2.1   RHC的发酵及纯化   5 L发酵罐中进行RHC的重组表达，当菌液A600达到70后，加入终浓度0.5 mmol/L 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，诱导17 h结束发酵。在诱导后12，14，17 h取样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达，如图 3所示，诱导结束时A600达到了150，并且3个批次菌体生长趋势一致。经计算，RHC表达量达到了10 g/L，箭头所指为目的蛋白条带。
菌体重悬后，经过破菌预处理，上清中的宿主细胞蛋白去除效果明显，再经过亲和层析和离子交换层析后蛋白纯度已经达到95%以上。如图4A所示，菌体重悬破菌后记为全菌；经预处理离心后的上清记为上清，沉淀记为沉淀；流穿为亲和层析的流穿液；P1为亲和层析的洗脱液；置换和置换过滤分别为P1用切向流超滤置换为SPA缓冲液后的溶液及其经过0.22 μm滤膜的滤液；SP1为离子交换的洗脱溶液；脱盐和脱盐过滤为SP1经过切向流超滤脱盐后的溶液及经过0.22 μm滤膜过滤后的溶液。目的蛋白主带在75 kD附近。在50 kD附近有一条较弱的条带，尝试多种方法不能有效去除，将上述条带切下后，委托上海中科新生命对其按照肽段覆盖率中的方法进行序列分析鉴定为目的蛋白的降解产物。
用EK酶切除RHC的组氨酸标签后，RHC的分子质量会变小(减小了1.56 kD)，如图4B所示，RHC经EK酶切后分子质量有轻微下降，说明组氨酸标签酶切成功。




2.2   重组人Ⅲ型胶原蛋白杂质残留检测结果   
2.2.1   外源性DNA残留量   外源性DNA残留量主要是胶原蛋白在表达及纯化过程中残留的宿主DNA，如果有外源性DNA的残留会有潜在的风险，包括感染、致癌性、免疫原性和致突变作用。
根据《中华人民共和国药典》(2020年版)和《YY/T 1849-2022 重组胶原蛋白》，参考注射用人生长激素的要求，将产品的外源性DNA残留量确定为≤1.5 ng/mg。按照《中华人民共和国药典》(2020年版)外源性DNA残留量测定法“定量PCR法”进行测定时，外源性DNA残留量应为≤1.5 ng/mg。3个批次样品的检测结果分别为1.13，1.05 和1.11 ng/mg，均小于标准值。
2.2.2   大肠杆菌蛋白质残留量   宿主细胞蛋白是蛋白纯化过程中的主要杂质之一，它们可能对患者的健康产生影响。宿主细胞蛋白在人体中可能会有生物活性，如果宿主细胞蛋白有蛋白酶活性就可能会通过降解蛋白本身或者蛋白稳定剂影响产品的稳定性。在极端情况下，宿主细胞蛋白会引起潜在的不良反应，如免疫反应或形成抗药物抗体等。根据YY/T 1849-2022 《重组胶原蛋白》对大肠杆菌蛋白质的要求，将其残留量定为< 0.1%。按照《中华人民共和国药典》(2020年版)酶联免疫试剂盒进行测定时，大肠杆菌蛋白质残留量应< 0.1%。3个批次样品的检测结果分别为2.237×10-5%，1.543×10-5%和2.125×10-5%，纯化产品的宿主细胞蛋白残留远低于标准所规定的0.1%。
2.3   重组人Ⅲ型胶原蛋白的结构表征结果   
2.3.1   肽段覆盖率   样品经还原酶解后液相色谱-质谱检测图谱，见图 5。液质检测数据经软件检索理论序列数据库和匹配分析，酶解产物肽段覆盖率图谱见图6(阴影部分为覆盖的序列)，胰蛋白酶酶解的覆盖率为97.6%，蛋白内切酶和谷氨酰内肽酶酶解的覆盖率均为100%。合并分析后，鉴定肽段与理论氨基酸序列的肽段覆盖率为100%，说明表达产物的序列与理论序列完全一致，目的产物得到了正确表达。







