血管紧张素Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变的抑制作用

doi:10.12307/2025.083

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (23): 4859-4867.doi: 10.12307/2025.083

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血管紧张素Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变的抑制作用

刘晨洋，王瑾，张文婷，王丽清，尹晓晓，赵俊楠，焦向英

山西医科大学基础医学院生理学系，山西省太原市 030001

收稿日期:2024-02-29 接受日期:2024-05-21 出版日期:2025-08-18 发布日期:2024-09-26
通讯作者: 焦向英，博士，教授，山西医科大学基础医学院生理学系，山西省太原市 030001
作者简介:刘晨洋，女，1993年生，山西医科大学在读硕士，主要从事糖尿病代谢性疾病相关研究。

Inhibitory effect of angiotensin II on the brown fat differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Liu Chenyang, Wang Jin, Zhang Wenting, Wang Liqing, Yin Xiaoxiao, Zhao Junnan, Jiao Xiangying

Department of Physiology, School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2024-02-29 Accepted:2024-05-21 Online:2025-08-18 Published:2024-09-26
Contact: Jiao Xiangying, PhD, Professor, Department of Physiology, School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Liu Chenyang, Master candidate, Department of Physiology, School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

解偶联蛋白1：棕色脂肪细胞线粒体内膜中富含一种特别的蛋白质，称为解偶联蛋白1。它是由2个32 kD亚基组成的二聚体，在线粒体内膜上形成质子通道，内膜细胞质侧的H+可经此通道返回线粒体基质，使氧化磷酸化解偶联不生成ATP，但质子梯度储存的能量以热能形式释放。
棕色脂肪细胞：通常脂肪细胞包括白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞两种类型。棕色脂肪细胞最显著的特征之一是它们拥有丰富且代谢活跃的线粒体。线粒体是细胞内必不可少的细胞器，通过三羧酸循环、脂肪酸β氧化和电子传递链将葡萄糖和脂肪酸产生的化学能转化为三磷酸腺苷。棕色脂肪细胞特异性表达解偶联蛋白1，使化学能以热能的形式消散，以抵抗低温。产热棕色脂肪中的线粒体能量代谢实质上调节热能的产生以及循环血糖和脂肪酸的消耗，这与全身能量稳态密切相关。棕色脂肪细胞中特殊的线粒体能量代谢已成为预防肥胖及相关代谢性疾病(如2型糖尿病和心血管疾病)的一个有吸引力的靶点。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞是脂肪细胞的来源之一，且表达所有肾素血管紧张素系统成分，但血清血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪组织分化的影响尚不清楚。
目的：观察血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的影响，并探究血管紧张素1a型受体敲除对血管紧张素Ⅱ影响骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的作用及可能机制。
方法：分离培养野生型SD大鼠及血管紧张素1a型受体敲除SD大鼠的骨髓间充质干细胞，将其培养至第3代，随机分为4组：野生组，基因敲除组，野生+血管紧张素Ⅱ组，基因敲除+血管紧张素Ⅱ组，在棕色脂肪诱导分化培养基中诱导分化14 d，后2组在每次更换分化培养基的同时加入100 nmol/L血管紧张素Ⅱ进行干预。采用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等方法检测棕色脂肪诱导分化、脂肪分解、β氧化和线粒体生物发生等相关标记物的表达。
结果与结论：血管紧张素Ⅱ可抑制骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化，敲除血管紧张素1a型受体基因能够通过促进脂肪分解、增强脂肪酸β氧化、促进线粒体生物发生、增强线粒体功能来改善血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化的抑制作用。这些发现为肥胖治疗提供了新的研究方向和潜在治疗靶点，揭示了肾素血管紧张素系统在脂肪代谢中的重要作用及其作为治疗目标的潜力。

https://orcid.org/0000-0003-1182-9052 (焦向英)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 血管紧张素Ⅱ, 骨髓间充质干细胞, 棕色脂肪变, 线粒体, β氧化, 血管紧张素Ⅱ1a受体

Abstract: BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are one of the sources of adipocytes and express all renin-angiotensin system components, but the effect of angiotensin II on bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into brown adipose tissue is not clear.
OBJECTIVE: To observe the effect of angiotensin II on bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into brown adipose tissue and investigate the role of angiotensin 1a receptor knockout in effect of angiotensin II on bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into brown adipocytes and its potential mechanisms.
METHODS: After isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells in wild-type and angiotensin 1a receptor knockout SD rats, the cells were cultured to the third generation and randomly divided into four groups: wild type group, knockout group, wild type + angiotensin II group, and knockout + angiotensin II group. The differentiation was induced in the brown fat induced differentiation medium for 14 days. Angiotensin II (100 nmol/L) was added for intervention when the differentiation medium was changed each time in the latter two groups. Western blot assay, qRT-PCR, immunofluorescence, and other methods were used to detect the expression of induced differentiation, lipolysis, β oxidation, and mitochondrial biogenesis in brown fat.

RESULTS AND CONCLUSION: Angiotensin II could inhibit the browning of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Knockout of angiotensin 1a receptor could improve the inhibitory effect of angiotensin II on brown lipid formation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by promoting lipolysis, enhancing fatty acid β oxidation, promoting mitochondrial biogenesis, and enhancing mitochondrial function. These findings provide new research directions and potential therapeutic targets for obesity treatment, revealing the important role of renin angiotensin systems in fat metabolism and its potential as a therapeutic target.

