自噬介导的高强度间歇运动对中年大鼠骨骼肌质量和有氧运动能力随时间变化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0137

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (8): 1196-1204.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0137

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自噬介导的高强度间歇运动对中年大鼠骨骼肌质量和有氧运动能力随时间变化的影响

崔新雯，张一民，汪赞，孔振兴

北京体育大学运动与体质健康教育部重点实验室，北京市 100084

收稿日期:2017-10-19 出版日期:2018-03-18 发布日期:2018-03-18
通讯作者: 张一民，博士，博士生导师，北京体育大学运动与体质健康教育部重点实验室，北京市 100084
作者简介:崔新雯，女，1990年生，山西省人，汉族，北京体育大学在读博士。
基金资助:
“十二五 ”国家科技支撑计划课题资助项目(2012BAK21B00)；中央高校基本科研业务费专项资金资助课题(2015ZD007，2016SYS009)

Influence of autophagy-mediated high-intensity interval training on skeletal muscle mass and aerobic capacity of middle-aged rats

Cui Xin-wen, Zhang Yi-min, Wang Zan, Kong Zhen-xing

Key Laboratory of Exercise and Physical Fitness of Education Department, Beijing Sport University, Beijing 100084, China

Received:2017-10-19 Online:2018-03-18 Published:2018-03-18
Contact: Zhang Yi-min, Ph.D., Doctoral supervisor, Key Laboratory of Exercise and Physical Fitness of Education Department, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
About author:Cui Xin-wen, Doctoral candidate, Key Laboratory of Exercise and Physical Fitness of Education Department, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
Supported by:
the National Scientific and Technological Supporting Program during the Twelfth Five-Year Plan Period, No. 2012BAK21B00; the Fundamental Research Funds for the Central Universities of China, No. 2015ZD007 and 2016SYS009

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
高强度间歇训练：是以≥无氧阈或最大乳酸稳态的负荷强度进行多次持续时间为几秒到几分钟的练习，且每两次练习之间安排使练习者不足以完全恢复的静息或低强度练习的训练方法。
有氧运动能力：指人体在氧气供应充足的情况下，由能源物质氧化分解提供能量所完成工作的能力。

摘要
背景：有关自噬介导的高强度间歇运动对骨骼肌产生的长期运动适应尚不清楚。
目的：观察高强度间歇运动对中年大鼠骨骼肌细胞自噬随时间变化的影响，探讨自噬在高强度间歇运动维持骨骼肌质量和提高有氧运动能力的潜在调控作用。
方法：将大鼠随机分为安静组、中等强度运动组和高强度间歇运动组，中等强度运动组进行60%VO2 max强度的持续运动，共50 min；高强度间歇运动组进行80%VO2 max和50%VO2 max的高低强度间歇运动，各3 min，重复6次，热身和恢复以60%VO2 max的强度进行，各7 min。在干预前、干预后4，8，12周测试最大摄氧量、力竭运动时间、力竭运动距离。在不同时间点随机选8只取材比目鱼肌，称质量后用Western Blot检测Beclin 1，LC3和P62蛋白表达。
结果与结论：①安静组比目鱼肌湿质量在干预12周时显著下降(P < 0.01)，而中等强度运动组和高强度间歇运动组相对于安静组显著提高(P < 0.05)；②高强度间歇运动组最大摄氧量、力竭运动时间和距离从干预4周起相对于干预前和同期安静组逐步提高，直到干预12周；③安静组Belcin1和LC3II蛋白表达在12周显著下降(P < 0.05，P < 0.001)，高强度间歇运动组LC3II蛋白表达和LC3II/LC3I比值分别从干预4周和8周时相对于干预前和同期安静组显著提升，并维持较高水平直到实验结束，中等强度运动组干预12周LC3II蛋白表达和LC3II/LC3I比值显著提升(P < 0.001，P < 0.01)；④安静组P62蛋白含量在干预4，8周显著升高(P < 0.05，P < 0.05)，干预12周时下降(P < 0.001)，而中等强度运动组和高强度间歇运动组相对于安静组一直维持较低水平；⑤结果说明，高强度间歇运动有利于维持中年大鼠骨骼肌质量、提高有氧运动能力，表现出与中等强度运动相当甚至更优的效果，在某种程度上得益于自噬活性的有效激活，为其在健康促进中的理论基础与实践应用提供了依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-5381-4938(崔新雯)

关键词: Tissue Engineering, Autophagy, Muscle, Skeletal

Abstract:

BACKGROUND: It is unclear whether autophagy mediates the long-term exercise adaptation of the skeletal muscle induced by high-intensity interval training (HIIT) .
OBJECTIVE: To identify the influence of HIIT on skeletal muscle autophagy of middle-aged rats over time, and to understand the potential regulatory effects of autophagy on maintaining the muscle mass and improving aerobic capacity by HIIT.
METHODS: Rats were randomly divided into quiet, moderate training group (50-minute running at the intensity of 60% VO2 max) and HIIT group (6 times of 3-minute running at 80% VO2 max and 3-minute active recovery at 50% VO2 max with a 7-minute warm-up and a 7-minute cool-down at 60% VO2 max). All rats were tested for VO2 max, exhaustive running time and distance at baseline and after 4, 8 and 12 weeks of exercise, respectively. The soleus muscle were collected and weighted, and then the expression levels of autophagy-related protein Beclin 1, LC3 and P62 were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The soleus muscle mass in the quiet group decreased at the 12th week (P < 0.01), while the moderate training and HIIT groups improved this decline (P < 0.05). The HIIT group dramatically improved the VO2 max from the 4th week when compared with the pre-experiment and the quiet group, until the 12th week. The expression levels of Beclin1 and LC3II in the quiet group declined at the 12th week (P < 0.05, P < 0.001), but the expression level of LC3II and ratio of LC3II/LC3I raised from the 4th and 8th weeks till the 12th week compared with the pre-experiment and the quiet group, and the expression level of LC3II and ratio of LC3II/LC3I point time significantly raised in the moderate training group at the 12th week (P < 0.001, P < 0.01). In the quiet group, the content of P62 significantly increased at the 4th and 8th weeks (P < 0.05), and decreased at the 12th week (P < 0.001), but the content of P62 remained at the low level in the moderate exercise and HIIT groups. These results imply that an equivalent or better effects on improving basic autophagy level, skeletal muscle mass and aerobic capacity of the middle aged rats, by HIIT versus moderate training, providing the theory and empirical data that highlight the role of HIIT in health promotion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: 高强度间歇运动, 中等强度持续运动, 骨骼肌质量, 有氧运动能力, 细胞自噬, 中年大鼠, 运动适应, 组织工程