2.3.2   分子质量   RHC由579个氨基酸组成，理论分子质量为52 912.33 Da。样品经高效液相色分离后，用高分辨质谱仪检测RHC分子质量，数据去卷积后汇总分子量信息见表3。由于存在部分谷胱甘肽和葡糖苷化修饰，观测到53 217.3，53 395.4 和53 574.1 Da 3个分子质量，进一步确认了目的蛋白得到了正确表达。



2.3.3   二硫键分析   样品经胰蛋白酶酶切后，经高效液相色谱脱盐及分离后采用高分辨质谱仪进行检测扫描质谱分析，所得肽段相关质谱检测总离子色谱图见图 7。
所得质谱数据经软件分析，共鉴定到1对信号强度较高二硫键以及一条存在葡糖苷化修饰的半胱氨酸的肽段，鉴定结果见表4，质谱鉴定图谱见图8，9。共鉴定到1对二硫键，即C579-C579，占比15.14%。在胶原蛋白序列中仅在C端有一个半胱氨酸，因此只能形成链间的一个二硫键。
















2.3.4   热稳定性   样品的热稳定分析检测图谱见图10，样品的熔解温度为79.72 ℃。熔解温度指样品从有序状态转变为无序状态(如蛋白质变性或聚合物熔融)的温度。对于蛋白质，熔解温度是其热变性的中点温度，此时蛋白质的折叠和未折叠状态处于平衡。熔解温度值越高，表明样品的热稳定性越好。



2.4   重组人Ⅲ型胶原蛋白的安全性评价结果   
2.4.1   皮内反应实验   在此次实验条件下，重组人Ⅲ型胶原蛋白实验液在兔体内只在注射24 h时有极轻微水肿(勉强可见)，最终记分为0.3(≤1.0)，评分统计结果见表5。根据记分标准，此次研究制备重组人Ⅲ型胶原蛋白不具有皮肤刺激性。



2.4.2   皮肤致敏实验   在此次实验条件下，按Magnusson和Kligman分级标准进行评分，注射24，48 h，所有小鼠皮肤Magnusson和Kligman分级标准评分均为0，说明重组Ⅲ型人源化胶原蛋白实验液未导致豚鼠出现皮肤致敏反应。
2.4.3   急性全身毒性实验体质量：注射后 24，48，72 h，所有动物体质量均有增加，相同时间下实验组与对照组小鼠体质量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图11，说明重组Ⅲ型人源化胶原蛋白不影响动物的生长。
临床观察：根据表2所示的临床观察项目，整个实验过程中所有动物均未见异常症状。
在此次实验条件下，实验组与对照组小鼠均未见死亡和异常症状，所有动物体质量均有增加。实验结果表明，重组人Ⅲ型胶原蛋白未引发明显的急性全身毒性反应。




2.4.4   细胞效应   MTT检测显示，1，2，3，4 ，5 mg/mL RHC或RHC-EK均可促进角质形成细胞HaCaT增殖，并且相同浓度下的RHC与RHC-EK促细胞增殖效果无明显差异，如图12A所示。选择2 mg/mL和3 mg/mL的 RHC或RHC-EK进行进角质形成细胞HaCaT迁移实验，结果显示，相对于空白组，2 mg/mL和3 mg/mL的 RHC或RHC-EK可促进角质形成细胞HaCaT迁移，并且相同质量浓度下的RHC和RHC-EK促细胞迁移结果无明显差异，见图12B，C。以上数据说明，组氨酸标签的存在并没有影响RHC的细胞活性。