Key words: angiotensin II, bone marrow mesenchymal stem cell, brown fat differentiation, mitochondria, β-oxidation, angiotensin II type 1a receptor

中图分类号:

刘晨洋, 王瑾, 张文婷, 王丽清, 尹晓晓, 赵俊楠, 焦向英. 血管紧张素Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变的抑制作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4859-4867.

Liu Chenyang, Wang Jin, Zhang Wenting, Wang Liqing, Yin Xiaoxiao, Zhao Junnan, Jiao Xiangying. Inhibitory effect of angiotensin II on the brown fat differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(23): 4859-4867.

图/表（结果） 5

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的鉴定结果 CD29在干细胞表面广泛表达，并与干细胞的黏附和增殖相关联，常被用作间充质干细胞的标记物之一。CD45也称为白细胞共同抗原，是一种在血细胞系中广泛表达的膜糖蛋白，在骨髓间充质干细胞上不表达。为了验证培养的大鼠骨髓间充质干细胞的纯度，取第3代骨髓间充质干细胞进行流式鉴定。结果如图1显示，待测骨髓间充质干细胞中CD29阳性细胞比例为99.88%，而阴性标记物CD45阳性细胞比例为0.02%，证明培养的细胞为间充质干细胞。

2.2 AT1aR敲除改善Ang Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂变过程中脂滴形成的抑制作用 诱导分化14 d后，在明场下观察到：与WT组相比，WT+Ang Ⅱ组大鼠骨髓间充质干细胞的脂滴数目明显减少，而敲除AT1aR后脂滴较多且呈多房状的小脂滴。与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组脂滴数目明显增多，见图2A。用油红O染料进行染色，如图2B所示，与WT组相比，WT+Ang Ⅱ组脂滴着色明显减少，而敲除AT1aR后脂滴明显增多，可看到成簇的多房脂滴聚集成团。与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组的脂滴着色明显增多。因此，Ang Ⅱ减少骨髓间充质干细胞棕色成脂诱导分化脂滴的形成，而AT1aR敲除可以促进骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化过程中的脂滴形成。

2.3 AT1aR敲除改善了AngⅡ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色成脂的抑制作用 棕色脂肪组织最显著的特点是特异性表达UCP1，使氧化磷酸化解偶联不生成ATP，但质子梯度储存的能量以热能形式释放，使组织产热增加[8-9]。PPARγ是一种转录因子，属于核受体超家族的一员，主要参与调控脂肪细胞的分化、脂质代谢和能量平衡[10]。如图3所示，与WT组相比，WT+Ang Ⅱ组棕色脂肪变的特异性标记产物UCP1、PPARγ的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)，敲除AT1aR后，UCP1、PPARγ的mRNA及蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)；而与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组UCP1、PPARγ的mRNA及蛋白水平也明显升高(P < 0.01)。共聚焦显微镜观察显示，与WT组相比，WT+Ang Ⅱ组UCP1荧光强度明显减弱，UCP1表达水平降低，AT1aR敲除组UCP1荧光强度明显增强，UCP1表达水平升高。与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组UCP1荧光强度也增强，UCP1表达水平升高。

2.4 AT1aR敲除改善了AngⅡ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂变过程中产热标记物表达的抑制作用 产热在改善代谢率及葡萄糖和脂质代谢中发挥着重要作用[11]。除了上述棕色脂肪特异性标记蛋白UCP1和PPARγ外，PGC-1α是一种重要的转录共激活因子，被认为在能量代谢调控中发挥着关键作用[10]。PGC-1α也是棕色脂肪细胞中产热基因表达、线粒体生物发生和氧化代谢的主要转录调控因子[12]。FGF21作为一种转录因子和激素，是维持局部和全身脂质、葡萄糖和能量代谢稳态的主要调节因子，并且被认为是一种褐变剂[13]。DIO2是一种碘代谢酶，在棕色脂肪中促进甲状腺素的转化，从而增强脂肪细胞的产热能力[14]。CIDEA最初因与凋亡DNA分解因子序列的相似性而被识别出来，且其在棕色脂肪组织中表达水平很高[15]。如图4所示，与WT组相比，WT+Ang Ⅱ组大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变过程中产热标记物PGC-1α、CEBPα、DIO2、CIDEA的mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)，AT1aR敲除组PGC-1α、CEBPα、DIO2、CIDEA、FGF21的mRNA表达水平均显著升高(P < 0.05)。与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组的这些指标有明显升高(P < 0.05)。同时，PGC-1α的蛋白表达水平与qRT-PCR结果一致。以上结果表明，AT1aR敲除通过增加产热标记物的表达，进而改善Ang Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂变产热功能的不良影响。
2.5 AT1aR敲除改善了AngⅡ对大鼠骨髓间充质干细胞向棕色脂肪分化过程中脂解的抑制作用 棕色脂肪组织增多，导致机体的产热增加，因而脂肪的分解和利用增多。如图5所示，与WT组相比，WT+AngⅡ组脂肪分解限速酶ATGL和HSL的mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)，而AT1aR敲除组ATGL和HSL的mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)。与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组的这些指标有明显升高(P < 0.01)。与WT组相比，WT+Ang Ⅱ组ATGL的蛋白表达水平显著下降(P < 0.05)，而AT1aR敲除组ATGL的蛋白表达水平显著升高(P < 0.05)。与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组ATGL的蛋白表达水平显著升高(P < 0.01)。
2.6 AT1aR敲除改善了Ang Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞脂肪酸β氧化的抑制作用 脂肪酸氧化相关酶包括ACADM、ACADL以及负责上游调节的PPAR家族[16]。有文献报道，促进游离脂肪酸代谢相关的脂肪酸β氧化速率是通过提高PPARα蛋白及其下游脂肪酸转位酶和肉碱棕榈酰基转移酶1蛋白的活性来发挥作用的[17]。在脂肪细胞中，CD36的主要作用是促进脂肪酸的摄取，它能够结合游离脂肪酸，使其进入细胞内，进而参与脂肪酸代谢[18]。如图6所示，与WT组相比，WT+Ang Ⅱ组PPARα、CPT1B、CD36、ACADM、ACADL的mRNA水平明显降低(P < 0.05)，AT1aR敲除组这些指标显著升高(P < 0.05)。同时，与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组的这些指标明显升高(P < 0.01)。

