细胞周期蛋白依赖性激酶7抑制剂THZ1对脑胶质瘤干细胞干性的调控及机制

doi:10.12307/2025.528

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5374-5381.doi: 10.12307/2025.528

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

细胞周期蛋白依赖性激酶7抑制剂THZ1对脑胶质瘤干细胞干性的调控及机制

虎恩喜1，何文莹2，陶翔1，杜沛静1，王立斌1，3

1宁夏医科大学第一临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；2宁夏医科大学基础医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；3华中科技大学协和深圳医院，广东省深圳市 518000

收稿日期:2024-05-15 接受日期:2024-07-10 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-25
通讯作者: 王立斌，博士，教授，宁夏医科大学第一临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；华中科技大学协和深圳医院，广东省深圳市 518000
作者简介:虎恩喜，女，1999年生，贵州省威宁彝族回族苗族自治县人，回族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事肿瘤细胞生物学相关研究。
基金资助:
深圳市科创委基础研究面上项目(深圳自然科学基金)(JCYJ20230807115807015)，项目负责人：王立斌；国家自然科学基金项目(82260610)，项目负责人：王立斌；宁夏医科大学校级教育教学改革研究重点项目(NYJY2022011)，项目负责人：王立斌

Regulation of THZ1, an inhibitor of cyclin-dependent kinase 7, on stemness of glioma stem cells and its mechanism

Hu Enxi1, He Wenying2, Tao Xiang1, Du Peijing1, Wang Libin1, 3

1First Clinical Medical College of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Basic Medicine College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Union Shenzhen Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Received:2024-05-15 Accepted:2024-07-10 Online:2025-09-08 Published:2024-12-25
Contact: Wang Libin, MD, Professor, First Clinical Medical College of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Union Shenzhen Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
About author:Hu Enxi, Master candidate, First Clinical Medical College of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
Shenzhen Science and Technology Innovation Commission Basic Research General Project (Shenzhen Natural Science Foundation), No. JCYJ20230807115807015 (to WLB); National Natural Science Foundation of China, No. 82260610 (to WLB); Key Project of Ningxia Medical University-Level Education and Teaching Reform Research, No. NYJY2022011 (to WLB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

THZ1：是细胞周期蛋白依赖性激酶7的一种选择性共价抑制剂，具有抗肿瘤作用。作为一种极具抗癌潜力的小分子抑制剂，可以通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶7而抑制细胞周期，同时抑制细胞周期蛋白依赖性激酶7与转录因子结合，阻断RNA聚合酶Ⅱ激活，调控基因转录过程；在表观遗传研究中，THZ1可以减弱超级增强子对靶基因转录的促进作用，从而抑制癌基因的表达。
肿瘤干细胞：是一群存在于异质性肿瘤组织中的细胞亚群，具有多谱系分化的特征。肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力，对肿瘤存活、远处转移、治疗耐药性及复发有重要作用，是癌症发生发展的重要驱动因素，也是导致癌症治疗失败的重要原因。
Wnt/β-catenin信号通路：也称为经典Wnt信号通路，是一种保守的信号转导轴，参与细胞多种生理过程，如增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭和组织稳态。目前已有研究报道该信号通路的活化与肿瘤干细胞形成和上皮-间充质转化过程相关，当细胞质中β-catenin水平升高时，其转运入核并与TCF/LEF转录因子家族成员结合，取代辅助抑制因子并招募转录因子和转录辅助激活因子，促进Myc、细胞周期蛋白D1等多种癌基因表达。

摘要
背景：THZ1是一种细胞周期蛋白依赖性激酶7的抑制剂，可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，但THZ1是否可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响脑胶质瘤干细胞的干性尚不清楚。
目的：探究THZ1对脑胶质瘤细胞U87干性的影响及机制。
方法：培养脑胶质瘤细胞U87形成干细胞球并通过Western blot验证干性相关蛋白的表达；采用CCK-8法检测THZ1作用于U87细胞的半数抑制浓度(IC50)；通过克隆实验、划痕实验、Transwell迁移实验确定THZ1对U87细胞增殖、迁移的影响；分析THZ1处理对U87干细胞成球率及干细胞球体大小的影响；Western blot检测干性相关蛋白CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2和上皮-间充质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Occludin、Snail以及Wnt/β-catenin通路相关蛋白Axin1、β-Catenin、Wnt-5a、GSK3β、Cyclind-1、C-myc的表达变化。
结果与结论：①与贴壁细胞相比，U87干细胞干性相关蛋白Nestin、CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2表达明显升高；②与对照组相比，THZ1减弱了U87细胞的增殖和迁移能力；③THZ1抑制U87干细胞成球率及球体大小，下调干性相关蛋白的表达；④THZ1处理后，U87干细胞中N-cadherin、Snail蛋白表达降低，而E-cadherin、Occludin蛋白表达升高；⑤THZ1处理使U87干细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白Axin1、β-Catenin、Wnt-5a、GSK3β、Cyclind-1、C-myc表达降低。结果表明：THZ1通过下调Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达，抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖、迁移，抑制U87干细胞成球能力、干性相关蛋白表达和上皮-间充质转化能力。