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胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，约占总蛋白的30%、皮肤干质量的3/4，是细胞外基质中含量最丰富的成分[1-2]。胶原蛋白家族包含28个成员，每个成员都至少含有一个三螺旋结构域。胶原蛋白沉积在细胞外基质中，并且大多数会形成超分子聚集体[1，3]。胶原蛋白主要分布于人体皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、心血管等部位，与组织形成和支撑、细胞间信息传递密切相关，在关节润滑、伤口愈合、血液凝固以及细胞衰老等过程中起着重要作用[4-5]。胶原蛋白因优良的生物学特性在医学材料、化妆品、食品工业中均有广泛应用[6-10]。
胶原蛋白一般从软骨、皮肤和肌腱等组织中提取获得，提取方法有酸法、碱法和酶解法等。胶原提取技术的难点在于动物源性材料的病毒灭活、产品纯度的提高以及原料供应的受限等[11-12]。随着生物工程技术的进展，重组胶原蛋白的研发成为当前的研究热点之一。由国家药品监督管理局提出，归口中国食品药品检定研究院的YY/T 1849-2022《重组胶原蛋白》[13]、归口国家药监局医疗器械技术审评中心的YY/T 1888-2023《重组人源化胶原蛋白》相继发布[14]，中国重组胶原蛋白产品的开发和应用进入了快车道。如何提高重组胶原蛋白的产量、降低生产成本，提高产品的稳定性以及保证产品的安全性[15-16]，一直是研究的重点。
目前实现产业化的重组胶原蛋白多使用大肠杆菌或毕赤酵母作为宿主菌，大肠杆菌的胶原蛋白产量高，但存在内毒素残留风险，而酵母诱导表达需要使用甲醇，存在安全生产隐患[16]。刘迪等[17]用酵母菌GS115表达人Ⅰ型胶原蛋白α1链部分胶原域片段，通过融合端肽方法使得到的类胶原热变性温度提高到39.9 ℃，高于人体温度37 ℃，并且具有良好的生物相容性，具有较高应用潜力。滕飞等[18]通过将人Ⅰ型胶原蛋白与SUMO和6×His标签在大肠杆菌中融合表达，在5 L发酵规模实现了1.43 g/L
的产量。WANG等[19]通过多层面系统优化策略，在毕赤酵母中实现了重组人Ⅲ型胶原蛋白α1的高水平分泌表达，最终在5 L发酵罐中达到了10.3 g/L的产量，并且重组人Ⅲ型胶原蛋白α1展现出显著的抗氧化能力和良好的生物活性，为它在生物医学材料领域的应用奠定了基础。
通过重组表达方式获得胶原蛋白避免了病原体传播的风险，并且生产过程更加灵活、可控[19-24]。表达的蛋白需要进行有效纯化才能符合医疗、美容等领域的应用标准，纯化过程中的杂质去除对于产品的安全性至关重要，尤其是对内毒素和宿主细胞蛋白的去除[25]。为了纯化目的，通常会在蛋白的N端或C端添加特定的融合标签[26-28]，常用的标签包括组氨酸标签、谷胱甘肽S转移酶、麦芽糖结合蛋白和硫氧还蛋白等[29-30]。组氨酸标签在固定化金属亲和层析实验中用于分离重组蛋白已经成为一种常用方法。含组氨酸标签的融合蛋白可以利用固定化金属亲和层析通过简单步骤进行纯化，并且组氨酸标签很少会影响蛋白质的特性[31]。
关于胶原蛋白重组表达的研究有很多，但是缺少系统的菌种构建、结构表征、质量研究和安全性评价相关的报道。此次研究构建了表达人Ⅲ型胶原蛋白的大肠杆菌工程菌，经过高密度发酵及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，经过固定化金属亲和层析和离子交换层析纯化获得重组人Ⅲ型胶原蛋白，对纯品的杂质残留和结构进行了检测和表征，并评价了产品的安全性，产品性能完全符合医疗器械原料和化妆品原料的需求。