2.7 AT1aR敲除改善了AngⅡ对大鼠骨髓间充质干细胞线粒体生物发生的抑制作用 线粒体β氧化对产热至关重要，是线粒体生物发生的能量来源[10]。Tfam在调节线粒体DNA的转录和复制中发挥着关键作用[19]。Nrf-1和Nrf-2是细胞内线粒体数量和功能调节相关的转录因子，它们促进线粒体基因的表达，参与调节线粒体的生物合成和功能[20]。如图7所示，与WT组相比，WT+Ang Ⅱ组Tfam、Nrf-1的mRNA水平显著降低(P < 0.05)，Nrf-2的mRNA水平无统计学差异，但是AT1aR敲除组Tfam、Nrf-1、Nrf-2的mRNA水平均显著上升(P < 0.05)。与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组的Nrf-1、Nrf-2的mRNA水平也明显升高(P < 0.05)，Tfam的mRNA水平虽无统计学意义，但有增高的趋势。
2.8 AT1aR敲除改善了Ang Ⅱ对骨髓间充质干细胞棕色脂变过程中线粒体功能的抑制作用 线粒体动力学在营养利用和能量消耗上有潜在作用[21]。线粒体作为一个高度动态的细胞器，不断进行融合与分裂，保持动态平衡，该过程主要由介导线粒体融合的MFN1、MFN2和介导裂变的DRP1调控[22]。如图8所示，与WT组比较，WT+AngⅡ组MFN1、MFN2、DRP1的蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，而AT1aR敲除后MFN1、MFN2和DRP1蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)。与WT+Ang Ⅱ组相比，KO+Ang Ⅱ组MFN2和DRP1蛋白表达水平明显升高(P < 0.01)。