https://orcid.org/0009-0004-6571-4343 (虎恩喜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: THZ1, 脑胶质瘤, 肿瘤干细胞, 成球实验, 干性标志物, Wnt/β-catenin信号通路, 上皮-间充质转化, 增殖, 迁移

Abstract: BACKGROUND: THZ1, an inhibitor of cyclin-dependent kinase 7, has been shown to inhibit the proliferation of a variety of tumor cells, but whether THZ1 can affect the stemness of glioma stem cells through the Wnt/β-catenin signaling pathway remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of THZ1 on stemness of glioma cell U87 and its mechanism.
METHODS: U87 adherent cells were cultured to form stem cell mammospheres. The expressions of stemness related proteins were verified by western blot assay. The effect of THZ1 on half maximal inhibitory concentration (IC50) of U87 cells was determined by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assays. The effects of THZ1 on proliferation and migration of U87 cells were determined by cell colony-formation assays, cell wound healing assays, and Transwell migration assays. The effect of THZ1 treatment on mammosphere forming rate and mammosphere size of U87 stem cells was analyzed. Stemness associated proteins CD133, ABCG2, Nanog, OCT4, SOX2, epithelial-mesenchymal transformation-related proteins E-cadherin, N-cadherin, Occludin, Snail, and Wnt/β-catenin pathway associated proteins Axin1, β-Catenin, WNT-5A, GSK3β, Cyclind-1, and C-myc were measured by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with adherent cells, the expressions of stemness related proteins Nestin, CD133, ABCG2, Nanog, OCT4, and SOX2 were significantly increased. (2) Compared with the control group, THZ1 decreased the proliferation and migration of U87 cells. (3) THZ1 inhibited the mammosphere forming rate and mammosphere size of U87 stem cells. (4) After THZ1 treatment, the expression of N-cadherin and Snail decreased, while the protein expression of E-cadherin and Occludin increased. (5) THZ1 treatment decreased the expression of Wnt/β-catenin pathway related proteins Axin1, β-Catenin, Wnt-5A, GSK3β, Cyclind-1, and C-myc in U87 stem cells. It is concluded that THZ1 can suppress the proliferation and migration of U87 cells, and inhibit the mammosphere forming ability, stemness related protein expression, and epithelial-mesenchymal transformation ability of U87 stem cells by down-regulating the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway related molecules.

Key words: THZ1, glioma, cancer stem cell, mammosphere culture, stemness marker, Wnt/β-catenin signaling pathway, epithelial-mesenchymal transformation, proliferation, migration

中图分类号:

虎恩喜, 何文莹, 陶翔, 杜沛静, 王立斌. 细胞周期蛋白依赖性激酶7抑制剂THZ1对脑胶质瘤干细胞干性的调控及机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5374-5381.

Hu Enxi, He Wenying, Tao Xiang, Du Peijing, Wang Libin. Regulation of THZ1, an inhibitor of cyclin-dependent kinase 7, on stemness of glioma stem cells and its mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5374-5381.