1.1   设计   重组人Ⅲ型胶原蛋白工程菌构建、发酵纯化、残留检测、结构表征和生物安全性评价。研究设计方案见图1。

1.2   时间及地点   实验于2020年6月至2024年5月在河北纳科生物科技有限公司完成。
1.3   材料
1.3.1   主要试剂   pET-30a(+)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，大肠杆菌E. coli DH5(α)、BL21(DE3)感受态和质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，蛋白胨、酵母粉购自OXOID，琼脂糖购自Invitrogen，硫酸卡那霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷购自索莱宝，丙三醇、氯化钠、三羟基氨基甲烷、咪唑购自天津永大化学试剂有限公司，SDS-PAGE试剂盒 Biosharp，大肠杆菌宿主细胞蛋白酶联免疫试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，弗氏完全佐剂、MTT购自Sigma-Aldrich，DMEM培养基购自武汉塞维尔，MEM基本培养基购自普诺赛，胎牛血清购自ExCell Bio，异丙醇购自天津大茂化学试剂厂。
1.3.2   主要仪器   摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；蛋白电泳仪(BIO-RAD)；凝胶成像仪(广州博鹭腾生物科技有限公司)；均质机[安拓思纳米技术(苏州)有限公司]；蛋白层析系统(Cytiva)；差示扫描量热仪(Q600，TA Instruments)。
1.4   实验方法   
1.4.1   重组人Ⅲ型胶原蛋白的制备
菌种构建：根据人Ⅲ型胶原蛋白α1链的氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot：P02461.4)，选择(168-377)×2和1 050-1 196两段序列进行拼接，在N端添加MHHHHHHDDDDK序列，C端添加终止子构建重组胶原蛋白序列。进行密码子优化后，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成上述基因，通过NdeⅠ和Kpn Ⅰ酶切位点链接到pET-30a(+)质粒中，记为pET-30a(+)-RHC，并转化到大肠杆菌DH5α感受态中。将DH5α在LB培养基中培养增菌，按照质粒小提试剂盒的步骤提取质粒，转化至BL21 (DE3)感受态中，加入900 μL不含抗生素的LB培养基，37 ℃
摇床振荡(150 r/min)培养45 min。再吸取100 μL上述感受态细胞加到含50 μg/mL卡那霉素的LB固体琼脂培养基上，涂布均匀后于37 ℃倒置培养12-16 h。
发酵：挑取单克隆，接入含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37 ℃振荡(180 r/min)过夜培养，至菌液A600 nm约为3，按3%-5%接种量接种至5 L发酵罐中，设定pH=7.0、溶解氧为30%，当A600 nm达到70后加入终浓度0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导17 h，结束发酵，12 000×g离心20 min后收集菌体。
提取纯化：将菌体用A液(20 mmol/L 三羟基氨基甲烷，500 mmol/L  NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH=7.5)按1∶10比例重悬后用均质机将菌体破碎，预处理澄清后，经Ni IMAC亲和层析和SP离子交换两步蛋白层析纯化后，通过切向流超滤用纯化水置换溶液中的盐，冻干，得到提纯的重组人Ⅲ型胶原蛋白冻干品，标记为RHC。亲和层析A液：20 mmol/L三羟基氨基甲烷，500 mmol/L  NaCl，20 mmol/L咪唑，pH=7.5；亲和层析B液：20 mmol/L三羟基氨基甲烷，500 mmol/L  NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH=7.5；离子交换A液：20 mmol/L 三羟基氨基甲烷，pH=7.5；离子交换B液：20 mmol/L三羟基氨基甲烷，1 mol/L  NaCl，pH=7.5。
酶切：用20 mmol/L 三羟基氨基甲烷-HCl、50 mmol/L NaCl(pH=7.4)与2.5 mmol/L CaCl2溶解上述重组胶原冻干品，终质量浓度5 mg/mL，EK酶和重组胶原蛋白溶液按体积比1∶100的比例加入EK酶，30 ℃酶解16 h。然后经Ni IMAC亲和层析收集流穿液，切向流超滤冻干，酶切冻干品标记为RHC-EK。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：发酵、提取纯化和酶切后的样品，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)“电泳法”的“SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳法”进行检测，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。发酵样品按公式v=5 000/A600计算得到的体积(µL)，取发酵菌液，离心后收集菌体，加入100 μL纯化水和25 μL上样缓冲液，于100 ℃加热10 min后取5 μL上样；纯化样品取40 μL样品，加入10 μL上样缓冲液，于10 ℃加热10 min，调整蛋白上样量为10 μg。初始电压为80 V，进入分离胶时调至150-200 V，当溴酚蓝迁移胶底处停止电泳。分离胶置考马斯亮蓝染色液中染色10 min，置脱色液中脱色，直至背景透明后用凝胶成像系统成像。