中图分类号:

R318

崔新雯，张一民，汪赞，孔振兴. 自噬介导的高强度间歇运动对中年大鼠骨骼肌质量和有氧运动能力随时间变化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(8): 1196-1204.

Cui Xin-wen, Zhang Yi-min, Wang Zan, Kong Zhen-xing. Influence of autophagy-mediated high-intensity interval training on skeletal muscle mass and aerobic capacity of middle-aged rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(8): 1196-1204.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析除中等强度运动组和高强度间歇运动组个别大鼠在训练期间尾巴被跑台夹伤外，无其他大鼠受伤、感染，生病等意外情况，最终80只大鼠进入结果分析。

2.2 两种运动方式对中年大鼠骨骼肌质量随时间变化的影响采用双因素方差分析，以体质量为协变量，在体质量=600.17 g时估计两种运动方式对比目鱼肌湿质量随时间变化的影响。发现不同运动方式和时间都对比目鱼肌湿质量产生了影响。安静组大鼠比目鱼肌湿质量在干预4周时达到峰值，从8周开始略有下降，到干预12周(大鼠12月龄)时，相对于干预4周时下降了15%(P=0.003，95%CI：4%-25%)而此时中等强度运动组和高强度间歇运动组同样继续保持较高水平，分别高于同期安静组14%和12% (P=0.012，95%CI：2%-24%；P=0.014，95%CI：2%-22%)，中等强度运动组与高强度间歇运动组无差异，见图1。高强度间歇运动和中等强度运动均有效抑制了12月龄大鼠比目鱼肌湿质量的下降，但两种运动方式对比目鱼肌湿质量的影响无明显差异。

2.3 两种运动方式对中年大鼠有氧运动能力随时间变化的影响双因素方差分析两种运动方式对最大摄氧量和力竭运动时间和力竭运动距离随时间变化的影响，发现不同运动方式和时间都对最大摄氧量和力竭运动时间和力竭运动距离产生了影响。

在对最大摄氧量的影响中，干预4周时高强度间歇运动组相对于干预前提高了25%(P=0.002，95%CI：7%-42%)，相对于安静组提高了26%(P=0.000，95%CI：10%-43%)，相对于中等强度运动组提高了16%(P=0.031，95%CI：1%-31%)；干预8周时高强度间歇运动组相对于干预前提高了30%(P=0.001，95%CI：10%-50%；P=0.000，95%CI：13%-43%)，相对于安静组提高了22%(P=0.013，95%CI：3.6%-40.6%)；12周时高强度间歇运动组相对于干预前提高了40%(P=0.000，95%CI：15%-65%)，相对于安静组提高了26%(P=0.034，95%CI：1.4%-51.5%)，见图2。安静组在整个干预过程中无明显波动，中等强度运动组从干预第4周开始有上升趋势，但差异无显著性意义，而高强度间歇运动组从干预第4周时开始，最大摄氧量显著提高，12周时达到最高水平，可知，高强度间歇运动较中等强度运动明显提高了最大摄氧量。

在对力竭运动时间的影响中，4周时中等强度运动组和高强度间歇运动组相对于干预前分别提高了17%和23%(P=0.006，95%CI：4%-30%；P=0.000，95%CI：10%-30%)，相对于安静组分别提高了18%和27% (P=0.001，95%CI：6%-31%；P=0.000，95%CI：15%- 27%)，但二者无显著性差异；8周时中等强度运动组和高强度间歇运动组相对于干预前分别提高了22%和28% (P=0.001，95% CI：7%-37%)，P=0.000，95%CI：13%-43%)，相对于安静组分别提高了31%和40% (P=0.000，95%CI：15%-47%；P=0.000，95%CI：24%- 56%)，但二者无显著性差异；干预12周中等强度运动组和高强度间歇运动组相对于干预前分别提高了45%和46% (P=0.001，95%CI：26%-64%，P=0.000，95%CI：27%- 64%)，相对于安静组分别提高了55%和57% (P=0.000，95%CI：32%-77%；P=0.000，95%CI：35%-80%)，但二者无显著性差异，见图3。可见，安静组在整个干预过程中没有明显波动，而中等强度运动组和高强度间歇运动组从干预4周时开始，力竭运动时间逐步提高，直到12周时达到最高水平，分别超出对照组55%和57%，但两种运动方式在提高力竭运动时间上无明显的差异。

