lncRNA-TNFRSF13C调控miR-1246对牙周细胞低氧诱导因子1α的作用

doi:10.12307/2025.296

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (5): 928-935.doi: 10.12307/2025.296

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lncRNA-TNFRSF13C调控miR-1246对牙周细胞低氧诱导因子1α的作用

白静1，张雪1，任燕2，李月辉3，田晓宇4

1唐山中心医院口腔科，河北省唐山市 063000；2唐山市丰润区人民医院，河北省唐山市 063000；3开滦(集团)有限责任公司唐家庄医院，河北省唐山市 063000；4遵化市人民医院，河北省遵化市 064200

收稿日期:2023-11-20 接受日期:2024-03-13 出版日期:2025-02-18 发布日期:2024-06-03
通讯作者: 张雪，副主任医师，唐山中心医院口腔科，河北省唐山市 063000
作者简介:白静，女，1984年生，河北省遵化市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事口腔牙周方面的研究。
基金资助:
河北省医学科学基金资助项目(20230240)

Effect of lncRNA-TNFRSF13C on hypoxia-inducible factor 1alpha in periodontal cells by modulation of #br# miR-1246 #br#

Bai Jing1, Zhang Xue1, Ren Yan2, Li Yuehui3, Tian Xiaoyu4

1Department of Stomatology, Tangshan Central Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 2Tangshan Fengrun District People’s Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 3Kailuan (Group) Co., Ltd. Tangjiazhuang Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 4Zunhua People’s Hospital, Zunhua 064200, Hebei Province, China

Received:2023-11-20 Accepted:2024-03-13 Online:2025-02-18 Published:2024-06-03
Contact: Zhang Xue, Associate chief physician, Department of Stomatology, Tangshan Central Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China
About author:Bai Jing, Master, Attending physician, Department of Stomatology, Tangshan Central Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China
Supported by:
Hebei Provincial Medical Science Foundation, No. 20230240

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
人牙周膜细胞：是存在于人牙周膜组织中的一种细胞类型。牙周膜是牙齿根部周围的软组织，包括牙槽骨、牙槽黏膜、牙齿周围的纤维连结组织以及血管、神经等。人牙周膜细胞参与牙周膜组织的形成和修复过程，当发生创伤或疾病导致牙周膜受损时，牙周膜细胞能够分化为不同类型的细胞，合成胶原蛋白、弹性纤维等，促进牙周膜组织的重建。
miRNA：是一类小分子非编码RNA分子，通常由20-22个核苷酸组成。它们广泛存在于真核生物的细胞内，并参与调节基因表达的过程。miRNA通过与靶基因的mRNA序列互补配对，可以在转录后水平对mRNA进行降解或抑制翻译，从而调控目标基因的表达。miRNA通过这种方式，参与调节多种生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、免疫应答等。

背景：LncRNA-TNFRSF13C是B细胞发育和功能中的一个重要因子，在牙周炎患者牙周组织中高表达，但具体机制还不清楚。
目的：探讨lncRNA-TNFRSF13C调控miR-1246对牙周细胞低氧诱导因子1α的作用机制。
方法：人牙周膜细胞经过脂多糖处理后分为7组：A组(无转染的人牙周膜细胞株)、B组(人牙周膜细胞株转染TNFRSF13C NC-siRNA)、C组(人牙周膜细胞株转染TNFRSF13C-siRNA)、D组(人牙周膜细胞株转染miR-1246 mimics)、E组(人牙周膜细胞株转染miR-1246 siRNA)、F组(人牙周膜细胞株转染TNFRSF13C-siRNA+miR-1246 mimics)及G组(人牙周膜细胞株转染TNFRSF13C-siRNA+miR-1246 siRNA)。采用qRT-PCR检测各组细胞lncRNA-TNFRSF13C、miR-1246相对表达；CCK-8检测细胞活性；流式细胞仪检测细胞凋亡率；免疫印迹检测细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白的表达；Pearson分析lncRNA-TNFRSF13C与miR-1246相关性，双荧光素酶分析靶向关系。
结果与结论：①A、B两组人牙周膜细胞活性、凋亡率及蛋白指标比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，与B组相比，C组细胞活性升高、凋亡率及低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白降低(P < 0.05)，与C组相比，D组细胞活性降低，凋亡率及低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白均升高(P < 0.05)，D组相比，E组细胞活性升高(P < 0.05)，F组细胞活性低于E组，E、F组细胞凋亡率降低(P < 0.05)，与F组相比，G组细胞活性升高、凋亡率及低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白降低(P < 0.05)。②lncRNA-TNFRSF13C与miR-1246呈现正相关(P < 0.05)。③TNFRSF13C-siRNA组与TNFRSF13C-NC组在miR-1246-wt荧光活性降低(P < 0.05)；与miR-1246-NC组相比，miR-1246 mimics组低氧诱导因子1α-wt、血管内皮生长因子-wt荧光活性升高(P < 0.05)。④结果说明，下调lncRNA-TNFRSF13C对脂多糖处理的牙周细胞具有促进活性、降低凋亡的作用，同时也可抑制低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子的表达，其机制与调控miR-1246活性相关。

https://orcid.org/0009-0007-7331-3824(白静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 牙周炎, 牙周膜细胞, 脂多糖, 炎症, miR-1246, lncRNA-TNFRSF13C