参考文献

[1] NOVELLI G, CASSADONTE C, SBRACCIA P, et al. Genetics: A Starting Point for the Prevention and the Treatment of Obesity. Nutrients. 2023;15(12):2782.
[2] MATSUSHITA K, WU Y, PRATT RE, et al. Deletion of angiotensin II type 2 receptor accelerates adipogenesis in murine mesenchymal stem cells via Wnt10b/beta-catenin signaling. Lab Invest. 2016;96(8):909-917.
[3] PAHLAVANI M, KALUPAHANA NS, RAMALINGAM L, et al. Regulation and Functions of the Renin-Angiotensin System in White and Brown Adipose Tissue. Compr Physiol. 2017;7(4):1137-1150.
[4] CAI Z, FANG L, JIANG Y, et al. Angiotensin II Promotes White Adipose Tissue Browning and Lipolysis in Mice. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6022601.
[5] LI A, SHI W, WANG J, et al. The gene knockout of angiotensin II type 1a receptor improves high-fat diet-induced obesity in rat via promoting adipose lipolysis. PLoS One. 2022;17(7):e0267331.
[6] LIU C, FAN Y, ZHOU L, et al. Pretreatment of mesenchymal stem cells with angiotensin II enhances paracrine effects, angiogenesis, gap junction formation and therapeutic efficacy for myocardial infarction. Int J Cardiol. 2015;188:22-32.
[7] JIANG X, WU F, XU Y, et al. A novel role of angiotensin II in epidermal cell lineage determination: Angiotensin II promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into keratinocytes through the p38 MAPK, JNK and JAK2 signalling pathways. Exp Dermatol. 2019;28(1):59-65.
[8] DI MAIO G, ALESSIO N, PELUSO G, et al. Molecular and Physiological Effects of Browning Agents on White Adipocytes from Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells. Int J Mol Sci. 2022;23(20):12151.
[9] RODRÍGUEZ-CANO MM, GONZÁLEZ-GÓMEZ MJ, SÁNCHEZ-SOLANA B,
et al. NOTCH Receptors and DLK Proteins Enhance Brown Adipogenesis in Mesenchymal C3H10T1/2 Cells. Cells. 2020;9(9):2032.
[10] VAN NGUYEN TT, VU VV, PHAM PV. Transcriptional Factors of Thermogenic Adipocyte Development and Generation of Brown and Beige Adipocytes From Stem Cells. Stem Cell Rev Rep. 2020;16(5):876-892.
[11] KAJIMURA S, SAITO M. A new era in brown adipose tissue biology: molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annu Rev Physiol. 2014;76:225-249.
[12] HUANG PI, CHEN YC, CHEN LH, et al. PGC-1α mediates differentiation of mesenchymal stem cells to brown adipose cells. J Atheroscler Thromb. 2011;18(11):966-980.
[13] LUO Y, YE S, CHEN X, et al. Rush to the fire: FGF21 extinguishes metabolic stress, metaflammation and tissue damage. Cytokine Growth Factor Rev. 2017;38:59-65.
[14] YAU WW, SINGH BK, LESMANA R, et al. Thyroid hormone (T3) stimulates brown adipose tissue activation via mitochondrial biogenesis and MTOR-mediated mitophagy. Autophagy. 2019;15(1):131-150.
[15] LIN SC, LI P. CIDE-A, a novel link between brown adipose tissue and obesity. Trends Mol Med. 2004;10(9):434-439.
[16] WANG J, LI D, ZHANG Y, et al. Angiotensin II type 1a receptor knockout ameliorates high-fat diet-induced cardiac dysfunction by regulating glucose and lipid metabolism. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2023; 55(9):1380-1392.
[17] CHENG L, ZHANG S, SHANG F, et al. Emodin Improves Glucose and Lipid Metabolism Disorders in Obese Mice via Activating Brown Adipose Tissue and Inducing Browning of White Adipose Tissue. Front Endocrinol (Lausanne). 2021;12:618037.
[18] ABE I, OGURI Y, VERKERKE ARP, et al. Lipolysis-derived linoleic acid drives beige fat progenitor cell proliferation. Dev Cell. 2022;57(23):2623-2637.e8.
[19] LU T, ZHANG Z, BI Z, et al. TFAM deficiency in dendritic cells leads to mitochondrial dysfunction and enhanced antitumor immunity through cGAS-STING pathway. J Immunother Cancer. 2023;11(3):e005430.
[20] CHEN QM. Nrf2 for protection against oxidant generation and mitochondrial damage in cardiac injury. Free Radic Biol Med. 2022;179:133-143.
[21] WIKSTROM JD, MAHDAVIANI K, LIESA M, et al. Hormone-induced mitochondrial fission is utilized by brown adipocytes as an amplification pathway for energy expenditure. EMBO J. 2014;33(5):418-436.
[22] KLEELE T, REY T, WINTER J, et al. Distinct fission signatures predict mitochondrial degradation or biogenesis. Nature. 2021;593(7859):435-439.
[23] MARQUEZ-CURTIS LA, JANOWSKA-WIECZOREK A, MCGANN LE, et al. Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: Biological, clinical and cryopreservation aspects. Cryobiology. 2015;71(2):181-197.
[24] MOON H, CHOI JW, SONG BW, et al. Isoliquiritigenin Enhances the Beige Adipocyte Potential of Adipose-Derived Stem Cells by JNK Inhibition. Molecules. 2020;25(23):5660.
[25] CARPENTIER AC, BLONDIN DP, HAMAN F, et al. Brown Adipose Tissue-A Translational Perspective. Endocr Rev. 2023;44(2):143-192.
[26] IKEDA K, MARETICH P, KAJIMURA S. The Common and Distinct Features of Brown and Beige Adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 2018;29(3):191-200.
[27] ALVAREZ-GALLEGO F, GONZÁLEZ-BLÁZQUEZ R, GIL-ORTEGA M, et al. Angiotensin II type 2 receptor as a novel activator of brown adipose tissue in obesity. Biofactors. 2023;49(6):1106-1120.
[28] LOH RKC, FORMOSA MF, LA GERCHE A, et al. Acute metabolic and cardiovascular effects of mirabegron in healthy individuals. Diabetes Obes Metab. 2019;21(2):276-284.
[29] SLAMKOVA M, ZORAD S, KRSKOVA K. Alternative renin-angiotensin system pathways in adipose tissue and their role in the pathogenesis of obesity. Endocr Regul. 2016;50(4):229-240.
[30] NING K, LIU S, YANG B, et al. Update on the effects of energy metabolism in bone marrow mesenchymal stem cells differentiation. Mol Metab. 2022;58:101450.
[31] HALLBERG M, MORGANSTEIN DL, KISKINIS E, et al. A functional interaction between RIP140 and PGC-1alpha regulates the expression of the lipid droplet protein CIDEA. Mol Cell Biol. 2008;28(22):6785-6795.
[32] FARMER SR. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 2006;4(4):263-273.
[33] XU Y, YU T, MA G, et al. Berberine modulates deacetylation of PPARγ to promote adipose tissue remodeling and thermogenesis via AMPK/SIRT1 pathway. Int J Biol Sci. 2021;17(12):3173-3187.
[34] 常华杰,勾文峰,郭江红,等.胡黄连苷Ⅰ、Ⅱ通过调节C/EBP-PPARγ通路抑制3T3-L1脂肪前体细胞的分化和脂肪合成[J].药物评价研究, 2023,46(6):1193-1200.