图/表（结果） 2

2.1 脑胶质瘤U87干细胞特性验证 脑胶质瘤U87细胞复苏培养贴壁后，显微镜下观察细胞呈典型的星形状、胞体较长，按1 000个/孔接种于超低黏附6孔板并用干细胞培养基进行培养，随着培养时间的延长，干细胞球体逐渐变大，可见遮光性好、中间密度高的干细胞球体，见图1A；将干细胞球体吹散后传代，收集第2代成球细胞进行Western blot验证干性蛋白的表达，结果显示：与贴壁细胞相比，第2代U87干细胞干性蛋白Nestin、CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2表达明显升高，见图1B，C，说明第2代成球细胞具有高表达干性蛋白的特征。
2.2 THZ1作用于U87细胞的IC50 根据预实验结果，设定THZ1浓度梯度为0，10，20，40，80，160，320，640，1 280，2 560 nmol/L，作用时间设为24，48 h，CCK-8结果显示THZ1作用24 h的IC50为159.7 nmol/L，见图2A，作用48 h的IC50为122.8 nmol/L，见图2B，考虑到药物的细胞毒作用，U87干细胞给药浓度为100 nmol/L。
2.3 THZ1抑制U87细胞增殖 CCK-8结果显示，随着THZ1作用浓度增加以及处理时间延长，其减弱U87细胞活力效应越显著。克隆形成实验结果显示，与对照组相比，THZ1浓度为50 nmol/L时，细胞集落数量明显减少，THZ1浓度为100 nmol/L时，细胞未形成集落，见图3A，B；说明THZ1可以抑制U87细胞增殖。
2.4 THZ1减弱U87细胞的迁移能力 细胞划痕愈合实验显示，与对照组相比，THZ1浓度为100，200 nmol/L时，12，24 h划痕愈合率依次下降，说明THZ1减弱U87细胞的水平迁移能力，见图4A，B；Transwell实验显示，随着THZ1作用浓度越高(0，100，200 nmol/L)，U87细胞从上室迁移到下室的细胞数越少，说明THZ1减弱U87细胞垂直迁移能力，见图4C，D。

2.5 THZ1减弱U87干细胞的干性 成球实验结果显示，100 nmol/L THZ1处理后，U87干细胞成球率及球体直径都低于对照组，图5A-C；进一步通过Western blot验证干性蛋白表达变化，结果显示THZ1组干性蛋白CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2表达明显低于对照组，见图5D，E。
2.6 THZ1下调U87干细胞上皮-间充质转化相关蛋白的表达 与对照组相比，THZ1处理U87干细胞48 h后上皮-间充质转化相关蛋白表达发生了改变，上皮相关蛋白E-cadherin、Occludin表达升高，而间质相关蛋白N-cadherin、Snail表达下降，见图6A，B，说明THZ1减弱了U87干细胞的上皮-间充质转化能力。
2.7 THZ1下调U87干细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达 THZ1组Axin1、β-Catenin、Wnt-5a、GSK3β、Cyclind-1、C-myc的表达都低于对照组，见图7A，B。

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引言