Abstract: BACKGROUND: LncRNA-TNFRSF13C, an important factor in B cell development and function, is expressed in periodontal tissues of patients with periodontitis, but the specific mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of lncRNA-TNFRSF13C regulating miR-1246 on hypoxia-inducible factor 1α in periodontal cells.
METHODS: Human periodontal ligament cells (hPDLCs) were treated with lipopolysaccharide and divided into group A (hPDLCs cell lines without transfection), group B (hPDLCs cell lines transfected with TNFRSF13C NC-siRNA), group C (hPDLCs cell lines transfected with TNFRSF13C-siRNA), group D (hPDLCs cell line transfected with miR-1246 mimics), group E (hPDLCs cell line transfected with miR-1246 siRNA), group F (hPDLCs cell line transfected with TNFRSF13C-siRNA+miR-1246 mimics), and group G (hPDLCs cell line transfected with TNFRSF13C-siRNA+miR-1246 siRNA). The relative expression of lncRNA-TNFRSF13C and miR-1246 in each group was detected by qRT-PCR. Cell counting kit-8 assay was used to detect cell viability. Apoptosis was detected by flow cytometry. Expression of hypoxia-inducible factor 1α and vascular endothelial growth factor proteins was detected by western blot. The correlation between lncRNA-TNFRSF13C and miR-1246 was analyzed by Pearson, and the targeting relationship was analyzed by dual-luciferase reporter assay.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no significant difference in human periodontal ligament cell activity, apoptosis rate and protein indexes between groups A and B (P >0.05). Compared with group B, hPDLCS cell activity in group C was increased, and apoptosis rate and the expression of hypoxia-inducible factor 1α and vascular endothelial growth factor proteins were decreased (P < 0.05). Compared with group C, hPDLCS cell activity in group D was decreased, and apoptosis rate and the expression of hypoxia-inducible factor 1α and vascular endothelial growth factor proteins were increased (P < 0.05). Compared with group D, the cell activity of group E was increased (P < 0.05). The cell activity in group F was lower than that in group E, and the apoptosis rate was reduced in both groups E and F (P < 0.05). Compared with group F, the cell activity of group G was increased, and the apoptosis rate and the expression of hypoxia-inducible factor 1α and vascular endothelial growth factor were decreased (P < 0.05). LncRNA-TNFRSF13C was positively correlated with miR-1246 (P < 0.05). Compared with the TNFRSF13C-siRNA group, the fluorescence activity of miR-1246-wt in the TNFRSF13C-NC group was reduced (P > 0.05); compared with the miR-1246-NC group, the fluorescence activities of hypoxia-inducible factor 1α-wt and vascular endothelial growth factor-wt in the miR-1246 mimics group were increased (P < 0.05). To conclude, down-regulation of lncRNA-TNFRSF13C can promote the activity of periodontal cells treated with lipopolysaccharide, reduce apoptosis, and inhibit hypoxia-inducible factor 1α and vascular endothelial growth factor. The mechanism is related to the regulation of miR-1246 activity.

Key words: periodontitis, periodontal ligament cell, lipopolysaccharide, inflammation, miR-1246, lncRNA-TNFRSF13C

中图分类号:

白静, 张雪, 任燕, 李月辉, 田晓宇. lncRNA-TNFRSF13C调控miR-1246对牙周细胞低氧诱导因子1α的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 928-935.

Bai Jing, Zhang Xue, Ren Yan, Li Yuehui, Tian Xiaoyu. Effect of lncRNA-TNFRSF13C on hypoxia-inducible factor 1alpha in periodontal cells by modulation of #br# miR-1246 #br#[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(5): 928-935.

