载硫酸多黏菌素B骨水泥的体外药物释放

doi:10.12307/2026.418

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
硫酸多黏菌素B：对于耐药革兰阴性菌具有较好的抗菌活性，在治疗多重耐药菌感染方面具有重要价值。多黏菌素B全身给药存在肾毒性、神经毒性，导致临床使用受限，但局部给药可减少全身暴露、降低全身毒性风险。
抗生素骨水泥：是一种将抗生素与骨水泥混合后用于骨科手术的材料，能在局部提供高浓度抗生素，常用于关节置换假体周围感染的预防，也可用于治疗骨髓炎或假体感染，同时具有抑制细菌生物膜形成的作用，但长期或不当使用抗生素骨水泥可能导致细菌耐药性的增加。

背景：对于糖尿病足感染，传统载万古霉素骨水泥的抗菌谱局限，亟需新型药物载体。
目的：探索载硫酸多黏菌素B骨水泥的体外洗脱特性。
方法：将硫酸多黏菌素B粉末加入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中均匀混合，灌入模具中，分别制成直径为5，7 mm的骨水泥小球。将两种直径的骨水泥小球分别置于1 mL PBS中浸没，设置相应的时间点提取洗脱液，采用质谱法测定洗脱液中的硫酸多黏菌素B浓度，分析药物释放规律。
结果与结论：①两种直径骨水泥小球的释药峰值均出现在0-0.5 h，之后释药速率逐渐降低。组间比较显示，直径5 mm骨水泥小球的药物释放速度及累计释放率均高于直径7 mm骨水泥小球，直径5，7 mm骨水泥小球14 d的药物累计释放率分别为5.08%，3.37%；两种直径骨水泥小球7 d的药物释放量达到总释放量的90%，接近释放终点。两种直径骨水泥小球的体外药物释放曲线符合Ritger-Peppas模型(R2=0.998 56，0.990 90)，以Fickian扩散为主。②载硫酸多黏菌素B骨水泥具有一定的缓释特性，药物释放主要集中在前7 d，后期释放量低，因此，植入多黏菌素B骨水泥后5-7 d为二次清创的最佳时机，继续留置诱导细菌产生耐药性的风险较高；药物释放速率与骨水泥大小有关，在临床应用中可优先考虑使用直径约5 mm的骨水泥小球，以平衡快速释药及长效抗菌的需求。
https://orcid.org/0000-0003-2506-9664 (毛娇娇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 硫酸多黏菌素B, 骨水泥, 骨水泥小球, 抗生素, 体外, 药物释放, 糖尿病足感染

Abstract: BACKGROUND: For diabetic foot infections, traditional vancomycin-loaded bone cement has a limited antibacterial spectrum, and there is an urgent need for novel drug carriers.
OBJECTIVE: To explore the in vitro elution characteristics of polymyxin B sulfate-loaded bone cement.
METHODS: Polymyxin B sulfate powder was uniformly mixed with polymethyl methacrylate bone cement and poured into molds to prepare bone cement microspheres with diameters of 5 and 7 mm. The two types of bone cement microspheres of different diameters were immersed in 1 mL of PBS, and elution samples were collected at specific time points. The concentration of polymyxin B sulfate in the eluent was determined by mass spectrometry, and the drug release pattern was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The drug release peaks for both types of bone cement microspheres occurred between 0 and 0.5 h, after which the release rate gradually decreased. Inter-group comparison showed that the drug release rate and cumulative release rate of the 5 mm diameter microspheres were higher than those of the 7 mm diameter microspheres. The cumulative drug release rates at 14 days for the 5 mm and 7 mm diameter microspheres were 5.08% and 3.37%, respectively. The drug release from both types of bone cement microspheres of different diameters reached 90% of the total release within 7 days, approaching the release endpoint. The in vitro drug release curves of both types of microspheres conformed to the Ritger-Peppas model (R2=0.998 56, 0.990 90), mainly driven by Fickian diffusion. (2) Polymyxin B sulfate-loaded bone cement exhibits certain sustained-release characteristics, with drug release mainly concentrated in the first 7 days, and low release in the later stages. Therefore, 5-7 days after implantation of polymyxin B bone cement is the optimal time for secondary debridement. Continued placement carries a higher risk of inducing bacterial resistance. The drug release rate is related to the size of the bone cement. In clinical applications, 5 mm diameter microspheres should be considered first to balance the needs for rapid drug release and long-lasting antibacterial effect.