脑胶质瘤是神经系统最常见的恶性程度最高且侵袭性最强的原发性肿瘤[1]，尽管临床上对于脑胶质瘤的治疗已经有手术、放疗和化疗等手段，但因其恶性程度高、侵袭性强、发展速度快、高度遗传异质性以及部分肿瘤对化疗药物的耐药性，导致疗效不尽人意，预后总体来说仍然很差[2-3]。因此，寻找治疗脑胶质瘤的有效药物对于改善患者预后具有重要意义。
肿瘤干细胞是一群具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞，被认为是导致肿瘤异质性的决定因素之一[4]。肿瘤干细胞是肿瘤恶性进展的关键环节，在促进肿瘤细胞生长、耐药和远端转移方面发挥着核心作用[5]。研究表明，脑胶质瘤恶性程度与脑胶质瘤干细胞密切相关[6]。脑胶质瘤干细胞是胶质瘤治疗耐药和不良预后的重要因素[7]。而肿瘤干细胞的产生和维持与上皮-间充质转化过程密切相关[8]。上皮-间充质转化是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是肿瘤恶性进展的重要特征[9]，也是肿瘤治疗中一个极具吸引力的靶点[10]。Wnt/β-catenin通路的激活突变已经在许多癌症研究中被报道[11]，可以维持肿瘤干细胞自我更新[12]，促进肿瘤细胞上皮-间充质转化、增殖和转移[13]。
作为细胞周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinases 7，CDK7)的抑制剂，THZ1可以通过阻止细胞周期进展、干扰基因转录从而抑制多种肿瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡[14]，还可以抑制甲状腺癌、乳腺癌等多种癌症干细胞的增殖[15-16]。该研究探讨THZ1对胶质瘤细胞U87增殖、迁移、干细胞成球能力、干性和上皮-间充质转化的影响，旨在为脑胶质瘤的治疗提供思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 肿瘤细胞生物学实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年6月至2024年3月在宁夏医科大学总医院生物芯片中心完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 人脑胶质瘤细胞系U87购自中科院上海细胞库。
1.3.2 主要试剂和仪器 THZ1(MCE，HY-80013)；DMEM高糖培养基(GIBCO，11965092)；青链霉素混合液(GIBCO，15140148)；DMEM/F12培养基(GIBCO A4192002）；B-27™ 添加剂(GIBCO，12587010)； PBS(GIBCO，10010023)；胎牛血清(生航生物，BC-SE-FBS01)；表皮生长因子(Pepro，Tech 100-47)；碱性成纤维细胞生长因子(Pepro Tech，100-18B)；胰岛素(Sigma-Aldrich，11061-68-0)；T25细胞培养瓶(NEST，707003)；15 mL离心管(NEST，601002)；CCK-8 试剂盒(碧云天，C0038)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0011)；ECL化学发光试剂盒(碧云天，P0018M)；电泳液(赛维尔，G2081-15)；转膜液(赛维尔，G2028-15)；TBST溶液(赛维尔，G0004-1L)；快速封闭液(Genefist，GF1815)；一抗稀释液(贝茵莱，PW9216)；细胞培养箱(ESCO)；酶标仪(BioTek)；电泳仪(BIO-RAD)；