图/表（结果） 10

2.1 各组细胞LncRNA TNFRSF13C相对表达量比较 A组、B组细胞中LncRNA TNFRSF13C相对表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；与B组相比，C组细胞的LncRNA TNFRSF13C表达降低(P < 0.05)；与C组相比，D组、E组、F组细胞的LncRNA TNFRSF13C表达均升高(P < 0.05)；与F组相比，G组细胞的LncRNA TNFRSF13C表达降低(P < 0.05)，见图1。
2.2 各组人牙周膜细胞活性吸光度值比较与A组相比，B组24，48，72及96 h的人牙周膜细胞活性比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；与B组相比，C组各时间点的细胞活性升高(P < 0.05)；与C组相比，D组各时间点的细胞活性降低(P < 0.05)；D组相比，E组细胞活性升高(P < 0.05)；与E组相比，F组细胞活性降低(P < 0.05)；与F组相比，G组细胞活性升高(P < 0.05)，见表2。

2.3 各组细胞凋亡率比较与A组相比，B组细胞凋亡率差异无显著性意义(P > 0.05)；与B组相比，C组细胞凋亡率降低(P < 0.05)；与C组相比，D组细胞凋亡率升高(P < 0.05)；与D组相比，E组细胞凋亡率降低(P < 0.05)；E组与F组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；与F组相比，G组细胞凋亡率降低(P < 0.05)，见表3，图2。
2.4 各组细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白表达的比较与A组相比，B组细胞低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白表达差异无显著性意义(P > 0.05)；与B组相比，C组低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白表达降低(P < 0.05)；与C组相比，D组低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白表达升高(P < 0.05)，与D组相比，E组细胞低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白表达降低(P < 0.05)；E组与F组比较差异无显著性意义
(P > 0.05)；与F组相比，G组低氧诱导因子1α、血管内

2.5 各组细胞中miR-1246相对表达量比较 A组、B组细胞中miR-1246相对表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；与B组相比，C组miR-1246表达量降低(P < 0.05)；与C组相比，D组miR-1246表达升高(P < 0.05)；与D组相比，E组、F组miR-1246表达均降低(P < 0.05)；与F组相比，G组miR-1246表达表达更低(P < 0.05)，见图4。
2.6 TNFRSF13C与miR-1246相关性分析在脂多糖处理的人牙周膜细胞中TNFRSF13C与miR-1246呈现正相关性(r=0.829，P < 0.001)，见图5。
2.7 双荧光素酶实验结果
2.7.1 TNFRSF13C与miR-1246 TNFRSF13C-siRNA组与TNFRSF13C-NC组在miR-1246-mut荧光活性比较差异无显著性(P > 0.05)，miR-1246-wt荧光活性降低(P < 0.05)，见图6。

2.7.2 miR-1246与低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子 miR-1246 mimics组与miR-1246-NC组在低氧诱导因子1α-mut、血管内皮生长因子-mut荧光活性比较无差异(P > 0.05)，与miR-1246-NC组相比，miR-1246 mimics组低氧诱导因子1α-wt、血管内皮生长因子-wt荧光活性升高(P < 0.05)，见图7。