Key words: polymyxin B sulfate, bone cement, bone cement microspheres, antibiotics, in vitro, drug release, diabetic foot infection

中图分类号:

毛娇娇, 钱晨月, 毕飞宇, 包健安. 载硫酸多黏菌素B骨水泥的体外药物释放[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(32): 8454-8459.

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图/表（结果） 2

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引言

随着经济发展和生活水平的提高，糖尿病全球患病率迅速上升，目前成人患病率约为14%[1]。糖尿病足感染是糖尿病的常见并发症之一，发生率约25%[2-3]，死亡率高达12%，其中超过一半的截肢患者可能在5年内死亡，对患者的健康构成了严重威胁[4]。当前临床指南对于糖尿病足感染的治疗手段主要包括清创、负压闭式引流、血液学重建、抗菌药物应用等[5-6]，然而，糖尿病患者常存在下肢血运差、小动脉硬化甚至闭塞[7]，导致血液中的抗生素无法有效到达创面部位而影响抗感染效果。
聚甲基丙稀酸甲酯骨水泥是一种用于填充骨间隙或骨腔的生物材料，自20世纪60年代首次应用于关节置换术以来显著提高了关节置换手术成功率，为骨科手术带来了革命性变化。作为独特的骨修复材料，载抗生素骨水泥可以在局部释放高浓度药物以降低全身毒性风险，实现预防和治疗感染的目标。既往研究表明，载抗生素骨水泥在糖尿病足感染伤口治疗中有显著获益，主要添加药物为万古霉素[8-9]。目前的流行病学研究显示，糖尿病足感染中革兰阴性菌的检出率已高于革兰阳性菌，其中多重耐药菌尤其是铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌的感染率高达36.2%[10]；此外，Wagner分级3-5级的患者中，广泛耐药、甚至全耐药菌的发生率更高，治疗难度更大[11]。因此，传统载万古霉素骨水泥的抗菌谱局限，亟需新型药物载体。多黏菌素B对泛耐药革兰阴性菌有效，国外个案报道用于耐药阴性菌骨髓炎治疗获得了成功[12-14]，但仍缺乏大规模的临床研究。此次研究旨在探索载硫酸多黏菌素B骨水泥的体外洗脱特性，为临床广泛耐药革兰阴性所致糖尿病足感染的治疗提供依据，为后期临床应用的安全性和有效性评估提供研究基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察实验。
1.2 时间及地点实验于2023年7月至2024年2月在苏州大学附属第四医院完成。
1.3 材料
1.3.1 主要仪器 Agilent 1260系列液相色谱(二元泵，脱气机，多孔板进样器，柱温箱，Agilent) ，API 4000三重串联四级杆质谱仪(SCIEX)，低速台式离心机(湘仪L530)，高速台式冷冻离心机(湘仪H1750R)。

1.3.2 试剂与药品多黏菌素B1(Toku-E，P03701BL)，多黏菌素B2 (Toku-E，P03901)，多黏菌素E1(正大天晴研究院，20211118-A)，甲醇(默克，11254407)，乙腈(默克，11250230)，甲酸(ACS，FA-3116-0500)，注射用硫酸多黏菌素B(50mg/瓶，上海上药第一生化药业有限公司，2303802)，骨水泥(北京邦塞，32200082)、PBS(Gibco，6123123)。骨水泥材料介绍，见表1。