在对力竭运动距离的影响中，干预4周中等强度运动组和高强度间歇运动组相对于干预前分别提高了35%和48% (P=0.014，95%CI：5%-64%；P=0.000，95%CI：20%-76%)，相对于安静组分别提高了38%和58% (P=0.001，95%CI：10%-66%；P=0.000，95%CI：30%-85%)，高强度间歇运动组有高于中等强度运动组的趋势(P=0.242)；8周时中等强度运动组和高强度间歇运动组相对于干预前分别提高了45%和60%(P=0.002，95%CI：12%-78%)，P=0.000，95%CI：27%-91%)，相对于安静组分别提高了64%和87%(P=0.000，95%CI：27%-101%；P=0.000，95%CI：50%-124%)，但二者无显著性差异；12周时中等强度运动组和高强度间歇运动组相对于干预前分别提高了106%和105%(P=0.001，95%CI：64%- 148%，P=0.000，95%CI：65%-146%)，相对于安静组分别提高了135%和144%(P=0.000，95%CI：82%-188%；P=0.000，95%CI：90%-197%)，但二者无显著性差异，见图4。可见，安静组在整个干预过程中没有明显波动，而中等强度运动组和高强度间歇运动组从干预4周时开始，力竭运动距离逐步提高，直到12周时达到最高水平，分别超出对照组135%和144%，且高强度间歇运动在提高力竭运动距离上有优于中等强度运动的趋势。

2.4 两种运动方式对中年大鼠骨骼肌Beclin 1、LC3和P62蛋白表达随时间变化的影响采用双因素方差分析两种运动方式对比目鱼肌Beclin 1、LC3II的蛋白表达，LC3II/LC3I比值和P62蛋白表达随时间变化的影响。在对比目鱼肌Beclin 1的蛋白表达的影响中，可见12周时安静组相对于干预前有明显的下降趋势(P=0.025)，而两个运动组略高于安静组，见图5。

在对比目鱼肌对LC3II蛋白表达的影响中，干预4周时，高强度间歇运动组LC3II蛋白表达显著高于干预前和同期的安静组，分别提升了47%和28%(P=0.003，95%CI：12%-82%；P=0.048，95%CI：0%-55%)；8周时，高强度间歇运动组LC3II蛋白表达继续提升，显著高于干预前和同期的安静组，分别提升了60%和25%(P=0.000，95%CI：24%-94%；P=0.05，95%CI：0%-50%)，此时中等强度运动组也显著高于干预前40%(P=0.015，95%CI：5%-75%)，安静组相对于干预前和4周有提升的趋势，但是无显著变化；12周时，安静组LC3II蛋白表相对于4周和8周时期显著下降33%和40%(P=0.025，95%CI：3%-64%；P=0.001，95%CI：12%-67%)，而同期的中等强度运动组和高强度间歇运动组则在8周的基础上继续保持较高水平，分别高于安静组88%和78%(P=0.000，95%CI：48%- 130%；P=0.000，95%CI：38%-120%)，见图6。可见，随时间的变化，安静组LC3II蛋白表达在干预12周(大鼠12月龄)出现显著降低。高强度间歇运动组则从干预4周时起显著提升，直到实验结束，而中等强度运动组的提升相对滞后，说明两种运动方式有效促进了LC3II蛋白表达，缓解了安静组的下降趋势，且高强度间歇运动较中等强度运动更具有时效性。

两种运动方式和时间对LC3II/LC3I比值产生了影响(P=0.05，P=0.000)，在干预8周时，高强度间歇运动组的LC3II/LC3I比值明显高于干预前(100%，P=0.000，95%CI：44%-157%)和同期安静组(34%，P=0.048， 95%CI：0%-64%)，到了干预第12周，两个运动组均维持在较高水平，分别高于干预前80%和66%(P=0.002，95%CI：23%- 136%；P=0.014，95%CI：9%-122%)，且有高于同期安静组的趋势，见图7。

双因素方差分析发现，不同运动方式和时间对比目鱼肌P62蛋白相对含量产生了影响，干预4周时，安静组相对于干预前的P62蛋白含量显著上升(P < 0.05)，而中等强度运动组和高强度间歇运动组显著降低了此时安静组的P62蛋白含量(36%，P=0.000，95%CI：24%-50%；18%，P=0.000，95%CI：5%-32%)；干预8周时，相对于干预前，安静组P62蛋白水平仍保持较高的水平(P < 0.05)，而中等强度运动组和高强度间歇运动组同样显著降低了此时安静组的P62蛋白含量(26%，P=0.000，95%CI：12%-40%；30%，P=0.000，95%CI：16%-44%)；到了干预12周，安静组P62蛋白含量显著低于了干预4，8周时(P < 0.001)，此时中等强度运动组和高强度间歇运动组有低于安静组的趋势，但差异无显著性意义，见图8。

安静组在干预4，8周时P62蛋白含量显著上升，这可能与大鼠比目鱼肌自噬体的产生增多有关，而两种运动方式均有效降低了P62蛋白含量。在干预12周时，由于安静组比目鱼肌自噬体产生减少，P62蛋白含量也相应下降了，但仍有较高自噬水平的两个运动组保持了较低P62蛋白含量，说明两种运动方式促进了该时期自噬活性的通畅性。

参考文献

[1] Sandri M. Autophagy in health and disease. 3. Involvement of autophagy in muscle atrophy. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;298(6): C1291-C1297.

[2] Masiero E, Agatea L, Mammucari C, et al. Autophagy is required to maintain muscle mass. Cell Metab. 2009;10(6):507-515.

[3] Papackova Z, Cahova M. Important role of autophagy in regulation of metabolic processes in health, disease and aging. Physiol Res. 2014; 63(4):409-420.

[4] Tachtsis B, Smiles WJ, Lane SC, et al. Acute Endurance Exercise Induces Nuclear p53 Abundance in Human Skeletal Muscle. Front Physiol. 2016;7:144.

[5] Pigna E, Berardi E, Aulino P, et al. Aerobic Exercise and Pharmacological Treatments Counteract Cachexia by Modulating Autophagy in Colon Cancer. Sci Rep. 2016;6:26991.

[6] Kim JS, Lee YH, Yi HK. Gradual downhill running improves age-related skeletal muscle and bone weakness: implication of autophagy and bone morphogenetic proteins. Exp Physiol. 2016;101(12):1528-1540.

[7] Vainshtein A, Hood DA. The regulation of autophagy during exercise in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 2016;120(6):664-673.

