人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料修复桡骨火器性骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (47): 7561-7566.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.004

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人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料修复桡骨火器性骨缺损

王建忠¹，李兵仓²，任宝¹，高飞¹，李聪杰¹，刘伟¹，王晓冬¹，雷鸣¹，高文山¹

1河北大学附属医院，河北省保定市 071000；2解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室，创伤烧伤复合伤国家重点实验室，重庆市 400042

收稿日期:2015-10-21 出版日期:2015-11-19 发布日期:2015-11-19
通讯作者: 李兵仓，解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室，创伤烧伤复合伤国家重点实验室，重庆市400042
作者简介:王建忠，男，1968年生，河北省蠡县人，博士，副主任医师。
基金资助:
全军医学科学技术研究“十五”指令性课题(01L060)；河北省科学技术研究与发展计划项目(072761417)

Human vascular endothelial growth factor 121 gene-modified materials repair firearm-induced radial defects

Wang Jian-zhong¹, Li Bing-cang², Ren Bao¹, Gao Fei¹, Li Cong-jie¹, Liu Wei¹, Wang Xiao-dong¹, Lei Ming¹, Gao Wen-shan¹

1Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China; 2the Sixth Laboratory, Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University of PLA, National Key Laboratory of Wound, Burn Injury and Complex Wounds, Chongqing 400042, China

Received:2015-10-21 Online:2015-11-19 Published:2015-11-19
Contact: Li Bing-cang, the Sixth Laboratory, Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University of PLA, National Key Laboratory of Wound, Burn Injury and Complex Wounds, Chongqing 400042, China
About author:Wang Jian-zhong, M.D., Associate chief physician, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
Supported by:
the Mandatory Subjects of Army Medical Science and Technology Research during the Tenth Five-Year Period, No. 01L060; Science and Technology Research Development Program of Hebei Province of China, No. 072761417

摘要/Abstract

摘要：

BACKGROUND: Bone defects are the leading cause of nonunion after firearm injury. Firearm injury is relatively special. Autograft and allograft all have big drawbacks, which cannot meet the requirements of basic-level hospitals. Using tissue-engineered bone with good blood vessels and osteogenic capability in repair of firearm bone defect will be an ideal and feasible restoration method.

OBJECTIVE: To explore the application of human vascular endothelial growth factor 121 gene-modified materials in the repair of firearm-induced radial injury in rabbits.

METHODS: A total of 128 rabbits were randomly divided into surgical injury group and firearm injury group (n=64 per group). In the firearm injury group, 0.25 g steel ball was launched using 56-style musket to establish a firearm radial injury model; in the surgical injury group, surgical methods were used to produce a 1.2 cm radial injury model. Human vascular endothelial growth factor 121 gene-modified materials were used. The related histocytes from rabbits were harvested to obtain bone marrow stromal cells for culture. A porous scaffold material was prepared. The obtained materials were respectively implanted into radial defect sites in the surgical injury and firearm injury groups. The application of human vascular endothelial growth factor 121 gene-modified materials in rabbit radial defect repair was analyzed.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the surgical injury group, at 8, 12 and 16 weeks after repair, the gray level ratio of bone defect site and the anti-compression mechanical ratio at the healthy and repairing sides of the radius in the firearm injury group were decreased (P < 0.05), and the new bone area increased (P < 0.05). At 2 and 4 weeks after repair, the local blood flow at the repair area was significantly increased (P < 0.05). These results suggest that compared with the surgical injury group, the curative effect of human vascular endothelial growth factor 121 gene is more ideal in the firearm injury group because of the emergence of local ischemia and hypoxia in the process of radial defect repair. Human vascular endothelial growth factor 121-modified material can repair bone marrow stromal cells. The application of human vascular endothelial growth factor 121 in firearm burns can enhance the synthesis and secretion of angiogenic factors, improve the local blood flow, reduce anti-compression mechanical ratio, and increase the new bone area.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: Tissue Engineering, Biocompatible Materials, Bone Transplantation

Abstract:

OBJECTIVE: To explore the application of human vascular endothelial growth factor 121 gene-modified materials in the repair of firearm-induced radial injury in rabbits.