1.4 方法
1.4.1 载多黏菌素B骨水泥的制作在100级层流台、环境温度(25±1) ℃和相对湿度不低于40%的条件下，将40 g 聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉剂与100 mg硫酸多黏菌素B粉剂均匀混合，加入骨水泥液态单体20 mL搅拌均匀成糊状，灌入骨水泥模具中，分别制成数十个直径分别为5，7 mm的载硫酸多黏菌素B骨水泥小球，充分凝固后脱模，称量所有骨水泥小球的质量，按比例(单个小球质量/所有小球总量×100 mg)折算各小球中药物含量，置入5 mL灭菌离心管中备用。
1.4.2 体外释放研究根据文献[15-17]选择PBS作为释放介质，每组取5个装有骨水泥小球的灭菌离心管，分别加入1 mL PBS(pH=7.2)浸没小球，置于37 ℃恒温箱中，于0.5，1.5，3，5，8，24 h及第2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14天提取洗脱液，取样后的骨水泥小球用20 mL灭菌注射用水清洗，再换1 mL新鲜PBS浸没。洗脱液样品置于-80 ℃冰箱冷冻保存待测。既往研究表明，当大量骨水泥小球植入清创后的骨腔时，每颗小球周围的渗出液大约为1 mL，因此选择1 mL体积洗脱液进行研究[18]。通过OriginPro软件进行数学模型拟合，根据决定系数R2的大小来确定药物释放规律。
1.4.3 硫酸多黏菌素B检测方法采用质谱法测定洗脱液中的硫酸多黏菌素B质量浓度。
色谱条件：①色谱柱：Phenomenex KINETEX XB-C18柱( 2.6 μm，3 mm×50 mm)；②流速：0. 4 mL/min，柱温：50 ℃；③进样量：3 μL，有机相(A)为纯乙腈，水相(B)为0.1%甲酸-水，流动相洗脱条件详见表2。

质谱条件：采用电喷雾离子源，多反应离子监测，正离子模式进行测定。离子源温度为400 ℃，气帘气体压力为20 kPa，碰撞气体压力为8 kPa，雾化气压力为55 kPa，辅助气压力为45 kPa，离子源喷射电压为4 000 V。多黏菌素B1、多黏菌素B2与多黏菌素E1的母离子、子离子、驻留时间、去簇电压和碰撞能量，详见表3。多黏菌素B1、多黏菌素B2与多黏菌素E1的离子色谱图见图1-3。

标准品和及内标溶液的配制：精密称取多黏菌素B1、多黏菌素B2、多黏菌素E1标准品，加超纯水稀释，制得储备液质量浓度分别为60.00，57.80，56.80 μg/mL。内标为多黏菌素E1，使用时用甲醇稀释10倍，制备成含内标的混合工作液。
线性关系考察、精密度和准确度：分别精密吸取多黏菌素B1储备液和B2储备液，利用甲醇稀释，配制一系列的混合标准曲线和质控工作液。样本检测时，分别吸取10 μL的混合标准曲线和质控工作液，加入90 μL空白基质(PBS)配制成多黏菌素B1质量浓度分别为0.18，0.36，0.71，1.42，3.55，7.11，11.40，14.20 μg/mL，多黏菌素B2质量浓度分别为0.072，0.14，0.29，0.58，1.45，2.89，4.62，5.78 μg/mL的标准曲线样本，多黏菌素B1质量浓度分别为0.63，2.65，6.01 μg/mL，多黏菌素B2质量浓度分别为0.25，1.05，2.35 μg/mL的低、中、高质控样品。标准曲线和质控样本中加入200 μL含内标的混合工作液，进行涡旋，离心5 min后取上清至进样小瓶中进行质谱检测。多黏菌素B1在0.19-14.20 μg/mL质量浓度内线性关系良好(Y=0.34X+0.018，R2=0.999 0)；质控样品实测值为0.62，2.60，5.69 μg/mL均符合要求。多黏菌素B2在0.072-5.78 μg/mL质量浓度内线性关系良好(Y=0.60X+0.038，R2=0.999 0)；质控样品实测值为0.24，1.09，2.40 μg/mL均符合要求。日间、日内精密度均< 10%，低、中、高3个质量浓度的提取回收率在95%-105%之间。
样本处理：取骨水泥洗脱液50 μL置于1.5 mL离心管中，加入200 μL含内标的混合工作液，涡旋振荡5 min，14 000 r/min离心5 min，取上清100 μL置于96孔板中，进样3 μL，检测洗脱液中的多黏菌素B1、多黏菌素B2质量浓度。
1.5 主要观察指标两种直径骨水泥洗脱液中的硫酸多黏菌素B质量浓度及药物释放规律。