[35] PARK M, BAEK H, HAN JY, et al. Stevioside Enhances the Anti-Adipogenic Effect and β-Oxidation by Activating AMPK in 3T3-L1 Cells and Epididymal Adipose Tissues of db/db Mice. Cells. 2022;11(7):1076.
[36] FINCK BN, KELLY DP. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 (PGC-1) regulatory cascade in cardiac physiology and disease. Circulation. 2007;115(19):2540-2548.
[37] DUTCHAK PA, KATAFUCHI T, BOOKOUT AL, et al. Fibroblast growth factor-21 regulates PPARγ activity and the antidiabetic actions of thiazolidinediones. Cell. 2012;148(3):556-567.
[38] JASH S, BANERJEE S, LEE MJ, et al. CIDEA Transcriptionally Regulates UCP1 for Britening and Thermogenesis in Human Fat Cells. iScience. 2019;20: 73-89.
[39] ROSENWALD M, PERDIKARI A, RÜLICKE T, et al. Bi-directional interconversion of brite and white adipocytes. Nat Cell Biol. 2013;15(6):659-667.
[40] YOON D, IMRAN KM, KIM YS. Distinctive effects of licarin A on lipolysis mediated by PKA and on formation of brown adipocytes from C3H10T1/2 mesenchymal stem cells. Toxicol Appl Pharmacol. 2018;340:9-20.
[41] STEC DE, GORDON DM, HIPP JA, et al. Loss of hepatic PPARα promotes inflammation and serum hyperlipidemia in diet-induced obesity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2019;317(5):R733-R745.
[42] PATEL BV, YAO F, HOWENSTINE A, et al. Emergent Coordination of the CHKB and CPT1B Genes in Eutherian Mammals: Implications for the Origin of Brown Adipose Tissue. J Mol Biol. 2020;432(23):6127-6145.
[43] WU L, LIU C, CHANG DY, et al. The Attenuation of Diabetic Nephropathy by Annexin A1 via Regulation of Lipid Metabolism Through the AMPK/PPARα/CPT1b Pathway. Diabetes. 2021;70(10):2192-2203.
[44] TAHRI-JOUTEY M, ANDREOLETTI P, SURAPUREDDI S, et al. Mechanisms Mediating the Regulation of Peroxisomal Fatty Acid Beta-Oxidation by PPARα. Int J Mol Sci. 2021;22(16):8969.
[45] ZHU Q, AN YA, SCHERER PE. Mitochondrial regulation and white adipose tissue homeostasis. Trends Cell Biol. 2022;32(4):351-364.
[46] ROH HC, KUMARI M, TALEB S, et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Mol Metab. 2020;42:101086.
[47] CEDIKOVA M, KRIPNEROVÁ M, DVORAKOVA J, et al. Mitochondria in White, Brown, and Beige Adipocytes. Stem Cells Int. 2016;2016:6067349.
[48] KLINGENBERG M, HUANG SG. Structure and function of the uncoupling protein from brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 1999;1415(2): 271-296.
[49] REN Z, ZHANG X, DING T, et al. Mitochondrial Dynamics Imbalance: A Strategy for Promoting Viral Infection. Front Microbiol. 2020;11:1992.
[50] UM JH, YUN J. Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology. BMB Rep. 2017;50(6):299-307.
[51] TWIG G, HYDE B, SHIRIHAI OS. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim Biophys Acta. 2008;1777(9):1092-1097.
[52] LIESA M, SHIRIHAI OS. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 2013;17(4):491-506.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞生物学体外观察实验。
1.2 时间及地点 实验于2022年3月至2024年1月在山西医科大学细胞与生理学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄野生型(Wild type，WT)雄性SD大鼠12只，体质量120 g左右，购自山西医科大学实验动物中心；4周龄AT1aR基因敲除(AT1aR gene knockout type，KO)雄性SD大鼠12只，体质量120 g左右，由南京大学-南京生物医药研究院(XM003006)构建。构建策略为sgRNA&CRISPER/Cas9 system。所有大鼠均喂养于山西医科大学生理系SPF级动物实验室内，温度(25±2) ℃，12 h昼夜交替，可自由饮水和摄食。
所有实验均符合山西医科大学动物伦理学标准，审批号为SYDL2024008。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂与仪器 α-MEM培养基(SH30265.01B)、胎牛血清(SH30406.05)购自美国Hyclone公司；Ang Ⅱ(HY-13948A)购自美国MCE公司；总RNA提取试剂盒(9109)、反转录试剂盒(RR047A)、扩增试剂盒(RR820A)均购于日本TaKaRa公司；免染SDS-PAGE凝胶制备试剂(#10033837)购自美国Bio-Rad 公司；山羊抗兔二抗(BA1054)购于武汉博士德生物工程有限公司；山羊抗兔IgG H&L (FITC)(ab6717)购自英国Abcam公司；解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)(#72298)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)(#2435)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α)(#2178)、脂肪甘油三酯脂肪酶(triacylglycerol lipase，ATGL)(#2138)及α-tublin(#3873)一抗均购于美国CST公司；线粒体融合蛋白1(mitofusin1 protein，MFN1)(A980)、线粒体融合蛋白2(mitofusin2 protein，MFN2)(A12771)、动力相关蛋白1(dynamin-related protein1，DRP1)(A2586)一抗均购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。蛋白电泳仪、蛋白转印仪及凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；Nanodrop One购自美国Thermo Fisher公司；LightCycle 96SW PCR仪购自美国Roche公司；共聚焦显微镜购自德国徕卡公司。
1.4 方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞分离和培养 将4周龄清洁级SD大鼠麻醉后颈椎脱臼处死，分离双下肢胫腓骨，用含体积分数10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的α-MEM培养基冲洗骨髓腔，将所得的细胞悬液吹打混匀、离心，弃上清重悬后接种到无菌细胞培养皿中，在37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，隔日换液，用无菌PBS洗掉未贴壁生长细胞，以后每隔2 d换液1次，待细胞铺满80%培养瓶底后，用胰酶消化并按照1︰2传代培养，倒置相差显微镜观察细胞形态，选择细胞生长状态良好的第3代细胞进行成棕色脂肪诱导分化。
1.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞成棕色脂肪诱导及加药处理 将第3代骨髓间充质干细胞随机分为4组：WT组、KO组、WT+AngⅡ组、KO+AngⅡ组，待细胞融合至80%-90%时，加入棕色成脂诱导分化培养基(含体积分数10%胎牛血清、10 µg/mL胰岛素、1 µmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 µmol/L罗格列酮、1 nmol/L三碘甲状腺原氨酸的α-MEM培养基)进行诱导分化，培养3 d后，将培养基更换为α-MEM+体积分数10%胎牛血清+10 µg/mL胰岛素的维持培养液，培养1 d后再更换棕色成脂诱导分化培养基，继续培养3 d。按照以上换液频率诱导14 d，在显微镜下观察脂滴数量和大小。WT+AngⅡ组和KO+AngⅡ组细胞棕色成脂诱导分化的过程中，加入浓度为100 nmol/L的Ang Ⅱ干预[6-7]。
1.4.3 Western blot检测相关蛋白表达 棕色成脂诱导分化14 d后，将4组细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解，随后以4 ℃、12 000 r/min离心15 min后提取上清，BCA测蛋白浓度。选择20 μg蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳，蛋白转印仪条件设置为2.5 A，7 min，将蛋白转至PVDF膜后用5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗4 ℃过夜。研究中使用的一抗如下：UCP1、PPARγ、PGC-1α、ATGL、MFN1、MFN2、DRP1抗体，均按1∶1 000比例稀释。次日TBST洗膜3次后孵育二抗，2 h后用超敏发光液曝光。曝光所得条带用Image J软件进行灰度值分析，α-tublin作为内参进行统计分析。
1.4.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测相关基因表达水平 棕色成脂诱导分化14 d后，将4组细胞按Trizol试剂盒要求提取细胞总的RNA，使用Nanodrop One分光光度计测定浓度后，采用反转录试剂盒合成cDNA，采用扩增试剂盒进行PCR扩增，条件如下：预变性 95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 20 s，40个循环。采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。检测的基因如下：UCP1、PPARγ、PGC-1α、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha，CEBPα)、脱碘酶2(deiodinase2，DIO2)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(cell death inducing DFFA like effector A，CIDEA)、纤维母细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)、ATGL、激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase，HSL)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)、肉碱棕榈酰基转移酶1B(carnitine palmitoyltransferase 1B，CPT1B)、脂肪酸转位酶(CD36)、中链酰基辅酶A脱氢酶(medium-chain Acyl-CoA dehydrogenase，ACADM)及长链酰基辅酶A脱氢酶