Key words: Tissue Engineering, Biocompatible Materials, Bone Transplantation

王建忠，李兵仓，任宝，高飞，李聪杰，刘伟，王晓冬，雷鸣，高文山. 人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料修复桡骨火器性骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(47): 7561-7566.

Wang Jian-zhong, Li Bing-cang, Ren Bao, Gao Fei, Li Cong-jie, Liu Wei, Wang Xiao-dong, Lei Ming, Gao Wen-shan. Human vascular endothelial growth factor 121 gene-modified materials repair firearm-induced radial defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(47): 7561-7566.

图/表（结果） 3

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引言

骨缺损是战争中常见的损伤，可由子弹、爆炸物碎片、冲击波或者爆炸直接损伤等引起^[1]。由于创伤比较严重，易于感染等特点，如果缺损后得不到有效的治疗容易造成骨不连、骨延迟愈合等，增加人体痛苦，甚至造成其功能丧失。目前，对于骨缺主要采取自体骨移植，但是该治疗方法由于供体缺乏再加上重建容易造成的损伤等而限制其推广^[²^]。虽然异体或异种骨移植能够避免肢体骨移植的不足，但是容易造成肝炎等慢性传染疾病的传播。同时对于出现大批患者时，异体骨来源也是一个难以解决的问题。近年来，组工职工化人工骨得到研究，其核心部分包括：支架、材料及诱导信号^[^3-4^]。但是，目前人工骨用于骨缺损中的报道研究相对较少。

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前研究发现的最强的粗血管内皮细胞增殖的细胞因子。研究结果显示：VEGF能够增加局部血管数目，改善局部血液微循环。同时，VEGF也是软骨内化骨过程中必不可少的因子^[^5-6^]。而人血管内皮细胞生长因子121(human vascular endothelial growth factor 121， HuVEGF₁₂₁)在临床上得到广泛应用，该基因对培养的骨髓基质干细胞进行相应的基因修饰，提高基因合成，分泌成血管因子水平。通过 HuVEGF₁₂₁基因能够修饰骨髓基质干细胞，并且能够和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物结合，能够形成HuVEGF₁₂₁基因修饰复合材料^[^7-8^]。但是，HuVEGF₁₂₁在火器性骨缺损的研究相对较少，且修复效果也存在较大的争议^[⁹^]。

文章以此探讨HuVEGF₁₂₁基因修饰材料在兔桡骨火器性骨缺损修复中的应用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年6月至2015年6月在解放军第三军医大学骨科完成。

1.3 材料

实验动物：家兔128只，雌雄不限，体质量1.8- 3.2 kg，平均(2.4±0.3) kg，由第三军医大学动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(粤) 2007-0010。对家兔进行等条件喂养，且对家兔的处理符合《关于善待实验动物的指导下意见》中相关

人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料修复兔桡骨火器性骨缺损实验相关主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
PLGA 多孔支架材料、力学标本制作模具，规格：2.0 cm×2.0 cm×1.5 cm；Ad-huVEGF₁₂₁	实验室自制
多聚甲醛	北京化学试剂公司
光学显微镜	德国西门子有限公司
万能力学试验机	瑞格尔，中国深圳

规则^[1⁰^-1¹^]。

支架材料：聚乳酸和聚羟基乙酸(PLGA)多孔支架材料及力学标本制作模具(规格：2.0 cm×2.0 cm×1.5 cm)均为本实验室自制，该材料支架具有良好的细胞相容性，PLGA对多孔支架整体力学性能、降解性能以及生物性能不会产生明显的影响，并且PLGA能够促进组织支架的构建。

1.4 实验方法

1.4.1 建模及干预实验将选取的128只家兔采用随机对照方法分为手术致伤组和火器伤组，每组64只。对两组家

兔肌肉注射0.4 mL/kg速眠新输着液(湖南郎力夫制药有限公司，国药准字H43021866)进行麻醉，前肢备皮，手术过程中家兔保持右侧卧姿势，左前肢外伸悬吊固定在手术台上。手术致伤组采用常规手术的方法造成动物左侧桡骨缺损，长度为1.2 cm，火器致伤组致伤后进行清创手术，建立家兔桡骨缺损模型。