杂质残留：对RHC的杂质残留进行研究，主要包括外源性DNA残留、大肠杆菌蛋白质残留和细菌内毒素。①外源性DNA残留量：取样品10 mg，加纯化水制成质量浓度为10 mg/mL的溶液，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)“外源性DNA残留量测定法“定量PCR法”进行测定。大肠埃希菌探针：5’FAM-CGG TGC TGC GAC GGC GGA GT-TAMRA3’，正向引物：5’GAA AGT AAC ACC AGC GTG CG-3’，反向引物：5’CCA ATG CAT TAA CGC TGG CA-3’。②大肠杆菌蛋白质残留量：取样品10 mg，加纯化水制成质量浓度为10 mg/mL的溶液，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)“酶联免疫吸附法”进行测定。③细菌内毒素：取样品，溶于内毒素检查用水，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)“细菌内毒素检查法” 规定的方法测定。
1.4.2   重组人Ⅲ型胶原蛋白的结构表征   根据YY/T 1849-2022《重组胶原蛋白》和YY/T 1888-2023《重组人源化胶原蛋白》，委托上海中科新生命生物科技有限公司对RHC进行结构表征研究。
肽段覆盖率：称取适量样品，加入150 mmol/L 三羟基氨基甲烷-HCl(pH=7.8)溶解至 1 mg/mL，95 ℃变性15 min，冷却后，分别加入胰蛋白酶(50∶1)、蛋白内切酶(50∶1)、谷氨酰内肽酶(25∶1)于37 ℃酶切 6 h。样品酶解产物采用液相系统进行分离，色谱分离肽段采用高分辨质谱仪进行扫描质谱分析，分析时长：75 min，检测方式：正离子(MSE)，母离子扫描范围：300-2 000 m/z。原始数据采用UNIFI软件进行数据分析，以样品理论序列进行肽段匹配鉴定。
分子质量：采用超高效液相色谱仪进行色谱分离，再采用高分辨质谱仪检测分子质量，检测时长 10 min，检测模式为正离子，扫描范围为 500-4 000 m/z。原始数据由UNIFI软件进行分析。
二硫键分析：称取适量样品，加入150 mmol/L 三羟基氨基甲烷-HCl(pH=7.8)溶解至1 mg/mL，95 ℃变性15 min，冷却后，胰蛋白酶(50∶1)于37 ℃酶切 6 h，酶解产物经高效液相色谱脱盐及分离后采用高分辨质谱仪进行扫描质谱分析，分析时长：75 min，检测方式：正离子(MSE)，母离子扫描范围：300-2 000 m/z。质谱采集数据采用 UNIFI V1.9.4 (Waters)软件进行理论二硫键肽段数据检索和还原前后比对验证分析。
热稳定性：通过差示扫描量热仪(选择温度为20-200 ℃，升温速度为2 ℃/min)对样品进行扫描检测，通过仪器自带分析软件分析测定样品数据。
1.4.3   重组人Ⅲ型胶原蛋白的生物安全性评价   根据GB/T 16886《医疗器械生物学评价》系列标准，委托山东省医疗器械和药品包装检验研究院对RHC的皮内反应、皮肤致敏和急性全身毒性进行评价。实验方案已通过山东省医疗器械和药品包装检验研究院实验动物伦理委员会批准。实验过程中严格遵循动物伦理委员会的标准对动物进行处置。
(1)皮内反应实验：采用3只初成年雄新西兰兔，购自济南金丰实验动物有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20230008，体质量≥2 kg，采用耳标法进行标记。皮内反应实验根据国家标准 GB/T16886.10-2017《医疗器械生物学评价 第10部分：刺激与皮肤致敏试验》的规定进行，以评价实验样品在实验条件下产生刺激反应的潜能。
取实验试验样品，用生理盐水配制成4 mg/mL的溶液作为实验液，以生理盐水作为空白对照液。实验开始前彻底去除兔背部脊柱两侧足够面积的被毛，作为实验和观察部位。在每只兔脊柱左侧去毛区5个点皮内注射0.2 mL实验液，右侧5个点皮内注射0.2 mL空白对照液。于注射后(24±2)，(48±2)和(72±2) h对注射部位红斑和水肿进行评分，评分标准见表1。将每只动物实验样品或空白对照的(24±2)，(48±2)和(72±2) h的全部红斑与水肿记分相加，再除以15[3(记分时间点)×5(实验样品或空白对照注射点)]，计算出每只动物实验样品或空白对照的记分。3只动物记分相加后除以3得出每一实验样品和相应空白对照的总平均记分。实验样品记分减去空白对照记分可得出实验样品最终记分，如实验样品最终记分≤1.0则符合实验要求。