(long-chain acyl-CoA dehydrogenase，ACADL)、线粒体转录因子A(transcription factor A，mitochondrial，Tfam)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，Nrf-1)、核呼吸因子2(nuclear respiratory factor 2，Nrf-2)。引物序列见表1。

1.4.5 免疫荧光检测 按上述的棕色脂肪诱导分化培养方法处理4组细胞，在每次更换分化培养基的同时加入浓度为100 nmol/L的Ang Ⅱ溶液，在共聚焦培养皿中分化14 d，加入稀释至1×的Hoechst 33342在培养箱中孵育30 min，随后取出培养皿，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，用0.3% Triton X-100渗透细胞15 min，在室温下用3%牛血清白蛋白封闭2 h，将细胞与抗UCP1抗体在4 ℃下孵育过夜，然后在室温下使用山羊抗兔IgG H&L (FITC)孵育1 h，在共聚焦显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 各组大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为棕色脂肪细胞后UCP1、PPARγ、PGC-1α、CEBPα、DIO2、CIDEA、FGF21、ATGL、HSL、PPARα、CPT1B、CD36、ACADM及ACADL、Tfam、Nrf-1、Nrf-2的mRNA表达水平，UCP1、PPARγ、PGC-1α、ATGL、MFN1、MFN2和DRP1的蛋白表达水平。

1.6 统计学分析 所有实验数据均用GraphPadPrism 8进行统计分析，以均数±标准误表示，组间差异使用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经山西医科大学生物学统计学专家审核。