火器伤组采用56式滑膛枪发射质量为0.25 g的钢珠，距离控制在5 m远，将家兔桡骨中段与尺骨之间间隙最快处作为着弹点，利用激光测速仪测定钢珠发射时的初速度，对家兔立即进行清创手术，并肌肉注射青霉素预防感染，建立家兔桡骨缺损模型^[1²^-1³^]，缺损长度1.2 cm，见图1。对于未出现感染家兔，3 d后缝合。家兔损伤后密切监测其生命体征，如：脉搏、呼吸、拍X射线记录尺桡骨骨折情况。

桡骨骨缺损测量方法：家兔清创后暴露骨折部分，清除游离碎骨快，确定最近测点到骨折最远侧点间的距离^[1⁴^-1⁵^]。

1.4.2 兔骨髓基质干细胞的获取与原代培养取上述建模家兔，在麻醉状态下采用16号骨穿针在髂前棘行骨髓腔穿刺，待存在明显落空感后，采用1 mL肝素预湿的注射器抽取2.0-3.0 mL骨髓，然后抽取1 mL无血清DMEM培养液，让培养液和家兔骨髓充分混合均匀，沿着管壁加入等量体积的淋巴细胞分离液，进行20 min离心，离心速度为2 000 r/min，吸取中间乳白色云雾状由和细胞层，加入5 mL无血清的培养液，5 min离心，离心速度为 1 200 r/min^[1⁶^]。加入2 mL含有血清培养液，制作成单细胞悬液，以3×10⁵/cm₂接种到培养皿中，将其放置在温度37 ℃、体积分数5%CO₂中进行孵育。培养24 h后全量换液，以后每隔3 d换液1次。待细胞融合超过80%后进行传代培养^[1⁷^-¹⁸^]。

1.4.3 骨髓基质干细胞的传代培养吸除培养瓶内的培养液，加入3 mL消化液，摇晃培养瓶，使得消化液完全流过培养瓶底，吸除消化液，再次加入3 mL消化液，在倒置显微镜下显微镜下观察细胞间隙变大、变圆后，吸除消化液，加入6 mL细胞培养液，轻轻吹打使得细胞完全荼罗，细胞计数后，以1×10⁴/cm²接种培养瓶，加入培养液进行孵育，次日更换培养液，观察细胞生长和形态变化情况。

将二代细胞，采用骨诱导培养液进行孵育，每天观察细胞生长状况和形态的变化，细胞生长结节后，取出盖玻片，并采用PBS进行3次清洗，采用体积分数2%茜素红染液进行染色3-5 min^[¹⁹^]，见图2。

1.4.4 多孔支架材料的制备利用溶酶投放和颗粒滤取技术对多孔支架进行制备，取0.5 g PLGA加入到洁净的15 mL刻度试管中，加入5 mL三氯甲烷溶液；向溶液中放入4.5 g氯化钠颗粒，封闭管口，进行充分震荡，保证氯化钠颗粒能够在溶液中分布均匀。将溶液放入模具及通风口中，在干燥环境下除去三氯甲烷^[2⁰^]。将去除的溶剂支架放入到250 mL除尘灭菌双蒸水中，析出氯化钠，将支架进行24 h干燥，并放置在真空干燥器中备用^[2¹^]。

1.4.5 家兔的骨缺损修复待上述实验完成后，制作的复合材料大小为1.4 cm×0.4 cm×0.4 cm。动物采用肌肉注射麻醉药物后进行常规消毒，手术过程中充分暴露左桡骨骨缺损部位，将肉芽等组织清除，采用实验室制备好的相应材料，修整后植入骨缺损部位，所用的细胞为加入的来源细胞，能够巧妙的避免免疫排斥反应。手术后缝合伤口，进行常规喂养^[2²^-2³^]。