参考文献

[1] KWON T, LAMSTER IB, LEVIN L. Current Concepts in the Management of Periodontitis. Int Dent J. 2021;71(6):462-476.
[2] 单超,吴泽钰,赵今. 慢性牙周炎低氧环境对微血管及骨代谢与骨修复的作用[J].中国组织工程研究,2023,27(32):5232-5237.
[3] 萧智利. 低氧诱导HIF1α抑制hPDLCs生物学活性及牙周炎组织中差异表达LncRNA的筛选[D].重庆:重庆医科大学,2019.
[4] NAKAMURA T, YAMASHITA M, IKEGAMI K, et al. Autophagy facilitates type I collagen synthesis in periodontal ligament cells. Sci Rep. 2021; 11(1):1291.
[5] QI X, BIE M, JIANG R, et al. HIF-1α regulates osteoclastogenesis and alveolar bone resorption in periodontitis via ANGPTL4. Arch Oral Biol. 2023;153:105736.
[6] YANG J, ZHOU Z, WU Y, et al. Study on the mechanism of curcumin in the treatment of periodontitis through network pharmacology and mole-cular docking. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2023;41(2):157-164.
[7] 李隽,尹霜霜,谭为聪,等.牙种植体周围黏膜炎龈沟液中低氧诱导因子-1α、基质金属蛋白酶-2的水平及意义[J].安徽医药, 2021,25(10):2027-2031.
[8] XIA Y, CHENG T, ZHANG C, et al. Human bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles restore Th17/Treg homeostasis in periodontitis via miR-1246. FASEB J. 2023;37(11):e23226.
[9] 姚伟莉,袁静,耿彪,等.慢性牙周炎患者唾液中miR-1246的表达及其临床意义[J].现代检验医学杂志,2021,36(1):65-67.
[10] 巫晶晶.TNF家族免疫相关基因多态性与高危人群HCV易感性及慢性化的关联研究[D].南京:南京医科大学,2020.
[11] 赖文.lncRNA-TNFRSF13C对B细胞功能的调节作用和机制初探[D].天津:天津医科大学,2020.
[12] LI JS, XIE YF, SONG LT, et al. [Expression profile of long non-coding RNA in gingival tissues from the patients with aggressive periodontitis]. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2018;53(9):635-639.
[13] KAWAMURA M, YAMAMOTO T, YAMASHIRO K, et al.Induction of migration of periodontal ligament cells by selective regulation of integrin subunits. J Cell Mol Med. 2019;23(2):1211-1223.
[14] GRZECZKA A, LECH M, WOZNIAK G, et al. Periodontitis Disease in Farmed Ruminants-Current State of Research. Int J Mol Sci. 2023; 24(11):9763.
[15] LI Z, FU R, WEN X, et al. Network analysis reveals miRNA crosstalk between periodontitis and oral squamous cell carcinoma. BMC Oral Health. 2023;23(1):19.
[16] ZHU ZX, LIU Y, WANG J, et al.A novel lncRNA-mediated epigenetic regulatory mechanism in periodontitis. Int J Biol Sci. 2023;19(16): 5187-5203.
[17] TAN YT, LIN JF, LI T, et al.LncRNA-mediated posttranslational modifications and reprogramming of energy metabolism in cancer. Cancer Commun (Lond).2021;41(2):109-120.
[18] 李佳珊,谢玉锋,宋立婷,等. 长链非编码RNA在侵袭性牙周炎患者牙龈组织中的表达谱分析[J]. 中华口腔医学杂志,2018,53(9): 635-639.
[19] QIN H, ZHANG H, LI H, et al.Prognostic risk analysis related to radioresistance genes in colorectal cancer. Front Oncol. 2023;12: 1100481.
[20] HUANG W, SU D, LIAO X, et al.Prognostic costimulatory molecule-related signature risk model correlates with immunotherapy response in colon cancer. Sci Rep. 2023;13(1):789.
[21] PENG W, LI J, CHEN R, et al.Upregulated METTL3 promotes metastasis of colorectal Cancer via miR-1246/SPRED2/MAPK signaling pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):393.
[22] WU S, LI Z, WANG J, et al.Correlation Analysis of miR-1246 Expression in Saliva of Patients with Chronic Periodontitis and Periodontal Indexes, Inflammatory Cytokines, and Protease Molecules. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:1949159.
[23] 陈刚,莫丽飞,张晓静. 正畸牙周联合治疗对伴错合畸形牙周炎患者牙周致病菌及牙周组织炎症因子表达的影响[J]. 河北医学, 2023,29(1):131-136.
[24] ARCE M, RODRIGUEZ-PEÑA M, ESPINOZA-ARRUE J, et al.Increased STAT3 Activation in Periodontitis Drives Inflammatory Bone Loss. J Dent Res. 2023;102(12):1366-1375.
[25] GUGNANI S, GUGNANI N. Is there any link between periodontitis and inflammatory bowel diseases? Evid Based Dent. 2023;24(3):127-129.
[26] KAJIHARA R, SAKAI H, HAN Y, et al.Presence of periodontitis may synergistically contribute to cancer progression via Treg and IL-6. Sci Rep. 2022;12(1):11584.
[27] MLACHKOVA A, POPOVA C, DOSEVA V. Presence of IL-8 Gene Polymorphism and IL-8 Serum Levels in Patients with Chronic Periodontitis - Literature Review. Folia Med (Plovdiv). 2020;62(2): 253-257.
[28] PLEMMENOS G, EVANGELIOU E, POLIZOGOPOULOS N, et al.Central Regulatory Role of Cytokines in Periodontitis and Targeting Options. Curr Med Chem. 2021;28(15):3032-3058.
[29] 王祥璞. LncRNA-TNFRSF13C在侵袭性牙周炎中的作用及调控机制的初步研究[D]. 天津:天津医科大学, 2020.
[30] 王明,夏彦民,王文辰,等. miR-1246通过靶向GSK3β促进食管癌转移的机制[J]. 现代肿瘤医学,2017,25(9):1369-1374.
[31] 吴智娇. 粪便miR-148a-3p和miR-1246在炎症性肠病中的诊断价值[D].南京:南京大学, 2017.
[32] WU DP, ZHANG JL, WANG JY, et al.MiR-1246 Promotes LPS-Induced Inflammatory Injury in Chondrogenic Cells ATDC5 by Targeting HNF4γ.Cell Physiol Biochem. 2017;43(5):2010-2021.
[33] JINDAROJANAKUL P, KOBAYASHI Y, KAMIMOTO H, et al.Changes in superoxide dismutase 3 (SOD3) expression in periodontal tissue during orthodontic tooth movement of rat molars and the effect of SOD3 on in vitro hypoxia-exposed rat periodontal ligament cells. Eur J Orthod. 2023;45(4):430-437.
[34] DUAN Y, JIN C, WU Y, et al.CREB1 alleviates the apoptosis and potentiates the osteogenic differentiation of zoledronic acid-treated human periodontal ligament stem cells via up-regulating VEGF. Tissue Cell. 2023;85:102223.
[35] VASCONCELOS RC, COSTA ADE L, FREITAS RDE A, et al. Immunoexpression of HIF-1α and VEGF in Periodontal Disease and Healthy Gingival Tissues. Braz Dent J. 2016;27(2):117-122.
[36] 徐倩. 低氧通过HIF-1α/VEGF上调牙周膜干细胞RUNX2表达[D]. 重庆:中国人民解放军陆军军医大学,2017.
[37] 秦秋月. 缺氧模拟自组装纳米粒子调节巨噬细胞极化治疗牙周炎的研究[D].长春:吉林大学,2023.
[38] AFACAN B, ÖZTÜRK VÖ, PAŞALı Ç, et al.Gingival crevicular fluid and salivary HIF-1α, VEGF, and TNF-α levels in periodontal health and disease. J Periodontol. 2019;90(7):788-797.
[39] 陈慧. 乏氧诱导因子在正常与牙周炎牙龈组织中的表达差异研究[D]. 济南:山东大学,2010.
[40] BAI Y, WANG W, ZHANG Y, et al.lncRNA MIAT suppression alleviates corneal angiogenesis through regulating miR-1246/ACE. Cell Cycle. 2019;18(6-7):661-669.

