后肢负重等行为证实造模成功。假手术组除未放置髓核外，其余步骤均同其他3组。

1.4.2 造模后干预方法针刺组、针刺+激动剂组大鼠造模后3 d开始针刺治疗。针刺+激动剂组大鼠于造模后第6，12，18天针刺治疗前，异氟烷麻醉下于L4/L5椎间隙鞘内注射5 µg/mL JAK2激动剂香豆素A1溶液(溶剂为二甲基亚砜)2 mL，针刺组同期注射等体积二甲基亚砜。
针刺干预：安静环境下，将大鼠露出四肢及右侧腰部并固定于固定器架上，待其恢复平静后，取阳陵泉、肾俞、环跳、大肠俞等穴位，体积分数75%乙醇棉球消毒，用0.30 mm×25 mm毫针直刺10-15 mm，连接电针仪，采用连续波，留针20 min，1次/d，连续治疗15 d。在针刺组和针刺+激动剂组治疗期间，假手术组、模型组做相同的固定处理，每次20 min。
1.5 主要观察指标
1.5.1 检测大鼠机械缩足阈值造模前及造模后3，6，9，12，15，18 d，将大鼠置于金属网格板上，待其安静适应环境30 min后，采用电子Von Frey测试大鼠右后足机械缩足阈值。von Frey hair呈“S”型，垂直刺激大鼠右侧掌跖部无毛处，持续作用6-8 s，大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应。刺激过程中，大鼠走动或受到刺激就抬足视为可疑阳性。阳性结果为X，阴性结果为O。为防止频繁刺激导致大鼠感觉敏化，2次测定间隔至少20 s。
1.5.2 大鼠血清炎症因子水平检测造模后18 d，腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉后，断头处死大鼠并取血6 mL，2 000 r/min离心20 min，取上清液，置于-70 ℃环境下保存。采用ELISA法检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、神经递质P物质、脑部神经肽Y水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.5.3 大鼠腰椎组织病理学形态学取大鼠L5-L6组织放入液氮中，行常规石蜡包埋及3 μm连续切片。切片烤干后行脱蜡处理，置于不同体积分数乙醇中各复水3 min。使用苏木精染色15 min后清洗3次，使用盐酸乙醇分化处理30 s，充分清洗后以1%伊红染色，使用乙醇脱水处理后脱蜡包埋，封固后置于显微镜下观察。
1.5.4 RT-PCR检测大鼠腰椎组织JAK2、STAT3 mRNA表达由TRIzol从大鼠L5-L6组织中提取总RNA。用DNase Ⅰ纯化RNA。在Quant-Studio 6 Flex 实时PCR系统上进行RT-PCR，反应条件：95 ℃10 min，预变性；95 ℃ 15 s，60 ℃退火30 s，循环40次。以β-action为内参，用2-ΔΔCt方法分析JAK2、STAT3 mRNA表达。引物序列见表1。

1.5.5 Western Blot检测大鼠腰椎组织JAK2、STAT3、p-JAK2及p-STAT3蛋白将大鼠躯干置于提前准备好的冰盒上，迅速取L5-L6段脊髓背角组织，加入预冷的RIPA裂解液，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清液，使用BCA法测定蛋白含量并配平。蛋白上样量为20 μg，进行10% SDS-PAGE电泳分离并转移到PVDF膜上，封闭，加入一抗JAK2、STAT3、p-JAK2及p-STAT3(稀释比均为1∶1 000)4 ℃过夜孵育。TBST洗膜后加入对应二抗(稀释比1∶2 000)室温下孵育2 h。洗膜后通过ECL化学发光试剂显色。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析，对符合正态分布的计量资料用x±s表示，并先进行方差齐性检验，如符合方差齐性检验，则用单因素方差分析(ANOVA)进行数据分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经南昌市洪都中医院生物统计学专家审核。