讨论

3.1 加入骨水泥中的药品选择对于严重的糖尿病足感染，应用载抗生素骨水泥提高感染部位局部药物浓度的疗效己经得到认可[21]。随着抗菌药物的广泛使用，糖尿病足感染的细菌谱及耐药性也在不断变化，加入骨水泥的抗菌药物首先要能覆盖目标致病菌且敏感性较高，其次要具有良好的热稳定性，避免在骨水泥发生聚合反应时因无法耐受高温失活；此外，还需具备化学性质稳定、致敏性低、粉末易溶于水等特点[22]。目前糖尿病足感染的流行病学调查显示，多重耐药菌尤其是铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌检出率逐年增高[10]，针对广泛耐药革兰阴性菌感染，现有指南共识多推荐使用氨基糖苷类、碳青霉烯类、替加环素或多黏菌素等治疗[23]，但目前国内没有相应氨基糖苷类粉针剂，而碳青霉烯类药物的热稳定性较差[24-25]，替加环素可能通过影响成骨细胞和破骨细胞的平衡干扰骨组织修复过程，对骨重塑有负面影响[26-27]。多黏菌素的热稳定好、对耐药阴性菌效力强、能抑制生物膜的形成[28]，动物实验及个案报道支持多黏菌素治疗泛耐药铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌骨感染的有效性[12-14]。因此，选择多黏菌素B载入骨水泥在泛耐药阴性菌糖尿病足感染的治疗中有一定优势。
3.2 加入骨水泥的药品剂量骨水泥中添加的药物剂量与骨水泥力学性能相关，一般来说，随着药物含量的增加，骨水泥的机械性能可能会下降。有研究表明，在聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中添加5%万古霉素会显著降低材料的抗压强度[29]。然而，作为“抗生素载体”用于感染治疗时，骨水泥的缓释能力、抗菌效率及安全性远重于力学支撑功能，基于这一应用特性，此次研究未考察剂量相关的生物力学性能。从药物安全性角度考虑，多黏菌素全身给药时的肾毒性、神经毒性与剂量显著相关[30]，虽然局部给药可以减少全身暴露，但也不排除局部浓度突释对机体安全性的影响。体外实验表明，高浓度抗生素可显著抑制成骨细胞活性及数量，增加骨不愈合的潜在风险，添加的抗生素剂量既要满足感染治疗又要维持健康的宿主骨骼[31]。既往临床研究发现，在40 g骨水泥中加入常规日剂量(1.0-2.0 g)的万古霉素用于慢性骨髓炎也取得了较好的临床效果[32]。综合考虑临床疗效以及多黏菌素B的安全性，此次研究选择多黏菌素B常规日剂量(100 mg)作为添加剂量。
3.3 骨水泥制作的尺寸大小根据洗脱理论，载体中药物释放一部分来源于表面效应，一部分来源于内部溶蚀，因此，骨水泥的制作形态可能影响药物的释放。有研究对比骨水泥小球与骨水泥占位器用于治疗髋关节置换术后感染的疗效，加入相同剂量的阿米卡星和万古霉素，测定伤口引流液中抗菌药物浓度，结果显示：骨水泥小球组药物缓释周期更长、峰值浓度更高，并且各时段浓度均维持在显著优势水平，展现出更优良的洗脱特性，可能与球体具有更大的表面积相关，能够与周围组织液形成更充分的药物交换界面[33]。因此，现有体外药物释放研究大多采用骨水泥柱或骨水泥小球作为药物载体，文献显示载药骨水泥的药物累计释放率大多为1%-5%[34]，此次研究中骨水泥小球14 d的药物累计释放率达5.08%(直径5 mm组)和3.37%(直径7 mm组)，与既往研究类似。就骨水泥小球体积而言，体积越大虽然载药量增加，但有可能导致内部释放困难且病灶区域有限，需探索最适合尺寸的骨水泥小球保证药物释放。因此，此次研究设计了直径5，7 mm骨水泥小球比较骨水泥大小对于药物释放的影响。