(2)皮肤致敏实验：依据国家标准 GB/T16886.10-2017《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》，对实验样品进行皮肤致敏最大剂量实验，以评价实验样品在试验条件下使豚鼠产生皮肤致敏反应的潜能。
取实验样品，用生理盐水配制成4 mg/mL的溶液作为实验液，阴性对照为生理盐水。实验选15只Hartley白化豚鼠，购自济南金丰实验动物有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20230008，体质量300-400 g，雌雄不拘，其中对照组5只，实验组10只，采用染色法进行标记。实验前1 d去除豚鼠背部的毛发。
实验分皮内诱导阶段、局部诱导阶段和激发阶段3部分。①皮内诱导阶段：在每只动物肩胛骨内侧皮内注射(图 2)：部位A，注射弗氏完全佐剂与阴性对照以1∶1体积比混合的稳定性乳化剂0.1 mL；部位B，实验组注射实验样品，对照组注射阴性对照，体积0.1 mL；部位C，实验组注射实验样品与稳定性乳化剂1∶1体积比的混合液，对照组注射阴性对照与弗氏完全佐剂配置成的乳化剂，体积0.1 mL。②局部诱导阶段：皮内诱导阶段后7 d，未产生刺激反应的动物，在局部敷贴应用前(24±2) h，实验区用10% 十二烷基磺酸钠进行预处理，按摩导入皮肤；产生刺激反应的动物，不需要进行预处理。皮内诱导阶段后8 d，实验组将约8 cm2的滤纸片用实验液浸透后覆盖皮内注射点，用胶带封闭固定，(48±2) h后去除固定胶带及滤纸片；对照组动物使用阴性对照进行同法操作。③激发阶段：局部诱导阶段后14 d，用实验样品激发全部实验动物和对照动物，按部位C选定的浓度，将适宜的敷贴片置于实验样品或阴性对照中浸透，贴敷于每只动物的腹部剃毛区，用胶带封闭固定，(24±2) h后除去固定胶带及滤纸片。去除滤纸片后 (24±2) h和(48±2) h，观察并记录所有动物激发部位皮肤情况，按Magnusson 和 Kligman 分级标准进行描述并分级，无明显改变为0分，散发性或斑点状红斑为1分，中度融合性红斑为2分，重度红斑和/或红肿为3分。

(3)急性全身毒性实验：依据国家标准GB/T16886.11-2021《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验》方法，对试验液进行急性全身毒性实验。实验选用10只昆明种小鼠，体质量17-23 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)2019-0003。实验前先将小鼠标记并称质量，随机分为实验组和介质对照组，每组5只小鼠。实验样品用生理盐水配制成4 mg/mL的溶液作为实验液，介质对照为生理盐水。实验组小鼠尾静脉注射实验液50 mL/kg，介质对照组小鼠尾静脉注射生理盐水50 mL/kg。注射后立即、4 h、24 h、48 h和 72 h观察和记录所有动物状态(表2)和死亡动物数。注射后24，48，72 h对所有动物进行称质量，并做好记录。