引言

牙周炎是临床常见口腔感染疾病，是由革兰阴性菌形成的牙菌斑累及，激活宿主细胞而引起炎症细胞因子的释放，而引起局部组织微循环障碍[1-2]。患者会出现牙龈出血、牙齿松动、牙龈萎缩等，严重影响患者身体健康[3-4]。氧气在正常组织功能发育及内环境动态平衡中必不可少。有研究发现，在牙周炎患者牙周组织中氧含量明显降低[5]。低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是一种异二聚体复合物，主要由低氧诱导因子α和低氧诱导因子β组成，而低氧诱导因子α在调节氧稳态过程中具有重要作用[6]。在牙周炎患者牙周膜中低氧诱导因子α表达显著升高，可促使破骨细胞及炎性细胞聚集在牙周组织，是导致牙周疾病的因素之一[7]。
随着分子生物学的发展，发现miRNA参与了牙周炎的发生发展，miR-1246是被p53调控的新型微小RNA，可通过调控细胞活性而参与多种生理疾病的形成[8]。
miR-1246在慢性牙周炎患者中具有促进炎症反应的作用[9]。因此，miR-1246可能成为一种有前途的牙周炎诊断生物标志物和治疗靶点。肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)与一种长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)中的内含子区域重叠，即形成lncRNA-TNFRSF13C[10]。lncRNA- TNFRSF13C是B细胞发育和功能中的一个重要因子，并且与炎症反应有关。B淋巴细胞刺激因子受体由TNFRSF13C基因编码，是B细胞增殖和分化的主要膜蛋白受体之一，属于TNF受体超家族。在炎症过程中，当B细胞受到刺激并活化时，lncRNA-TNFRSF13C的表达水平会上调，高水平的lncRNA-TNFRSF13C能够增强B细胞的活化和促炎细胞因子的释放，从而加剧炎症反应[11]。研究表明，lncRNA-TNFRSF13C在牙周炎患者牙周组织中表达显著升高，并可通过激活炎症因子而参与疾病进展[12]。此项研究通过探讨lncRNA-TNFRSF13C调控miR-1246对牙周细胞低氧诱导因子1α的影响，为深入了解牙周炎的发生和发展提供了新的视角。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，行独立t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析及Pearson分析相关性。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2023年7月在唐山医学生物学研究所完成。
1.3 材料细胞、主要试剂及仪器：TNFRSF13C及miR-1246引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。人牙周膜细胞(上海诺辰生物技术有限公司)；LncRNA TNFRSF13C、miR-1246(上海吉凯制药有限公司)；Lipofectamine2000转染试剂(赛默飞公司，货号：11668)；DMEM培养基(美国HyClone公司，货号：SH30243.01)；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Corning，货号35-015-CV、25-053-Cl)；鼠抗人低氧诱导因子1α抗体(北京百奥莱博公司，货号：YT788)；血管内皮生长因子单克隆抗体(美国Biovision公司，货号：5363-100)；山羊抗兔IgG(美国Biovision公司，货号：6925-100)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(西安百萤生物科技有限公司，货号：35002)；流式细胞仪(广州誉维生物科技仪器有限公司，货号：130-096-116)；DYCZ-24DN蛋白电泳仪(北京六一仪器厂)；MA-6000实时荧光定量PCR仪器(中山大学达安基因股份有限公司)。