[8] White Z, Terrill J, White RB, et al. Voluntary resistance wheel exercise from mid-life prevents sarcopenia and increases markers of mitochondrial function and autophagy in muscles of old male and female C57BL/6J mice. Skelet Muscle. 2016;6(1):45.

[9] 黎涌明.高强度间歇训练对不同训练人群的应用效果[J].体育科学, 2015, 35(8):59-75.

[10] Billat L V. Interval training for performance: a scientific and empirical practice. Special recommendations for middle- and long-distance running. Part I: aerobic interval training. Sports Med. 2001;31(1):13-31.

[11] Nybo L, Sundstrup E, Jakobsen MD, et al. High-intensity training versus traditional exercise interventions for promoting health. Med Sci Sports Exerc. 2010;42(10):1951-1958.

[12] Gibala MJ, Mcgee SL. Metabolic adaptations to short-term high-intensity interval training: a little pain for a lot of gain? Exerc Sport Sci Rev. 2008;36(2):58-63.

[13] 王京京,韩涵,张海峰.高强度间歇训练对青年肥胖女性腹部脂肪含量的影响[J].中国运动医学杂志,2015,34(1):15-20.

[14] Heinrich KM, Patel PM, O'neal JL, et al. High-intensity compared to moderate-intensity training for exercise initiation, enjoyment, adherence, and intentions: an intervention study. BMC Public Health. 2014;14:789.

[15] Bartlett JD, Close GL, Maclaren DP, et al. High-intensity interval running is perceived to be more enjoyable than moderate-intensity continuous exercise: implications for exercise adherence. J Sports Sci. 2011;29(6):547-553.

[16] Tjonna AE, Lee SJ, Rognmo O, et al. Aerobic interval training versus continuous moderate exercise as a treatment for the metabolic syndrome: a pilot study. Circulation. 2008;118(4):346-354.

[17] Burgomaster KA, Howarth KR, Phillips SM, et al. Similar metabolic adaptations during exercise after low volume sprint interval and traditional endurance training in humans. J Physiol. 2008;586(1): 151-160.

[18] Holloway TM, Bloemberg D, Da Silva ML, et al. High intensity interval and endurance training have opposing effects on markers of heart failure and cardiac remodeling in hypertensive rats. PLoS One. 2015; 10(3):e0121138.

[19] Bedford TG, Tipton CM, Wilson NC, et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 1979;47(6): 1278-1283.

[20] Angadi SS, Mookadam F, Lee CD, et al. High-intensity interval training vs. moderate-intensity continuous exercise training in heart failure with preserved ejection fraction: a pilot study. J Appl Physiol (1985). 2015; 119(6):753-758.

[21] Smart NA, Dieberg G, Giallauria F. Intermittent versus continuous exercise training in chronic heart failure: a meta-analysis. Int J Cardiol. 2013;166(2):352-358.

[22] Arena R, Myers J, Forman DE, et al. Should high-intensity-aerobic interval training become the clinical standard in heart failure?Heart Fail Rev. 2013;18(1):95-105.

[23] Leandro CG, Levada AC, Hirabara SM, et al. A program of moderate physical training for Wistar rats based on maximal oxygen consumption. J Strength Cond Res. 2007;21(3):751-756.

[24] He C, Bassik M C, Moresi V, et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 2012;481(7382):511-515.

[25] Roubenoff R. Physical activity, inflammation, and muscle loss. Nutr Rev. 2007;65(12 Pt 2):S208-S212.

[26] Betik AC, Baker DJ, Krause DJ, et al. Exercise training in late middle-aged male Fischer 344 x Brown Norway F1-hybrid rats improves skeletal muscle aerobic function. Exp Physiol. 2008; 93(7):863-871.

[27] Kim YA, Kim YS, Oh SL, et al. Autophagic response to exercise training in skeletal muscle with age. J Physiol Biochem. 2013; 69(4):697-705.

[28] Stoggl TL, Bjorklund G. High Intensity Interval Training Leads to Greater Improvements in Acute Heart Rate Recovery and Anaerobic Power as High Volume Low Intensity Training. Front Physiol. 2017;8: 562.

[29] Moholdt T, Aamot I L, Granoien I, et al. Aerobic interval training increases peak oxygen uptake more than usual care exercise training in myocardial infarction patients: a randomized controlled study. Clin Rehabil, 2012;26(1):33-44.

[30] Freyssin C, Verkindt C, Prieur F, et al. Cardiac rehabilitation in chronic heart failure: effect of an 8-week, high-intensity interval training versus continuous training. Arch Phys Med Rehabil. 2012;93(8):1359-1364.

[31] Scharf M, Schmid A, Kemmler W, et al. Myocardial adaptation to high-intensity (interval) training in previously untrained men with a longitudinal cardiovascular magnetic resonance imaging study (Running Study and Heart Trial). Circ Cardiovasc Imaging. 2015; 8(4):e002566.

[32] Metcalfe RS, Babraj JA, Fawkner SG, et al. Towards the minimal amount of exercise for improving metabolic health: beneficial effects of reduced-exertion high-intensity interval training. Eur J Appl Physiol. 2012;112(7):2767-2775.

[33] Cocks M, Shaw CS, Shepherd SO, et al. Sprint interval and endurance training are equally effective in increasing muscle microvascular density and eNOS content in sedentary males. J Physiol. 2013;591(3): 641-656.

[34] Little JP, Safdar A, Bishop D, et al. An acute bout of high-intensity interval training increases the nuclear abundance of PGC-1alpha and activates mitochondrial biogenesis in human skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011;300(6):R1303-R1310.

[35] Bartlett JD, Hwa Joo C, Jeong TS, et al. Matched work high-intensity interval and continuous running induce similar increases in PGC-1alpha mRNA, AMPK, p38, and p53 phosphorylation in human skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 2012;112(7):1135-1143.