37 ℃水浴锅(常州越新)；凝胶成像仪(ProteinSimple)；生物安全柜(Thermo Scientific)；离心机(Dynamica)。抗体信息见表1。

1.4 实验方法
1.4.1 药物溶解用二甲基亚砜将THZ1溶解为10 mmol/L的储备液，分装并置于-80 ℃冰箱避光保存备用。
1.4.2 贴壁细胞培养 从液氮中取出U87细胞，于37 ℃水浴锅迅速解冻复苏，使用含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基(DMEM完全培养基)于37 ℃、体积分数5%CO2环境下常规培养，细胞融合至80%-90%时使用胰蛋白酶消化以传代，取对数生长期的细胞进行实验。
1.4.3 干细胞培养 在 DMEM/F12培养基中分别加入 B27 (1∶50)、青链霉素混合液 (1∶50)、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子以及 5 μg/L胰岛素配制干性培养基。将U87贴壁细胞消化、离心得到细胞沉淀，加入1 mL PBS洗涤并离心去除胎牛血清，按1 000个/孔接种于超低黏附6孔板用上述干性培养基进行培养，每隔2 d补加1 mL干性培养基，第4天换液，干细胞成球后第7天进行传代，传代后将其分为对照组和THZ1组，继续接种于超低黏附6孔板进行培养(1 000个/孔)，THZ1组加入100 nmol/L THZ1，对照组加入相同体积的二甲基亚砜，显微镜下观察并记录对照组和THZ1组干细胞再次成球过程，至传代后第7天统计球体数和球体直径，收集细胞提取蛋白并采用Western blot验证干性相关蛋白CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2和上皮-间充质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Occludin、Snail以及Wnt/β-catenin通路相关蛋白Axin1、β-Catenin、Wnt-5a、GSK3β、Cyclind-1、C-myc的表达。实验重复3次。
1.4.4 CCK-8法测定药物半数抑制浓度(IC50) 取对数生长期的U87细胞，按照5 000个/孔密度接种于96孔板，贴壁后按照浓度梯度用THZ1(0，10，20，40，80，160，320，640，1 280，2 560 nmol/L)进行处理，每个浓度设置6个复孔，培养24，48 h后，弃去原培养基，每孔加入90 μL完全培养基+10 μL CCK-8试剂，孵育1.5 h，用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。实验重复3次。
1.4.5 分组与给药 贴壁细胞于完全贴壁后给药，干细胞于传代24 h后给药，每次给药都设定等体积二甲基亚砜处理的细胞作为对照组。根据24 h的IC50为159.7 nmol/L，48 h IC50为122.8 nmol/L，考虑到集落形成实验培养时间较长，THZ1浓度设置为0，50，100 nmol/L，作用时间为72 h；划痕实验和Transwell迁移实验THZ1浓度设置为0，100，200 nmol/L，其余实验考虑到药物的细胞毒作用，THZ1浓度设置为100 nmol/L。
1.4.6 集落形成实验 取对数生长期的U87细胞按500个/孔密度均匀接种于6孔板，完全贴壁后加入THZ1 (0，50，100 nmol/L)处理72 h，然后将培养基更换为不含药物的完全培养基，培养15 d后，细胞集落长至肉眼可见，将6孔板从培养箱中取出，PBS洗涤2次，多聚甲醛固定1 h，每孔加入1 mL结晶紫染料染色15 min，自来水漂洗、晾干、拍照并统计集落数量，实验重复3次。
1.4.7 细胞划痕实验取对数生长期的U87细胞按5×105个/孔均匀接种于6孔板中，贴壁后加入THZ1 (0，100，200 nmol/L)，细胞长至融合度约60%时用200 μL枪头进行划痕，于0，12，24 h拍照记录划痕愈合过程。结果使用Image J软件进行分析，划痕愈合率=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%，实验重复3次。
1.4.8 Transwell垂直迁移实验 将对数生长期的U87细胞以5×105个/孔密度接种于6孔板中，贴壁后加入含有相应浓度THZ1(0，100，200 nmol/L)的培养基培养48 h，收集细胞并计数。使用孔径为8 μm的24孔Transwell板，加入不含血清的DMEM培养液制备U87单细胞悬液，取100 µL (1×105个)细胞悬液接种于Transwell上室，另取 600 μL含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养基加入下室，培养48 h后取出小室，去掉培养基，PBS清洗2次，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，蒸馏水清洗2次，用结晶紫染料染色15 min，蒸馏水清洗3次，将小室内膜上的细胞用棉签轻轻擦拭干净。倒置显微镜下观察拍照，使用Image J软件统计穿过小室底膜的细胞数。实验重复3次。
1.4.9 Western blot U87细胞诱导成球后第7天进行传代，接种在超低黏附6孔板内(1 000个/孔)，接种第2天给予100 nmol/L THZ1处理，培养至第7天收集对照组和THZ1组U87干细胞，加入适量裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF进行全蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，取蛋白上清液加入5×loading buffer经100 ℃煮沸，存于-80 ℃待用。蛋白样品经电泳、转膜后，使用快速封闭液封闭10 min，1×TBST洗涤5 min后放入按推荐比例稀释的一抗(表1)中4 ℃冰箱孵育过夜，第2天用1×TBST洗涤3次，每次10 min，使用稀释比例为1∶5 000的二抗孵育90 min，洗涤3次后进行显影，使用Image J软件进行分析，结果用蛋白条带灰度值表示。实验重复3次。
1.5 主要观察指标 ①THZ1对U87干细胞成球率和球体大小的影响；②THZ1对U87细胞增殖、迁移的影响；③THZ1对U87干细胞干性相关蛋白、上皮-间充质转化相关蛋白、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析 采用Graphpad Prism 8和SPSS 25.0 进行统计分析，计量资料以x±s表示；两组比较采用非参数t检验，多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