3.4 骨水泥放置时长目前临床实践中糖尿病足二次清创取出骨水泥的时间一般为1-3周，既往体外实验表明1-2周后抗菌药物局部浓度就大幅度下降，甚至可能低于最低抑菌浓度，反而为诱导细菌耐药提供条件[35]，因此，此次研究观察周期设为14 d。中国专家共识推荐多黏菌素类药物敏感试验临床折点为2 μg/mL[20]，对多黏菌素类药物进行治疗药物监测时，多黏菌素B的稳态血药谷浓度推荐维持在2-4 μg/mL。此次研究显示，直径5 mm骨水泥小球在第5天时测定多黏菌素的释放浓度开始小于2 μg/mL，提示在植入载多黏菌素骨水泥约5 d后局部浓度低于最低抑菌浓度，可能导致部分不敏感菌治疗失败；7 d的药物累计释放量超过总释放量的90%，基本达到释放终点；第14天时测定两组载多黏菌素骨水泥小球的释放浓度均小于0.5 μg/mL，继续留置骨水泥诱导细菌产生耐药性的风险较高，提示临床植入载多黏菌素B骨水泥后5-7 d为二次清创的最佳时机。
3.5 载药骨水泥的释放规律分别对直径5 mm和7 mm骨水泥小球的释药规律进行模型拟合，结果显示最优模型为Ritger-Peppas，
次优模型为Higuchi，提示骨水泥小球以扩散机制主导药物释放，并且直径变化未改变释药机制类型。直径5，7 mm骨水泥小球的Ritger-Peppas模型指数n分别为0.181 5和0.180 7 (n < 0.45)，表明药物释放机制为Fickian扩散，药物通过基质孔隙扩散，无显著溶蚀，这与Higuchi模型的高R2值一致。在药物释放速率方面，直径5 mm骨水泥小球的释放速率常数k显著高于直径
7 mm骨水泥小球，表明较小直径的骨水泥小球药物释放更快。对于球形颗粒，表面积与体积比随着直径的增大而减小，较大的表面积与体积比意味着更多的药物可以通过表面扩散，从而导致更快的释放速率，而较大的直径可能导致药物需要通过更长的路径从基质内部扩散到表面，从而增加了扩散阻力，减缓了释放速率。在释药率方面，直径5 mm骨水泥小球的14 d药物累计释放率高于直径7 mm骨水泥小球，因此，在临床应用中可优先考虑5 mm直径骨水泥小球，既可迅速释放药物又可维持较长时间的稳定治疗浓度。
3.6 该研究的局限性在抗菌活性方面，此次研究未就糖尿病足感染的常见耐药菌铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等进行载药骨水泥体外微生物学研究，并且以硫酸多粘菌素B的血药质量浓度参考范围“2-4 μg/mL”作为载药骨水泥局部有效抗菌浓度的参考有一定片面性，仍需进一步探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程