[36] Taylor CW, Ingham SA, Ferguson RA. Acute and chronic effect of sprint interval training combined with postexercise blood-flow restriction in trained individuals. Exp Physiol. 2016;101(1):143-154.

[37] Robinson MM, Dasari S, Konopka AR, et al. Enhanced Protein Translation Underlies Improved Metabolic and Physical Adaptations to Different Exercise Training Modes in Young and Old Humans. Cell Metab. 2017;25(3):581-592.

[38] Scribbans TD, Edgett BA, Vorobej K, et al. Fibre-specific responses to endurance and low volume high intensity interval training: striking similarities in acute and chronic adaptation. PLoS One. 2014;9(6): e98119.

[39] Mueller SM, Aguayo D, Zuercher M, et al. High-intensity interval training with vibration as rest intervals attenuates fiber atrophy and prevents decreases in anaerobic performance. PLoS One. 2015;10(2): e0116764.

[40] Burgomaster KA, Cermak NM, Phillips SM, et al. Divergent response of metabolite transport proteins in human skeletal muscle after sprint interval training and detraining. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2007;292(5):R1970-R1976.

[41] Burgomaster KA, Heigenhauser GJ, Gibala MJ. Effect of short-term sprint interval training on human skeletal muscle carbohydrate metabolism during exercise and time-trial performance. J Appl Physiol (1985). 2006;100(6):2041-2047.

[42] Kim YA, Kim YS, Song W. Autophagic response to a single bout of moderate exercise in murine skeletal muscle. J Physiol Biochem. 2012;68(2):229-235.

[43] Levine B, Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 2008;132(1):27-42.

[44] 刘文锋,魏霞,张冰侠,等.规律运动对增龄大鼠比目鱼肌细胞凋亡与自噬及PGC-1α信号调控的影响[J].中国运动医学杂志,2017,36(2):128-135.

[45] 马晓雯,常芸,王世强,等.不同强度不同时间耐力训练对于大鼠心肌细胞自噬发生程度的影响[J].中国运动医学杂志,2016,35(1):27-31.

[46] Klionsky DJ. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(11): 931-937.

[47] Wirawan E, Lippens S, Vanden Berghe T, et al. Beclin1: a role in membrane dynamics and beyond. Autophagy. 2012;8(1):6-17.

[48] Lira VA, Okutsu M, Zhang M, et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB J. 2013;27(10):4184-4193.

[49] Kim J, Kundu M, Viollet B, et al. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1. Nat Cell Biol. 2011;13(2): 132-141.

[50] Zhao J, Brault JJ, Schild A, et al. Coordinate activation of autophagy and the proteasome pathway by FoxO transcription factor. Autophagy. 2008;4(3):378-380.

[51] Zhao J, Brault JJ, Schild A, et al. FoxO3 coordinately activates protein degradation by the autophagic/lysosomal and proteasomal pathways in atrophying muscle cells. Cell Metab. 2007;6(6):472-483.

[52] Mizushima N, Yoshimori T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 2007;3(6):542-545.

[53] Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19(21):5720-5728.

[54] Kabeya Y, Mizushima N, Yamamoto A, et al. LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation. J Cell Sci. 2004;117(Pt 13):2805-2812.

引言

细胞自噬是机体的一种自我保护机制，它通过将细胞质中的大分子物质和由生理或病理原因引起的衰老、破损细胞器在单位膜包裹的囊泡中大量降解，使细胞得到更新与重建，对维持细胞内环境稳态举足轻重^[1]。骨骼肌是重要运动器官，其运动适应与生理功能的维持对机体健康至关重要，而这离不开细胞自噬的参与。适宜水平的自噬是骨骼肌纤维完整性所必须的，自噬不足和自噬过度都会对骨骼肌造成严重损害，前者造成骨骼肌病理性改变及功能失调，后者则导致骨骼肌质量丢失^[1-3]。研究表明，运动引起的自噬促成了不同生理病理条件下骨骼肌重塑与内环境稳态的维持，是骨骼肌健康的关键^[4-8]。但是，多数研究采用的是中等强度的持续运动，虽体现出良好的干预效果，但运用到人群中，其运动时间长、枯燥等特点并不易于被广泛接受，因此，优化运动方式似乎显得更为重要。

高强度间歇运动(high-intensity interval training，HIIT)是一种相对于中等强度持续运动的训练方式，其特点是进行多次持续时间为几秒到几分钟的高强度练习，期间穿插静息或低强度的练习以形成间歇期，使练习者不能得到完全恢复^[9-10]。在进行高强度间歇运动时，受试者可以得到多次重复的高强度刺激，采用较少的运动时间即可同时提高心肺耐力和有氧无氧代谢能力^[11-12]，此外，研究发现HIIT在改善体脂含量与分布，降低血糖、血脂，提高胰岛素敏感性，和改善血管内皮功能上也有良好的效果，甚至比同等能量消耗的持续训练方案效果更好^[13]。同时，HIIT具有更高的运动愉悦感和依从性，这使HIIT显示出明显的经济性和实用性优势^[14-15]。研究发现，一些以80%-90%最大摄氧量为运动强度、重复四五次，每次2-4 min的高强度间歇运动，对于无锻炼经历者、高龄人群和慢性病患者产生了较好的应用价值，而对其兼顾安全性和锻炼效果的进一步探索吸引了众多研究者的兴趣^[11^，^16-18]。

目前，有关自噬介导的高强度间歇运动对骨骼肌产生的运动适应还未见报道，那么高强度间歇运动会对细胞自噬产生适宜刺激吗？这对骨骼肌质量和运动能力有何影响？有待探索。因此，实验通过对中年大鼠进行运动干预，分别在干预前、干预后第4，8，12周时，动态观察高强度间歇运动和中等强度运动对骨骼肌细胞自噬及骨骼肌质量和有氧运动能力的影响，为高强度间歇运动产生的运动适应提供机制性的解释，也为其在人群中(尤其是中老年人)的应用提供数据支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2017年9月在北京体育大学完成。