(4)细胞效应实验
促细胞增殖效应：将角质形成细胞HaCaT(海星生物)接种于96孔板中，细胞浓度为1×108 L-1，体积100 μL，在37 ℃、体积分数5% CO2、湿度大于90%条件下培养24 h，吸出培养基，分组培养：空白组加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基)，实验组加入含1，2，3，4 ，5 mg/mL RHC或RHC-EK的完全培养基，每组5个重复孔。用无酚红MEM基本培养基配置1 mg/mL的MTT溶液。培养24 h后，小心移去96孔板中的培养基，每孔加入50 μL MTT溶液于37 ℃孵育2 h；弃去MTT溶液，每孔加入100 μL异丙醇，振荡平板10 min，于570 nm波长处测定吸光度(A)值。单独设置只含有异丙醇的对照孔排除异丙醇自身A值产生的实验误差。
细胞活力(%)=(A实验组-A对照组)/(A空白组-A对照组)×100%
促细胞迁移效应：将角质形成细胞HaCaT接种于24孔板中，细胞密度为(5-15)×105/孔，在37 ℃、5% CO2、湿度大于90%条件下培养24 h后，用200 μL枪头对准孔板底部，向下轻推纵向划线形成划痕，用PBS漂洗细胞3次，去除划掉的细胞，分组培养：空白组加入DMEM培养基，实验组分别加入含2，3 mg/mL RHC或RHC-EK的DMEM培养基，每组3个重复孔。培养0，24，48 h后，在40倍显微镜下拍照，每孔获得9个部位的照片，利用Image J软件对照片中“划痕”区域进行面积量化并统计。
1.5   主要观察指标   重组人Ⅲ型胶原蛋白的杂质残留、结构和安全性检测结果。
1.6   统计学分析   所有数据使用SPSS 25.0软件进行分析处理，所有数据均表示为平均值±标准误差，使用t检验分析两组数据之间的差异。在P < 0.05 时差异有显著性意义。该文统计学方法已经河北科技大学生物统计学专家审核。