.4.5 CCK8检测各组人牙周膜细胞存活率人牙周膜细胞移入孔6板中，细胞浓度为2.5×107 L-1，每孔加2 mL培养液，加入5 mg/mL的CCK-8溶液10 μL，共同培养24，48，72及96 h吸去原培养液，每孔中加入50 μL二甲基亚砜，摇匀后放入490 nm波长下检测吸光度值，取3次平均值。
1.4.6 Annexin V-FITC /PI双染色法检测细胞凋亡水平将细胞浓度为2×108 L-1的细胞悬液接种于96孔板中，每孔接种100 μL。当细胞增殖到铺满底面积70%时，采用0.25%蛋白酶消化处理贴壁细胞。PBS洗涤样品管细胞，放入离心机中3 500 r/min离心5-10 min，收集悬液细胞，重新加入300 μL的1×Binding Buffer于样品管中使细胞悬浮，同时加入Annexin V-FITC 5 μL混匀，染色Annexin V-FITC并标记，最后加入5 μL 的PI于样本中，5 min后采用流式细胞仪检测。
1.4.7 免疫印迹检测各组细胞低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白表达将细胞以2.5×107 L-1的细胞浓度放入离心管中，添加1.5 mL蛋白裂解液裂解细胞10 min，12 000 r/min离心，离心20 min，60 s后提取上清液，每个样本取25 μL检测蛋白浓度。按照样本制备溶液，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶，计算初含50 μg的蛋白所需的液体进行上样，开始电泳。当Marker蛋白置于玻璃板底部时则停止跑胶。后继续转膜，PVDF膜从转膜槽中取出采用TBST漂洗5 min，加入稀释为1∶100的抗低氧诱导因子1α及抗血管内皮生长因子的一抗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，孵育时间为2 h。避光环境下将显影液加入PVDF膜，60 s，采用Image-lab图像分析系统进行成像和分析。
1.4.8 双荧光素酶报告基因检测从细胞中扩增出TNFRSF13C cDNA并插入质粒。同时，将突变体miR-1246结合序列引入构建突变质粒。将细胞接种到48孔中孵育24 h，然后转染miR-1246-wt或miR-1246-mut质粒联合TNFRSF13C siRNA，TNFRSF13C-NC，使用Lipofectamine 2000转染48 h后。3端非翻译区(UTR)片段的miR-1246功能分析包括预测的miR-1246结合位点、进行PCR扩增、将PCR产物纯化并插入pGL3控制荧光素酶载体(PromegaCorp.)的终止密码子下游XbaI-FseI位点形成PGL3-HIF-1α/VEGF。用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene)制备了miR-1246种子区的pGL3-HIF-1α/VEGF。pGL3-HIF-1α/VEGF、肾素荧光素酶质粒、并使用脂质体2000(Invitrogen)进行48 h转染细胞。相对荧光素酶用双荧光素酶报告基因检测系统测定活性。
1.5 主要观察指标 ①各组细胞LncRNA TNFRSF13C的表达；②人牙周膜细胞活性和凋亡率；③细胞炎症因子水平；④细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白的表达；⑤细胞中miR-1246的表达；⑥细胞中TNFRSF13C与miR-1246相关性分析；⑦双荧光素酶报告基因检测结果。
1.6 统计学分析通过SPSS 26.0软件进行结果整理分析，均符合正态分布，计量资料用x±s表示，行独立t检验，多组间采用单因素方差分析，多时间点采用重复测量方差分析，并进行Pearson分析相关性，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