讨论

实验分离培养WT大鼠和KO大鼠的原代骨髓间充质干细胞，传代至第3代，用棕色成脂诱导分化培养基诱导分化为棕色脂肪细胞，同时用Ang Ⅱ处理细胞，观察和探讨敲除AT1aR与Ang Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为棕色脂肪细胞的作用机制。骨髓间充质干细胞分离培养方法成熟、可靠，且具有自我更新和多向分化的潜能，在细胞治疗、再生医学和组织工程方面具有巨大潜力[23]。该研究表明，Ang Ⅱ抑制大鼠骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞分化，AT1aR敲除通过增加棕色脂肪特异性标记蛋白UCP1和PPARγ的表达，增加产热标记物PGC-1α、CEBPα、DIO2、CIDEA、FGF21的表达，促进脂肪分解，增强脂肪酸β氧化，促进线粒体的生物发生和增强线粒体功能来改善Ang Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色成脂的抑制作用。
肥胖在当今社会对人类健康已经构成了巨大的威胁，但目前仍无有效方法改善。在体内除了白色脂肪外，还存在一种特殊的脂肪即棕色脂肪，棕色脂肪组织被用来调节能量消耗，而不是脂肪储存[24-26]。在过去十年里，棕色脂肪激活已经成为一种有前景的治疗代谢性疾病的方式[27]。β-肾上腺素能受体激动剂已被证明能成功增加能量消耗并恢复代谢平衡，但其治疗剂量与导致心血管不良反应的毒性剂量非常接近[28]。考虑到肥胖患者心血管疾病的发生率和死亡率明显升高的趋势，因此迫切需要一种新的途径激活棕色脂肪。有证据显示，肥胖状态下，Ang Ⅱ和AT1aR水平都明显升高，提示肾素血管紧张素系统过度激活是肥胖患者的共同特征[27，29]。课题组前期的研究表明，阻断AT1aR表达可减少脂肪细胞肥大，提高胰岛素敏感性[5]。脂肪细胞的来源之一是骨髓间充质干细胞，但Ang Ⅱ对骨髓间充质干细胞诱导分化为棕色脂肪细胞的影响尚不清楚[2，30]。该实验检测棕色脂变的特异性标记基因，结果表明Ang Ⅱ明显抑制UCP1、PPARγ基因的表达，而AT1aR敲除逆转了这一抑制作用，证明了AT1aR敲除可以改善AngⅡ对骨髓间充质干细胞棕色脂变的抑制作用。
棕色脂肪组织与白色脂肪组织和其他组织的独特区别在于它在能量消耗、产热方面具有重要的功能。在棕色脂肪组织的最终分化阶段和产热基因的表达调控中，许多转录因子和共调节因子发挥着特别重要的作用[31]。在脂肪分化早期，CEBPβ和CEBPδ被诱导，随后反式激活PPARγ和CEBPα的表达[32]。PPARγ被认为是脂肪形成的主要调节因子，脂肪组织中PPARγ的激活可将白色脂肪细胞转化为褐色脂肪细胞[33]。CEBPα主要在脂肪分化末期诱导一些脂肪细胞特异性基因的激活[34]。PGC-1α能够上调三羧酸循环的表达，并具有刺激过氧化物酶体活性和线粒体脂肪酸氧化的能力[35]。PGC-1α在白色脂肪细胞中几乎不表达，在棕色脂肪细胞受到刺激时表达升高[12]。PGC-1α是PPARs (PPARα、PPARδ、PPARγ)转录因子家族和维甲类受体的共激活因子，能与转录因子协同促进线粒体生物合成和促进UCP1表达[36]。暴露于温度降低的环境中会使血浆FGF21水平增加，PPARγ转录控制FGF21，然后FGF21作为自分泌或旁分泌递质增加PPARγ转录活性[37]。JASH等[38]研究表明，CIDEA增强了PPARγ与UCP1的结合，CIDEA在脂肪细胞的棕色变中发挥重要作用。这些产热相关基因相互联系，共同调控棕色脂肪细胞的产热。该实验结果也证实了AT1aR敲除改善了Ang Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂变过程中产热标记物表达的抑制作用。
在棕色脂肪组织褐变和产热激活过程中，观察到脂肪分解的增加[39]。研究表明，三酰甘油的分解和脂肪酸β氧化与棕色脂肪细胞的热能产生密切相关，PKA通过磷酸化作用促进了脂肪酸的β氧化，进一步增加了棕色脂肪细胞的热能产生[40]。越来越多的证据表明，PPARα是全身脂质代谢的重要调节因子，PPARα缺乏被认为是导致或加剧脂肪酸代谢障碍的主要因素，导致肥胖、2型糖尿病、血脂异常、心肌梗死、非酒精性脂肪性肝病等许多代谢性疾病的发展[41]。该研究在骨髓间充质干细胞诱导成棕色脂肪细胞的过程中，肾素血管紧张素系统过度激活降低了CD36的mRNA表达水平，AT1aR敲除明显逆转了这一降低作用，加速脂肪酸的运输和消耗。CPT1B是羧酰基转移酶1B的一种亚型。它是脂肪酸β氧化过程的关键酶之一。CPT1B位于线粒体外膜上，其主要功能是催化脂肪酰辅酶A转运进入线粒体内，进而参与脂肪酸β氧化的开始步骤[42]。这些基因在脂肪酸代谢中起着不同作用但却密切相关，共同参与脂肪酸的代谢过程[43]。该实验结果也证实AT1aR敲除改善了Ang Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞脂肪酸β氧化的抑制作用，这表明敲除AT1aR能够增强线粒体脂肪酸β氧化，促进产热增加。
线粒体结构和功能正常是发生脂肪酸β氧化使产热增加的关键因素[12，44]。线粒体在细胞生物能和信号传导中发挥着至关重要的作用[45]。脂肪细胞在长期喂食高脂饮食后会失去其原有的细胞特性，并表现出线粒体缺陷的肌成纤维细胞样特征[46]，因而线粒体功能在维持机体正常生长发育过程中起着关键作用。棕色脂肪细胞的线粒体数量和密度远远高于白色脂肪细胞，这导致棕色脂肪细胞更高水平地表达线粒体蛋白和与能量-热转换密切相关的棕色脂肪特异性基因[47]。棕色脂肪分化伴随着线粒体生物发生的大量增加[48]。该研究检测了Ang Ⅱ处理大鼠骨髓间充质干细胞中线粒体生物发生基因的表达，发现AngⅡ处理显著降低了Tfam、Nrf-1及Nrf-2的表达，而AT1aR敲除逆转了这种降低作用。线粒体是经历不断融合和裂变的动态细胞器[19]。线粒体动力学具有重要的生理意义，许多疾病的发生如炎症、代谢综合征、心功能障碍等都与线粒体动力学异常密切相关[49]。近年来，线粒体功能和稳态的维持与人类肥胖等代谢性疾病密切相关，也因此越来越受到人们的关注[50]。线粒体经历着不断融合和裂变的连续循环，称之为“线粒体生命周期”，以保持其功能和质量[51]。此外，研究发现线粒体结构的改变在一定程度上反映了线粒体对细胞生物能量需求进行适应性调整[52]。该研究结果显示Ang Ⅱ处理的大鼠骨髓间充质干细胞中线粒体融合和分裂蛋白的表达水平降低，而AT1aR敲除促进了线粒体的融合和分裂蛋白的表达，表明棕色脂变与线粒体的融合和分裂有着密切的关系，然而其中具体的机制还有待进一步研究探索。
这些发现揭示了肾素血管紧张素系统参与糖脂代谢的新机制，为临床治疗肥胖及其引发的代谢性相关疾病提供了新的理论支持。脂质代谢与肾素血管紧张素系统之间的信号转导是复杂变化的，该研究只从细胞水平进行研究，未结合动物体内实验进一步验证，这是不足之处，更深层的机制以及未解决的问题有待未来进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血管紧张素Ⅱ对大鼠骨髓间充质干细胞棕色脂肪变的抑制作用