胶原蛋白作为一个传统的生物医用材料，在医疗、美容等领域应用广泛，但是提取的胶原因蛋白存在水溶性差、具有传播病毒的风险等诸多问题。通过生物工程技术获得胶原蛋白，通过对氨基酸序列的调整赋予了其更好的水溶性，并规避了病毒传播的风险。重组胶原蛋白产业在中国蓬勃发展，为了规范市场，监管部门相继发布了YY/T 1849-2022《重组胶原蛋白》和YY/T 1888-2023《重组人源化胶原蛋白》2个行业标准[13-14]，明确了用于医疗器械的重组胶原蛋白质量要求。此次研究构建了表达重组胶原蛋白的大肠杆菌工程菌，在5 L发酵罐水平实现了10 g/L的产量，达到文献中报道的较高水平[22]。同时按照上述2个标准的要求，对纯化后的胶原蛋白进行了全面质量研究、结构表征和安全性评价，该文中选取其中关键性指标进行了论述。
分离纯化是保证重组胶原蛋白产品质量的关键步骤。宿主细胞蛋白是宿主细胞内源性表达的蛋白质，具有重要的细胞功能。作为非预期的工艺杂质，在下游纯化过程中需要对宿主细胞蛋白进行控制。然而，某些宿主细胞蛋白难以去除，因为它们在下游纯化过程中与治疗性蛋白发生强烈相互作用并共同被纯化。宿主细胞蛋白一直是生物制品安全性的重要话题，因为它们可能会影响患者安全以及产品的质量、效力和效能[32]。宿主细胞DNA是指用于生产生物制品宿主细胞来源生物样本中存在的总DNA及其片段。在药物产品中不应含有宿主细胞DNA，因为它可能会影响产品的安全性。宿主细胞DNA的主要安全性问题包括：通过癌基因的引入/激活而导致的致癌性(哺乳动物宿主细胞)、传染性病毒DNA的引入(哺乳动物宿主细胞)以及免疫原性(细菌宿主细胞)[32-35]。此次研究通过固定化金属亲和层析和离子交换实现了对重组人Ⅲ型胶原蛋白的有效纯化，同时对外源性DNA残留量、大肠杆菌蛋白质残留量和细菌内毒素的残留进行了检测，均达到了行业标准相关的要求。
质量肽图分析是蛋白质一级结构研究中极为重要的手段之一，不但可以比较重组与天然蛋白质结果之间的一致性，确认基因工程上游和下游处理过程中是否发生差错、重组产物中是否存在后转译化学修饰及未预期氨基酸的变异等，而且不同批次产品的肽谱比较可验证工艺过程的稳定性[36]。因此，肽谱分析在生物医药产品质控中尤为重要。肽段覆盖率分析证明表达产物的核酸序列与理论序列完全一致。通过液质联用观测到RHC的分子质量，由于存在部分谷胱甘肽和葡糖苷化修饰，观测到53 217.3，53 395.4和53 574.1 Da 3个分子质量。在胶原蛋白的C末端存在一个半胱氨酸，因此检测到了部分C579-C579分子间的二硫键。差示扫描量热法是一种热力学技术，用于测量热容随温度的变化，已被广泛用于研究蛋白质的热力学、折叠和相互作用；此外，它还被生物制药行业用于在制剂和产品开发过程中表征蛋白质的热稳定性、整体构象以及结构域折叠的完整性[37]。通过差示扫描量热法检测重组人Ⅲ型胶原蛋白的熔解温度为79.72 ℃，远高于人体体温，具有更好的体内热稳定性。
多年来，组氨酸标签的使用一直是通过固定化金属亲和层析分离重组蛋白的常用手段，它们在提高粗细胞裂解液中蛋白纯度方面具有广泛优势[29]。蛋白质一般被设计为包含特定蛋白酶的切割位点，例如烟草蚀刻病毒蛋白酶识别的位点。一旦标签被切割，蛋白质通常仅留下几个额外的氨基酸[38]。理想情况下，去除标签后应得到一种与天然蛋白质活性或功能相似的蛋白质。由于组氨酸标签的尺寸相对较小，人们普遍认为它们不会显著干扰大多数蛋白质的功能和结构[31，39]，然而，越来越多的报道显示这一默认假设可能并不成立[40-42]。BOOTH等[29]研究了组氨酸标签对10个蛋白热稳定性的影响，4种蛋白质的热稳定性结果并未因组氨酸标签的切割而受到显著影响，组氨酸标签增加了一种蛋白的热稳定性，降低了其他5种蛋白的热稳定性。
DHDHDHHHHHH 是一种富含组氨酸的基序，存在于所有生物界中许多能够结合铜(Ⅱ)、锌(Ⅱ)和镍(Ⅱ)的蛋白质中[43]。通过在NCBI蛋白质数据库BLAST检索含有HHHHHH的人源蛋白质，检索到99条结果，表6为含HHHHHH人源蛋白的摘选。检索结果表明HHHHHH天然存在于人体中，但是由于蛋白质具有高级结构，因此含组氨酸标签重组蛋白的安全性需要单独去评价，不能一概而论。    

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

此次研究系统阐述了重组胶原蛋白菌种构建、生产工艺、结构表征、质量研究和安全性评价相关研究。研究成功构建了重组III型人源化胶原蛋白的高表达大肠杆菌菌株，在5 L发酵罐中产量达10 g/L，处于较高水平。通过IMAC亲和层析和离子交换层析纯化后，产品纯度超95%，并且外源性DNA、宿主细胞蛋白残留及细菌内毒素均符合标准。结构表征显示，产物肽段覆盖率为100%，分子质量与理论一致，热稳定性好(Tm值79.72℃)，远高于体温。安全性评价结果表明，产品在皮内反应、皮肤致敏及急性全身毒性实验中均表现安全。此外，组氨酸标签(His-Tag)对重组胶原蛋白的细胞增殖和迁移效应无显著影响。该研究为重组胶原蛋白的高效生产、纯化及质量研究提供了重要参考，将推动其在医疗、美容等领域的广泛应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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