讨论

腰椎间盘突出症以腰痛和下肢放射痛为主要特征，可对人们的生活造成严重影响[11-12]，由于传统西医治疗中的保守治疗效果不够理想，而手术治疗创伤较大，因此中医治疗被广泛应用于临床[13]。针刺是一种常用的中医方法，其运用穴位经络理论对病变位置产生刺激，减轻症状[14]，但目前临床针刺对腰椎间盘突出症镇痛作用的具体机制仍未明确[6，15]。JAK2/STAT3信号通路的相关细胞因子可刺激调节人类炎症反应神经痛信号通道，并且中枢神经疾病的病理生理过程与JAK2/STAT3信号通路联系密切[16-17]。既往研究发现，JAK2/STAT3抑制剂可促进触觉性异常性疼痛的恢复[18]。此次实验采用腰椎间盘突出症大鼠模型作为研究对象，运用Western Blot、RT-PCR、ELISA等多种生物技术手段，以炎症因子、神经递质、腰椎组织蛋白及基因为着眼点，以JAK2/STAT3信号通路为基础，分析针刺对腰椎间盘突出症大鼠的治疗作用。
中医将腰椎间盘突出症归于“痹症”“腰痛”的范畴，主要是内伤外感所致，其中内伤多由于先天不足，肾亏，进而导致腰府失养[19]，外感主要是风寒湿热等导致气滞血瘀[20]。在此基础上，常采取祛风、散寒除湿、活血化瘀、滋补肝肾等治疗原则。穴位针刺治疗能够使气机和血液得到疏通，促进经脉循环恢复正常[16，21]。在治疗中，通过针刺双侧腰夹脊，能够疏通腰背部位气机，对血液流畅有促进作用[22]；针刺还可减少痛觉传导中神经递质的释放，进而使疼痛感的传递得到限制，避免疼痛扩散[23-24]。此次实验选取胆经的阳陵泉、环跳和膀胱经的大肠俞、肾俞进行针刺治疗，局部取穴肾俞、大肠俞，对穴位的刺激可活血通络、改善局部血液循环，进而减轻神经疼痛症状；阳陵泉为主治下肢经筋病症要穴，八会穴之筋会；环跳为疏通下肢少阳、太阳经气之要穴；环跳、阳陵泉配用可疏通经络[25]。研究表明，多次重复针刺可使效果累积，增加治疗次数可明显提升疗效[26]。既往研究表明，白细胞介素6可促进椎间盘细胞凋亡，在椎间盘退变过程中发挥重要作用[27-28]。肿瘤坏死因子α表达水平升高可使致痛物质分泌增多，直接刺激神经根产生疼痛，或增强神经根对缓激肽敏感性[29-30]。神经递质P物质由脊神经节合成，可随神经传导广泛散布在中枢及外周神经，同时可作为神经递质刺激巨嗜细胞、肥大细胞等释放其他致炎因子，进而诱发疼痛[31-32]。临床研究显示，当发生神经损伤后，脑部神经肽Y的表达量可显著增加，抗脑部神经肽Y治疗可有效缓解神经病理性疼痛[33]。此次实验结果显示，腰椎间盘突出症大鼠机械缩足阈值较假手术组明显降低，血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、神经递质P物质、脑部神经肽Y水平较假手术组明显升高，针刺治疗可明显提高腰椎间盘突出症大鼠机械缩足阈值，改善其血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、神经递质P物质、脑部神经肽Y水平，这提示针刺治疗可减轻炎症反应，发挥镇痛作用。JAK/STAT信号通路家族对多种疾病的发生、发展过程有重要的调控作用[34]。
JAK2/STAT3信号通路的活化可促进炎性因子的基因转录，从而调控炎性反应，而促炎因子水平的升高又可激活JAK2/STAT3信号通路，使JAK2、STAT3磷酸化，进一步加重炎症反应[35]。磷酸化的JAK2和STAT3蛋白可通过与下游靶因子结合进而发挥多种生物学效应[36]。此次实验结果显示，与假手术组相比，模型组JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达及p-JAK2、p-STAT3蛋白表达显著上升，提示自体髓核移植构建腰椎间盘突出症可激活JAK2/STAT3信号通路；而注射JAK2/STAT3信号通路激动剂会抑制针刺的镇痛效果，提示JAK2/STAT3信号通路可能介导了针刺的镇痛作用。
综上所述，针刺可通过缓解腰椎间盘突出症大鼠的炎症反应发挥镇痛作用，其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。

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