1.3 材料健康9月龄雄性Wistar大鼠80只，体质量(598.6±50.6) g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001，于北京体育大学 SPF 级动物实验室分笼饲养，相对湿度50%-70%，温度22- 24 ℃，昼夜明暗交替各12 h。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及干预将所有大鼠根据体质量随机分为3组：安静组26只，正常饮食，无运动训练；中等强度运动组27只，进行60%VO_{2 max}强度的持续运动50 min；高强度间歇运动组27只，进行80%VO_{2 max}和50%VO_{2 max}的高低强度间歇运动各3 min，重复6次，热身和恢复以60% VO_{2 max}的强度各进行7 min。中等强度运动组和高强度间歇运动组每次运动时间为50 min，每周5次。实验设计及动物使用通过北京体育大学动物实验伦理委员会审查。

1.4.2 运动干预方案大鼠适应性喂养后，进行约1周的适应性训练，每日训练15-20 min，跑台速度为10 m/min，坡度为0°。之后，进行为期12周的正式训练，训练时间为每周一至周五下午14：00-16：00，中等强度运动组进行60%VO_{2 max}强度的持续跑台运动，共50 min，5次/周；高强度间歇运动组训练方案见表1，跑台坡度均为10°。该方案结合Bedford等^[19]的研究、心衰患者的研究及前期预实验摸索最终确定^[20-22]。大鼠的运动强度是根据干预前、干预4，8周时所测最大摄氧量所对应的速度而控制。中等强度运动与HIIT的总体能量消耗量是相等的。

表1 高强度间歇运动组的训练方案

Table 1 The program of the high-intensity interval training

阶段	强度	时间	次数
热身	60%VO_{2 max}	7 min	1
高强度运动期	80%VO_{2 max}	3 min	6
高强度间歇期	50%VO_{2 max}	3 min	6
恢复	60%VO_{2 max}	7 min	1

表2 大鼠最大摄氧量测试方案

Table 2 The test program for VO_2max

阶段	坡度(°)	速度(m/min)	持续时间(min)
1	10	5	4
2	10	10	3
3	10	15	3
4	10	20	3
5	10	25	3
6	10	30	3
7	10	35	3
8	10	40	3
9	10	45	3
10	10	50	3

1.4.3 大鼠最大摄氧量测试所有大鼠在适应性喂养和训练后进行实验前的首次最大摄氧量测试，为运动强度的制定提供依据。实验开始后，分别在干预第4，8，12周测试大鼠的最大摄氧量，根据Leandro等^[23]的研究进行改良，具体测试方案见表2。

力竭判定标准：大鼠在跑台上不能维持原有的运动速度，尾巴和后肢触碰电极网的时间连续超过5 s以上^[24]。每次测试记录大鼠的最大摄氧量值、力竭运动时间和力竭运动距离。测试采用最大摄氧量测试跑台(Columbus Instruments，Columbus USA)，测试前进行气体校准。

1.4.4 动物取材在首次最大摄氧量测试后的24-48 h，从所有大鼠中随机选取8只进行取材，在干预第4，8，12周的最大摄氧量测试后24-48 h，分别从安静组、中等强度运动组和高强度间歇运动组随机选取8只进行取材。在末次运动结束24-48 h后，以体积分数5%水合氯醛1 μL/g对大鼠腹腔注射进行麻醉，剥离比目鱼肌，用电子秤称肌肉湿质量后，迅速将肌肉投入到液氮中，随后转入-80 ℃冰箱中保存。

1.4.5 Western Blot检测取出在-80 ℃保存的各组比目鱼肌50 mg，分别迅速投入预先加好蛋白酶抑制剂(04693159001，Roche，Mannheim，Germany)的RAPI裂解液(R0278，Sigma，Louisiana，USA) EP管中，冰浴匀浆20 s两三次。静置30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心3 min，取上清。使用BCA蛋白测定试剂盒(23227，Thermo Scientific，Rockford，Illinois，USA)测定所有样品的蛋白浓度，之后加入相应比例的(4×)裂解液和上样缓冲液 (NP0007，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，将浓度调为一致，70 ℃变性10 min。SDS-PAGE (NP0342BOX，Invitrogen)凝胶电泳120 V，1 h，300 mA转膜1.5 h，体积分数5%脱脂奶粉对PVDF膜(polyvinylidene difluoride，PVDF) (IPVH00010，Immobilon-P，Billerica，MA，USA))封闭30 min，使用体积分数5%BSA配制一抗Beclin 1 (1∶ 1 000，3495，CST，Danvers，Massachusett，USA)、LC3(1∶1 000，NB100-2220，Novus Bio，Littleton，Canada)、P62(1∶20 000，ab109012，Abcam，Cambridge，UK)、GAPDH(1∶10 000，ab37168，Abcam)，4 ℃过夜，摇床孵育。次日洗膜后，二抗(1︰20 000，ab6721，Abcam)室温摇床孵育1 h，洗膜后将条带置于化学发光成像系统(ChemiDoc Touch Imaging System，Bio-Rad，CA，USA)，滴加ECL化学发光试剂(34095，Thermo Scientific，Rockford，Illinois，USA)进行曝光显影，利用Image Lab 5.1软件进行灰度值分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.5主要观察指标 ①大鼠的比目鱼肌湿质量；②大鼠最大摄氧量、力竭运动时间和力竭运动距离；③比目鱼肌Beclin 1，LC3I，LC3II及P62蛋白表达量。

1.6 统计学分析实验数据采用x(_)±s及95%CI表示，使用SPSS 19.0及GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析，组间分析采用双因素(时间和不同运动方式两个因素)方差分析，事后检验比较采用Bonfferonni校正，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