牙周膜细胞是牙周基质主要的细胞类型之一，能够分泌和调节胶原纤维、弹性纤维、基质蛋白等组成牙周基质的分子，维持牙周组织的稳定和修复[13]。牙周炎发生过程中长期的炎症反应会对牙周膜细胞造成损伤，导致牙周组织的破坏和失去维持健康状态的功能[14]。因此，了解牙周膜细胞炎症发生机制及靶向治疗对于控制疾病具有重要意义。
近些年，随着基因生物学的发展，发现LncRNA及miRNA几乎参与了细胞所有的生命活动，与多种疾病过程密切相关[15-16]。此项研究旨在探讨lncRNA-TNFRSF13C调控miR-1246在牙周疾病发生和发展中的作用及其机制，为相关研究提供参考依据。
此次研究结果显示，抑制LncRNA TNFRSF13C或miR-1246均可促进脂多糖干预的牙周膜细胞活性，且联合抑制LncRNA TNFRSF13C及miR-1246的效果更佳，证实了两者对牙周膜细胞活性的调控作用。LncRNA一直是基因生物学领域的研究热点，可参与免疫调控、细胞凋亡等多种生理病理过程[17]。有学者通过对比健康人群及牙周炎患者牙龈组织中LncRNA的差异，发现LncRNA TNFRSF13C在牙龈组织中表达上调，认为在牙周炎疾病过程中可发挥重要作用[18]。
B淋巴细胞刺激因子受体BAFFR，又可称TNFRSF13C，由TNFRSF13C基因编码，是B细胞增殖和分化的主要膜蛋白受体之一。BAFFR只有一个配体，即BAFF有促进B细胞存活，不依赖T细胞的异形转换及浆细胞存活的作用。BAFF过表达可引起B细胞扩增而参与免疫性疾病的炎症反应[19-20]。此项研究作者认为抑制LncRNA TNFRSF13C表达后而减少细胞凋亡，提高活性。miR-1246是人类常见的miRNA，已经被证实参与了癌细胞生物活性过程[21]。在脂多糖损伤牙周膜细胞中miR-1246表达升高，通过调控细胞凋亡相关因子而参与细胞凋亡，抑制其表达后可减少炎症因子表达，并能通过上调抗Bcl-2抑制Bax表达而减少牙周膜细胞凋亡[22]。
作者认为在炎症损伤的牙周膜细胞中，抑制TNFRSF13C及miR-1246表达可促进细胞活性，抑制凋亡。作为亮氨酸拉链家族成员之一的Jun是一种转录调控因子，与c-Fos共同组成二价转录因子激活蛋白1参与转录调控，进而调节基质金属蛋白酶3的表达，加重牙周细胞应激反应及炎症反应，进一步促进凋亡[23-25]。另有研究表明，TNFRSF13C能够调控Jun/基质金属蛋白酶3相关信号通路促进炎症反应，进而加快牙周膜细胞凋亡[26-29]。
miR-1246在多种疾病中扮演重要角色，包括肿瘤和炎症性疾病[30-31]。miR-1246通过抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达和促进核因子κB信号通路的活化，参与了调控炎症损伤牙周膜细胞凋亡的过程[32]。然而，对于miR-1246在牙周炎中具体作用的详细机制还需要进一步研究。
此项研究表明，在脂多糖处理的牙周膜细胞中LncRNA TNFRSF13C与miR-1246表达呈现正相关性。同时表明抑制LncRNA TNFRSF13C或miR-1246均可降低脂多糖干预的牙周膜细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白表达，且联合抑制LncRNA TNFRSF13C及miR-1246的效果更佳。
牙周炎的主要病理生理变化是牙周组织缺氧和炎症反应[2]。低氧诱导因子1α是一种转录因子，可以调控多种基因的表达，包括血管内皮生长因子等[33-34]。
在牙周炎病变过程中，缺氧状态会引起细胞内低氧诱导因子1α水平的升高，从而促进血管内皮生长因子的表达[35-37]。在牙周炎患者的龈沟液和血清中，低氧诱导因子1α和血管内皮生长因子的水平都明显升高，说明它们与牙周炎的病情严重程度密切相关[38-39]。因此，抑制低氧诱导因子1α和血管内皮生长因子的水平对于改善牙周炎疾病具有重要意义。而此次研究显示下调
LncRNA TNFRSF13C具有抑制炎症反应的作用，推测降低LncRNA TNFRSF13C表达可减少牙周膜细胞中炎症反应，一定程度抑制低氧诱导因子1α和血管内皮生长因子表达，但是具体机制还需要进一步验证。在角膜新生血管形成大鼠中，血管内皮生长因子刺激可显著促进人脐静脉内皮细胞活性，而miR-1246抑制剂共转染细胞可明显消除血管内皮生长因子的作用，认为二者存在一定关联[40]。此项研究显示在脂多糖处理的牙周膜细胞中抑制LncRNA TNFRSF13C及miR-1246表达后可显著降低低氧诱导因子1α和血管内皮生长因子表达，其机制可能与LncRNA TNFRSF13C对miR-1246的调节作用相关。荧光素酶实验证实，与TNFRSF13C-NC组相比，TNFRSF13C- siRNA组miR-1246-wt荧光活性降低，同时miR-1246 mimics组低氧诱导因子1α-wt、血管内皮生长因子-wt荧光活性升高，证实了TNFRSF13C与miR-1246靶向关系及miR-1246对低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子-的靶向关系。
结论：lncRNA-TNFRSF13C在牙周细胞中具有重要的调节作用。通过下调lncRNA-TNFRSF13C的表达，能够观察到牙周细胞的促活性效应，这可能是通过增加细胞增殖和减少凋亡来实现的。同时，下调lncRNA-TNFRSF13C可以调节miR-1246的活性，从而影响牙周细胞的炎症反应；另外，抑制miR-1246对低氧诱导因子1α和血管内皮生长因子的表达也产生影响，可能通过调节低氧诱导因子1α和血管内皮生长因子的信号通路来缓解牙周细胞的炎症反应。这些发现为进一步研究lncRNA-TNFRSF13C在牙周疾病治疗中的潜在作用提供了重要的理论依据，并为寻找新的治疗策略提供了新的方向。但此项研究也存在一定不足之处，尽管通过分子生物学实验得到了lncRNA- TNFRSF13C与miR-1246、低氧诱导因子1α的相互作用关系，但没有进行具体的功能验证实验来证明这种相互作用对牙周细胞的抗炎作用具有重要意义，因此，需要进行更多的实验来验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