Inhibitory effect of angiotensin II on the brown fat differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

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[1]	李加根, 陈跃平, 黄柯琪, 陈尚桐, 黄川洪. 线粒体自噬视域下的类风湿关节炎：多机器学习算法构建预测模型及验证并免疫调控分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(在线): 1-15.
[2]	李花园, 李春, 刘君伟, 王亭, 李龙, 武永利. 温针灸干预慢性疲劳综合征大鼠骨骼肌PINK1/Parkin通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1618-1625.
[3]	朱汉民, 王松, 肖文琳, 张文静, 周茜, 何烨, 李微, . 线粒体自噬调控骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1676-1683.
[4]	刘琪, 李林臻, 李玉生, 焦泓焯, 杨程, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1371-1379.
[5]	章镇宇, 梁秋健, 杨军, 韦相宇, 蒋捷, 黄林科, 谭桢. 新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1437-1447.
[6]	杨治航, 孙祖延, 黄文良, 万喻, 陈仕达, 邓江. 神经生长因子促进兔骨髓间充质干细胞软骨分化并抑制肥大分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1336-1342.
[7]	贺光辉, 原杰, 柯燕琴, 丘小婷, 张晓玲. Hemin调控小鼠软骨细胞氧化应激的线粒体途径[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1183-1191.
[8]	刘凌云, 何贵新, 秦伟彬, 宋惠, 张利文, 唐伟智, 杨斐斐, 朱子一, 欧阳彬. 中药改善心肌损伤：线粒体钙稳态介导巨噬细胞自噬与焦亡的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1276-1284.
[9]	孙现娟, 王秋花, 张锦艺, 杨杨杨, 王文双, 张晓晴. 不同静电纺丝膜上骨髓间充质干细胞的黏附、增殖与成血管平滑肌分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 661-669.
[10]	葛霄, 赵状状, 郭舒瑜, 徐荣耀. HOXA10基因修饰骨髓间充质干细胞促进骨再生[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7701-7708.
[11]	张熊劲夫, 陈奕达, 程歆怡, 刘岱珲, 施勤. 年轻大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体逆转老龄大鼠骨髓间充质干细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7709-7718.
[12]	司马鑫利, 刘丹平, 綦惠. 二甲双胍修饰骨髓间充质干细胞外泌体调节软骨细胞的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(36): 7728-7734.
[13]	蔡之幸, 夏秋芳, 陈莉莉, 朱丹阳, 朱慧雯, 孙亚男, 梁文玉, 赵鹤倩. 柔肌顺膵饮改善2型糖尿病小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7537-7543.
[14]	柳承源, 过倩萍. Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7490-7498.
[15]	张晓宇, 韦善文, 方佳炜, 倪莉. 普鲁士蓝纳米粒子抗氧化恢复退变髓核细胞线粒体功能[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7318-7325.