1.5 主要观察指标 ①观察两组动物术后1周骨缺损部位灰度比值。②观察两组家兔术后3周修复局部血流量的测定。③观察两组家兔修复后3周健侧与修复侧桡骨的抗压缩力学比值。④两组家兔修复后5周新生骨面积百分比比较。

1.6 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析和LSD法两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨骼肩负着支持、保护、造血、代谢等多种功能，但容易受到损伤。数据结果显示：中国每年有数百万人需要进行骨科修复手术。而火器性骨缺损相对比较特殊，患者发病后如果得不到及时的修复或修复不佳，将会导致骨不连、骨延迟愈合等，增加患者痛苦。目前，临床上对于桡骨火器性骨缺损主要以自体骨移植为主，但是该方法受到限制较多，难以推广^[24-25]。而一体或异种骨移植也存在慢性疾病的感染等，导致患者长期疗效欠佳，预后较差。近年来，HuVEGF₁₂₁基因修饰材料在兔桡骨火器性骨缺损修复中得到应用，且效果理想^[26]。实验结果显示，火器烧伤家兔治疗8，12以及16周后骨缺损部位灰度比值，显著低于手术致伤组。VEGF是人体内相对比较重要的糖蛋白，它能够特异性的作用于血管内皮细胞，属于内皮细胞特异性的有丝分裂原，该糖蛋白能够有效的维持血管正常状态、完整性，提高血管的通透性，能更好的促进血管的再生^[27-28]。实验显示，火器烧伤组治疗2，4周后骨缺损修复出局部血流量，显著高于手术致伤组。由此看出：HuVEGF₁₂₁基因修饰材料在兔桡骨火器性骨缺损修复中效果优于手术致伤家兔，其主要原因是由于手术致伤组在修复过程中由于烧伤后局部缺血缺氧，采用HuVEGF₁₂₁基因治疗效果更理想。同时，HuVEGF₁₂₁在修复过程中其基因转染的促进成骨作用与局部的血供状况关系密切，更加适用于缺血改变情况。对于正常人而言，VEGF基因全长 14 kb，该段基因内有8个外显因子和7个内含值，它经过不同的剪切方式形成多种蛋白异构体。HuVEGF₁₂₁具有可溶性的分泌蛋白，合成后能够全部释放到细胞内，并且该蛋白质并不会和肝素相互结合^[²⁹^-³⁰^]。同时，HuVEGF₁₂₁材料同源性相对较高，能够作为临床上基因治疗的目的基因而发挥其重要的治疗作用^[3¹^-3²^]。

实验发现，火器烧伤组家兔修复后8，12，16周健侧与修复侧桡骨的抗压缩力学比值，显著低于手术致伤组。研究结果显示：HuVEGF₁₂₁是软骨内化骨过程中必不可少的一种因子^[3³^-3⁴^]，采用VEGF抗体拮抗VEGF的生物活性能促进成骨的目的^[3⁵^-⁵⁴^]。此外，HuVEGF₁₂₁除了通过影响局部血循环而影响成骨作用外，HuVEGF₁₂₁还能够通过其他其他方式对成骨作用而产生影响^[⁵⁵^]。实验结果显示，火器烧伤组8，12，16周修复后新生骨面积，显著多于手术致伤组。

综上所述，HuVEGF₁₂₁能够对培养的骨髓基质细胞进行修复，提高其合成及分泌成血管因子的水平，能够提高其局部血流量、降低抗压缩力学比值，且新生骨面积较大，值得进一步推广研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料修复桡骨火器性骨缺损

Human vascular endothelial growth factor 121 gene-modified materials repair firearm-induced radial defects

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[1]	崔新雯，张一民，汪赞，孔振兴. 自噬介导的高强度间歇运动对中年大鼠骨骼肌质量和有氧运动能力随时间变化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(8): 1196-1204.
[2]	何克云，李志忠，胡朝晖 . 后路椎体间融合后早期骶骨倾斜角变化及其分析[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(15): 2361-2365.