lncRNA-TNFRSF13C调控miR-1246对牙周细胞低氧诱导因子1α的作用

Effect of lncRNA-TNFRSF13C on hypoxia-inducible factor 1alpha in periodontal cells by modulation of #br# miR-1246 #br#

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[1]	张艺博, 卢健棋, 毛美玲, 庞延, 董礼, 杨尚冰, 肖湘. 类风湿关节炎与冠状动脉粥样硬化的因果关系：GWAS数据库血清代谢物和炎症因子数据[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(在线): 1-9.
[2]	余帅, 刘家伟, 朱彬, 潘檀, 李兴龙, 孙广峰, 于海洋, 丁亚, 王宏亮. 小分子药物治疗骨关节炎的热点问题及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1913-1922.
[3]	李开颖, 魏晓歌, 宋斐, 杨楠, 赵振宁, 王燕, 穆静, 马惠昇. 理筋手法调控兔骨骼肌损伤修复中瘢痕形成的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1600-1608.
[4]	王文涛, 侯振扬, 王熠军, 徐耀增. Apelin-13抑制巨噬细胞M1极化缓解全身炎症性骨丢失[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1548-1555.
[5]	陈帅, 金杰, 韩化伟, 田宁晟, 李志伟. 两样本孟德尔随机化分析循环炎症细胞因子与骨密度的因果关联[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1556-1564.
[6]	艾克帕尔·艾尔肯, 陈晓涛, 吾凡别克·巴合提. 成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体促进炎症微环境下人牙周膜干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1388-1394.
[7]	迟文鑫, 张存鑫, 高凯, 吕超亮, 张科峰. 川陈皮素抑制BV2小胶质细胞炎症反应的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1321-1327.
[8]	喻婷, 吕冬梅, 邓浩, 孙涛, 程钎. 淫羊藿苷预处理增强人牙周膜干细胞对M1型巨噬细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1328-1335.
[9]	姬慧慧, 蒋旭, 张志敏, 邢运虹, 王亮亮, 李娜, 宋雨庭, 罗旭光, 崔慧林, 曹锡梅. SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1220-1229.
[10]	何波, 陈文, 马岁录, 何志军, 宋渊, 李金鹏, 刘涛, 魏晓涛, 王威威, 谢婧. 皮瓣缺血再灌注损伤的发病机制及治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1230-1238.
[11]	支芳, 朱满华, 熊伟, 林星镇. 腰椎间盘突出症模型大鼠疼痛的针刺干预[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 936-941.
[12]	王荣荣, 黄玉珊, 李湘淼, 白金柱. 创伤性脊髓损伤急性期前列腺素E1对血管相关因子的调节和微循环功能的保护[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 958-967.
[13]	王瑜茹, 李思源, 徐烨, 张雨蒙, 刘杨, 郝慧琴. 汉黄芩素对胶原诱导性关节炎大鼠关节炎症影响的内质网应激途径[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 1026-1035.
[14]	赵增波, 李晨曦, 窦晨雷, 马娜, 周冠军. 壳聚糖/甘油磷酸钠/海藻酸钠/益母草碱水凝胶的抗炎与促成骨作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 678-685.
[15]	于辉, 杨阳, 韦婷, 李文丽, 罗文倩, 刘彬. Gadd45b调控星形胶质细胞表型减轻慢性缺血性大鼠脑白质损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7797-7803.