实验首次动态观察高强度间歇运动和传统中等强度持续运动对骨骼肌细胞自噬及骨骼肌质量和运动能力随时间变化的影响，发现高强度间歇运动有利于维持中年大鼠骨骼肌质量、提高有氧运动能力，并表现出与传统中等强度运动相当甚至更优的效果，在某种程度上得益于自噬活性的有效激活。

3.1 两种运动方式对中年大鼠骨骼肌质量随时间变化的影响骨骼肌质量是骨骼肌健康的基石，但随年龄增加，骨骼肌质量与骨骼肌退变的发病率和死亡率呈现负相关关系^[25]，因而，防止或延缓骨骼肌质量的丢失，使其维持较高的水平至关重要。运动作为一种经济有效的干预手段已得到了广泛认可。有研究发现，有氧训练可以有效的缓解老年性骨骼肌质量的丢失^[26-27]，实验将关注对象的年龄提前，首次研究了运动与中年大鼠的骨骼肌质量的关系，发现，安静组大鼠比目鱼肌质量随时间变化的峰值出现在10月龄左右，到12月龄时，下降约15%，而这种下降趋势经高强度间歇运动和中等强度运动后得以缓解，有效维持了骨骼肌质量，这就为骨骼肌功能的稳定与提升奠定了基础。实验终止于大鼠12月龄时，并没有继续跟踪骨骼肌质量的变化，对12月龄后，尚处于中年大鼠的比目鱼肌质量会发生何种变化尚不知晓，但实验发现：约12月龄的大鼠比目鱼肌质量相对峰值已经出现了下降，推测之后不管是维持现有水平还是继续降低，均不能为今后的老年时期提供良好的质量基础，提示，中年时期的运动干预对预防和延缓老年性骨骼肌退变是必要的。

3.2 两种运动方式对中年大鼠有氧运动能力随时间变化的影响实验动态观察了不同运动方式对中年大鼠最大摄氧量和力竭运动时间和力竭运动距离的影响。最大摄氧量水平的变化正如预期，与安静状态和中等强度运动相比，HIIT显著提高了最大摄氧量，并持续保持较高水平，直到实验结束。对于力竭运动时间和距离，两种运动方式均有明显的提升效果，且HIIT在力竭运动距离的提高上表现出更优的趋势。这与Betik等^[26]有关HIIT对增龄大鼠(Fischer 344 × Brown Norway F1-hybrid，F344BN)有氧运动能力影响的研究结果相一致，该研究在实施为期7周的HIIT干预后，发现训练组增龄大鼠的力竭运动时间提升接近60%，进一步发现与有氧代谢有关的合成酶提高了20%以上，可见，HIIT有效防止了增龄性有氧运动能力的下降。在进行HIIT时，高低强度的运动相互穿插重复进行，对心脏造成了强劲有效的刺激，研究发现其无论是对训练有素的运动员^[28]，还是心血管疾病疾病患者^[29-30]，还有无运动训练经历的普通人群^[31-33]，都明显提高了心血管的形态结构与功能，促使最大摄氧量或峰值摄氧量得以提高。此外，HIIT通过促进线粒体合成^[34-37]、骨骼肌纤维血管生成^[36^，^38-39]，以及有氧代谢能力等^[17^，^40-41]，极大程度的提高了骨骼肌氧利用能力，这都为有氧运动能力的提升提供了基础。

实验的对象为中年大鼠，安静组大鼠的最大摄氧量和力竭运动时间和距离随时间无明显变化，同时也未发现下降的趋势，推测9-12月龄的中年大鼠有氧运动能力可能仍处于较高水平。但运动，尤其是HIIT对有氧能力的提升在实验中得到了证实，这就为中年时期良好的有氧运动能力打下坚实的基础，有利于积极应对老年性有氧运动能力的下降。但是，实验未能继续进行跟踪观察，对于12月龄后大鼠有氧运动能力的变化趋势及运动累积效应的维持效果不能明确，后续研究可以继续延长观测时间，进一步明确有氧运动能力的增龄性变化规律，为研究运动预防有氧能力下降的切入点及干预效果提供依据。

3.3 两种运动方式对骨骼肌细胞自噬随时间变化的影响细胞自噬被发现以来，人们就在自噬调节与健康促进的关系上进行探索，运动作为激活自噬的一种手段也颇受关注。研究认为，急性运动刺激可以诱导自噬产生应激反应，使骨骼肌细胞自噬活性增强，通过自噬为骨骼肌提供能量供应底物并清除受损细胞器和大分子，并维持了骨骼肌内环境的稳态^[42-43]。同样，长期运动的健康累积效应同样离不开自噬的参与，运动诱导的自噬激活在改善某一病理状态或延缓生理功能的退化方面所发挥着重要作用^[24^，^44]。而马晓雯等^[45]就长期运动对正常生理状态下的细胞自噬进行了研究，发现中等强度的耐力训练激活了大鼠心肌自噬水平，使心功能各项指标维持在正常范围，而长期大强度耐力训练则导致了心肌过度自噬，造成心肌纤维受损，并对心功能产生了不良影响，可见，对运动方式、运动强度的恰当把控，使其控制在安全有效的范围，对进一步提升健康水平更为重要。