脑胶质瘤是常见的原发性神经系统恶性肿瘤。根据2021年版WHO中枢神经系统肿瘤分类原则，脑胶质瘤分为1-4级，其中3，4级为高级别脑胶质瘤，其恶性程度高、发展速度快、侵袭性强[17]。脑胶质瘤对多种化疗药物耐受，复发率高，患者平均生存时间较短[18]。
THZ1是CDK7的一种小分子共价抑制剂[19]，通过靶向CDK7而呈剂量依赖性地抑制细胞周期和肿瘤增殖[20]。THZ1已被证明具有抑制多种肿瘤生长的作用，包括乳腺癌[21]、非小细胞肺癌[22]、急性淋巴细胞白血病[23]、胆管癌[24]、骨肉瘤等[25]，THZ1也能抑制多种肿瘤干细胞，此外，THZ1可以和其他药物联合使用从而增强抗肿瘤作用，并能增强肿瘤细胞免疫治疗的药物敏感性[26]。该研究首先探讨了THZ1对脑胶质瘤U87细胞增殖和迁移的影响，发现THZ1对U87细胞活力的抑制作用呈浓度依赖性，即随着药物浓度的增加，其抑制效果越明显，且THZ1作用于U87细胞48 h的IC50(122.8 nmol/L)小于24 h的IC50(159.7 nmol/L)。考虑到药物的细胞毒作用，使用THZ1浓度分别为0，50，100 nmol/L进行细胞克隆形成实验，结果显示，药物作用浓度越高，细胞集落形成数量越少，集落体积也越小；细胞迁移实验THZ1浓度为0，100，200 nmol/L，结果提示，THZ1浓度越高，划痕愈合能力越弱、Transwell垂直迁移能力也越弱。该结果提示THZ1对U87细胞增殖、迁移有明显的抑制作用。
肿瘤干细胞是一群存在于异质性肿瘤组织中的细胞亚群。肿瘤干细胞具有高度自我更新和多向分化潜力，通过多种途径导致肿瘤进展、癌细胞增殖和治疗耐药性[27]。研究表明，胶质瘤干细胞被认为是胶质瘤发生、发展、耐药的基础[28]。脑胶质瘤干细胞也是胶质瘤增殖和血管生成的核心，对于维持肿瘤微环境至关重要[29]。因此，脑胶质瘤干细胞成为胶质瘤研究的主要对象之一，尤其是在靶向治疗策略研究中扮演重要角色[30]。该研究培养脑胶质瘤细胞U87并获得脑胶质瘤干细胞，通过Western blot验证干性相关蛋白表达(包括Nestin、CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2)明显高于U87贴壁细胞，然后进一步用THZ1处理第2代U87干细胞并记录成球过程和检测干性相关分子的表达是否发生改变，结果显示THZ1减弱了U87细胞的成球能力且使干性相关分子CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2的表达明显降低。
上皮-间充质转化是指上皮细胞通过特定程序失去上皮特征的细胞极性和黏附性，并获得间充质特征的迁移和侵袭表型的过程[31]。上皮-间充质转化过程与肿瘤干细胞的产生密切相关[32]，同时肿瘤干细胞又是诱发上皮-间充质转化的重要因素[33]。当肿瘤干细胞启动上皮-间充质转化程序时，所产生的间质性肿瘤细胞会变得具有侵袭性，使得它们具有较强的转移能力[34]。在脑胶质瘤研究中，上皮-间充质转化相关蛋白表达增加可能会导致胶质瘤细胞恶性增强和患者预后不良[35-36]。通过Western blot检测对照组和THZ1处理组U87干细胞的上皮-间充质转化相关蛋白表达，结果显示，上皮和黏附性相关蛋白E-cadherin、Occludin表达上调，而间质特征蛋白N-cadherin、Snail表达下调，说明THZ1通过抑制U87干细胞上皮-间充质转化过程，减弱脑胶质瘤干细胞的形成和分化。
Wnt信号通路主要有4条途径：Wnt/β-catenin传导途径、Wnt/Ca2+途径、Wnt细胞平面极化途径和调节纺锤体方向、非对称细胞分裂的细胞内途径。Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt通路，该通路参与细胞增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭和组织稳态等多种过程[37]，因此广泛用于人类癌症和动物癌症模型的实验研究[38]。Wnt/β-catenin通路对于维持肿瘤干细胞干性和促进上皮-间充质转化非常重要[39]，该通路的激活是驱动肿瘤干细胞持续自我更新的关键因素[40]，导致脑胶质瘤干细胞产生治疗抗性[41]。为进一步探索THZ1对U87干细胞影响的机制，通过Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路的蛋白表达变化，结果显示THZ1处理后Axin1、β-Catenin、Wnt-5a、GSK3β、Cyclind-1、C-myc这些分子的蛋白表达显著下调，提示THZ1抑制了Wnt/β-catenin通路的活化。
THZ1在多种肿瘤中发挥抑癌作用[21-25]，但是在脑胶质瘤中的具体机制未见报道。该研究成功培养U87肿瘤干细胞并进行干性验证，初步证明THZ1通过下调Wnt/β-catenin信号通路相关分子的蛋白表达，从而减弱U87细胞增殖、迁移能力，抑制干细胞形成和分化、降低干性蛋白表达以及影响上皮-间充质转化过程；而THZ1对这些相关分子的影响是直接或间接作用还有待进一步探索。脑胶质瘤治疗困难的主要原因除了胶质瘤本身侵袭性强、对化疗药物耐药，还有血脑屏障对分子的选择性较强等因素，因此将来还需对THZ1穿透血脑屏障的能力进行评估，并探讨THZ1在体内是否也能发挥抑制脑胶质瘤干细胞的作用，为脑胶质瘤治疗提供更为可靠的依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

细胞周期蛋白依赖性激酶7抑制剂THZ1对脑胶质瘤干细胞干性的调控及机制

Regulation of THZ1, an inhibitor of cyclin-dependent kinase 7, on stemness of glioma stem cells and its mechanism

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