实验开拓性的探索了高强度间歇运动对中年大鼠骨骼肌细胞自噬随时间变化的影响，试图为激活最佳自噬水平的有效运动方式提供依据。通过对反映细胞自噬活性的相关蛋白Beclin 1、LC3II和P62进行检测，发现运动干预4周和8周时，运动使自噬的诱导信号Beclin 1的蛋白表达相对同期安静组略微提升，但无显著差异；对于自噬体标记蛋白LC3II和选择性货运蛋白P62，安静组LC3II蛋白表达相对干预前提升的同时，P62蛋白含量也提高了，而高强度间歇运动和中等强度运动使LC3II蛋白表达相对于干预前和同期安静组升高的同时，P62蛋白含量相对于同期的安静组均显著降低，由于P62则会通过自噬进行降解，其水平在一定程度上反映了自噬活动是否通畅^[46]，可见，从干预4周时，运动就可以促进自噬活性，保障自噬流的畅通。同时，在干预4周和8周时，中等强度持续运动对LC3II蛋白表达的影响还不及高强度间歇运动。到了干预12周时，安静组Beclin 1和LC3II的蛋白表达显著下降，而两种运动方式均使LC3II蛋白表达相对于此时的安静组显著升高，伴随着和P62蛋白含量显著降低，表明两种运动方式有效维持了中年大鼠基础自噬水平，并保障了自噬流的畅通。

在细胞自噬的发生中，Beclin 1参与形成Ⅲ型磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol 3-kinase class III，class III PI3K)复合物，以完成自噬的诱导，是自噬体形成的上游信号，对细胞自噬相关蛋白的招募至关重要^[47]。研究发现，运动在促进骨骼肌自噬水平提高的同时，自噬相关蛋白的表达也同样提高了^[45^，^48]，而实验发现，两种运动方式仅仅表现出提升Beclin 1蛋白表达的趋势，未达到显著性水平，同时Kim等^[27]的研究中也发现，8周的跑台训练虽提高了老年小鼠腓肠肌中LC3II的蛋白表达，但对自噬诱导蛋白Beclin 1的影响不大，推测在实验条件下，Beclin 1对两种运动方式后的基础水平自噬的诱导同样不敏感。而在细胞自噬的调控中，丝/苏氨酸蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)被证实是自噬调控的中心靶点。当处于饥饿或能量匮乏情况下，mTOR使ULK1Ser757去磷酸化，使ULK1 复合体激活，诱导自噬的发生^[49]。此外，叉头蛋白(Forkhead box，classO，FoxO)依赖性的转录上调自噬相关基因也可以激活自噬^[50-51]，因而，仍需观察其他自噬诱导蛋白的运动后表现，以对长期高强度间歇运动诱导细胞自噬的机制进行深入探索。

在自噬体的形成过程中，LC3II自形成便至始至终稳定地定位于自噬体膜上，直到随自噬体与溶酶体融合后被降解，因而，LC3II被当做唯一的自噬体标记物，且LC3II的水平在某种程度上映自噬体的数量及自噬发生的强弱^[52-54]。实验在对自噬标记蛋白LC3II的检测后发现，两种有氧运动在不同时间段均提高了中年大鼠比目鱼肌中LC3II的蛋白表达，这与其他有关长期有氧运动对心肌和骨骼肌细胞自噬影响的研究结果一致^[24^，²⁷^，^44-45]。而在Lira 等^[48]的研究中，4周的自主跑轮活动提高了混合型肌纤维跖肌的自噬水平，表现为LC3II的蛋白表达和LC3II/LC3I的比值显著。而比目鱼肌则仅是LC3II的蛋白表达升高，未达到显著性提高，作者分析可能的解释是由于线粒体含量的不同导致，跖肌在经过训练后线粒体增殖蛋白表达增加，说明线粒体的数量适应性的提高，表现出基础自噬水平的增强。而以慢肌纤维为主的比目鱼肌原本所含的线粒体丰富，所接受的轮转运动刺激虽提高了自噬蛋白(LC3II)的表达，但是对线粒体生成没有明显影响，因而基础自噬水平也没有发生显著性变化。因此推测，基础自噬水平受到了线粒体含量的影响。在实验中，发现干预8周后，高强度间歇运动明显提高了LC3II的蛋白表达和LC3II/LC3I的比值，而中等强度运动在干预12周时才出现LC3II蛋白表达的显著性提高，提示高强度间歇运动对比目鱼肌自噬水平的诱导作用更强，且更具时效性，同时实验室前期采用电镜观察两种运动方式对自噬体产生情况发现，高强度间歇运动组在明显增加自噬体的同时，线粒体也大量增多，并且较中等强度运动组明显，这一方面提示，高强度间歇运动对自噬的明显促进作用也同样和线粒体适应性增加密不可分，另一方面，线粒体的大量增多为促进线粒体的动态平衡，加快线粒体周转，进而保障骨骼肌有氧运动能力奠定了基础。

实验发现比目鱼肌质量在约12月龄明显下降，很可能与自噬活性下降有关。而不同时期的运动训练既使骨骼肌质量得以维持，又促进了有氧运动能力的提高，离不开对骨骼肌基础自噬水平的激活和自噬流通畅性的促进，并且，高强度间歇运动在有氧运动能力的提高上有优于传统中等强度运动的趋势，也同样得益于它更有效的激活了自噬水平。

3.4 小结实验首次就自噬介导的中年大鼠骨骼肌随时间变化的运动适应对高强度间歇运动的长期干预效果进行研究，发现高强度间歇运动有利于维持中年大鼠骨骼肌质量、提高有氧运动能力，并表现出与中等强度运动相当甚至更优的效果，在某种程度上得益于有效激活了自噬活性。因此，高强度间歇运动可以作为提高自噬活性的有效运动方式，为其保障骨骼肌健康提供了机制性解释，也为其在人群中(尤其是中老年人)的实践应用提供了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

自噬介导的高强度间歇运动对中年大鼠骨骼肌质量和有氧运动能力随时间变化的影响

Influence of autophagy-mediated high-intensity interval training on skeletal muscle mass and aerobic capacity of middle-aged rats

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[1]	何克云，李志忠，胡朝晖 . 后路椎体间融合后早期骶骨倾斜角变化及其分析[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(15): 2361-2365.
[2]	王建忠，李兵仓，任宝，高飞，李聪杰，刘伟，王晓冬，雷鸣，高文山. 人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料修复桡骨火器性骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(47): 7561-7566.