BYL-719对结核杆菌诱导异常破骨细胞分化的作用及机制

doi:10.12307/2024.833

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (2): 355-360.doi: 10.12307/2024.833

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BYL-719对结核杆菌诱导异常破骨细胞分化的作用及机制

张俊1，郭建1，贾麒钰1，汤丽丽1，王茜1，阿卜杜萨拉木·阿力木江1，吴桐1，买合木提·亚库甫2，马创1

1新疆医科大学第一附属医院创伤骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆医科大学第六附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2024-01-02 接受日期:2024-01-23 出版日期:2025-01-18 发布日期:2024-05-25
通讯作者: 马创，博士，教授，主任医师，新疆医科大学第一附属医院创伤骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:张俊，男，1994年生，江西省上饶市人，汉族，新疆医科大学第一附属医院创伤骨科在读硕士，主要从事细胞实验研究。
基金资助:
省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室开放课题资助项目(SKL-HIDCA-2022-JH3)，项目负责人：马创；国家自然科学基金项目(82260425)，项目负责人：马创；新疆维吾尔自治区重点研发专项(2022B03013-6)，项目负责人：马创；新疆维吾尔自治区“天山英才”青年科技拔尖人才项目(2022TSYCCX0113)，项目负责人：马创

Effect and mechanism of BYL-719 on Mycobacterium tuberculosis-induced differentiation of abnormal osteoclasts

Zhang Jun1, Guo Jian1, Jia Qiyu1, Tang Lili1, Wang Xi1, Abudusalamu · Alimujiang1, Wu Tong1, Maihemuti · Yakufu2, Ma Chuang1

1Department of Traumatology and Orthopaedics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2The Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2024-01-02 Accepted:2024-01-23 Online:2025-01-18 Published:2024-05-25
Contact: Ma Chuang, MD, Professor, Chief physician, Department of Traumatology and Orthopaedics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhang Jun, Master candidate, Department of Traumatology and Orthopaedics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Open Research Project of State Key Laboratory of Causes and Prevention of High Morbidity in Central Asia under the auspices of the Ministry of Education of China and the Ministry of Science and Technology of China, No. SKL-HIDCA-2022-JH3 (to MC); National Natural Science Foundation of China, No. 82260425 (to MC); Key Research and Development Special Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2022B03013-6 (to MC); “Tianshan Talent” Science and Technology Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2022TSYCCX0113 (to MC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
BYL-719(Alpelisib)：是有效、选择性的、具有口服活性的PI3K抑制剂。该药物于2019年被FDA批准与氟维司群合用，主要用于治疗PIK3CA突变的晚期或转移性乳腺癌，并用于其他具有PIK3CA突变的肿瘤，具有抗肿瘤活性。
破骨细胞：是骨稳态平衡两大主要细胞成分之一，作为生理状态下唯一具有骨吸收功能的细胞，通过溶解与吸收骨质参与到骨重建和血钙的动态平衡中。破骨细胞由来源于造血干细胞的粒细胞-巨噬细胞谱系分化来的单核细胞融合而成。破骨细胞的研究对于阐明骨代谢性疾病的发病机制以及为疾病诊疗提供思路和新方法具有至关重要的意义。

背景：PI3K/AKT信号通路调控破骨激活在维持骨稳态中具有关键作用，而骨关节结核中的骨质破坏正是由于结核杆菌感染引起的异常破骨细胞生成所致，但是PI3K信号通路在结核杆菌诱导的异常破骨细胞生成中发挥的作用尚不明确。
目的：探究PI3K/AKT信号通路抑制剂BYL-719对结核杆菌诱导的异常破骨细胞生成的影响及机制。
方法：使用牛结核杆菌卡介苗(BCG)感染RAW264.7细胞，Ag85B进行细胞免疫荧光染色；CCK-8法确定BYL-719安全使用浓度。实验分为空白对照组、BYL-719组、卡介苗组、卡介苗+BYL-719组。各组细胞在RANKL诱导下，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色和鬼笔环肽染色，探究BYL-719对结核杆菌感染后破骨细胞分化、融合的影响；RT-PCR和Western Blot检测破骨细胞相关基因及蛋白表达情况，并进一步探索作用机制。
结果与结论：①免疫荧光染色结果显示，RAW264.7细胞吞噬结核杆菌；②CCK-8数据显示，40 nmol/L浓度BYL-719没有细胞毒性；③抗酒石酸酸性磷酸酶染色和鬼笔环肽染色提示，BYL-719能抑制结核杆菌感染后的破骨细胞生成、融合能力；④RT-PCR和Western blot结果也提示，BYL-719抑制了结核杆菌感染诱导的破骨细胞特异性基因(包括c-Fos、NFATc1、基质金属蛋白酶9和CtsK)表达升高(P < 0.05)；⑤Western blot和免疫荧光染色结果揭示，BYL-719通过下调IκBα-p65来抑制结核杆菌诱导的破骨细胞过度分化；⑥结论：BYL-719通过下调IκBα/p65抑制结核杆菌诱导的异常破骨细胞生成，说明IκBα/p65信号通路是骨关节结核潜在治疗靶点，BYL-719有预防和改善骨关节结核中骨质破坏的潜在价值。

https://orcid.org/0009-0003-9698-2984(张俊)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: BYL-719, 结核杆菌感染, 破骨细胞, 骨结核, PI3K/AKT, RAW264.7, 卡介苗, NF-κB

Abstract: BACKGROUND: The phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase (PI3K/AKT) signaling pathway plays a pivotal role in regulating osteoclast activation, which is essential for maintaining bone homeostasis. Bone destruction in osteoarticular tuberculosis is caused by aberrant osteoclastogenesis induced by Mycobacterium tuberculosis infection. However, the role of the PI3K signaling pathway in Mycobacterium tuberculosis-induced aberrant osteoclastogenesis remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects and mechanisms of the PI3K/AKT signaling pathway inhibitor BYL-719 on aberrant osteoclastogenesis induced by Mycobacterium tuberculosis.
METHODS: RAW264.7 cells were infected with bovine Mycobacterium tuberculosis bacillus calmette-cuerin vaccine, and Ag85B was used for cellular immunofluorescence staining. The cell counting kit-8 assay was employed to determine the safe concentration of BYL-719. There were four groups in the experiment: blank control group, BYL-719 group, BCG group, and BCG+BYL-719 group. Under the induction of receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, the effects of BYL-719 on post-infection osteoclast differentiation and fusion were explored through tartrate-resistant acid phosphatase staining and phalloidin staining. RT-PCR and western blot were used to detect the expression of osteoclast-related genes and proteins, and further investigate the mechanism of action.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunofluorescence staining showed that RAW264.7 cells phagocytosed Mycobacterium tuberculosis. Cell counting kit-8 data indicated that 40 nmol/L BYL-719 was non-toxic to cells. Tartrate-resistant acid phosphatase staining and phalloidin staining showed that BYL-719 inhibited the generation and fusion ability of osteoclasts following infection. RT-PCR and western blot results also indicated that BYL-719 suppressed the upregulation of osteoclast-specific genes (including c-Fos, NFATc1, matrix metalloproteinase 9, and CtsK) induced by Mycobacterium tuberculosis infection (P < 0.05). Western blot and immunofluorescence staining revealed that BYL-719 inhibited excessive osteoclast differentiation induced by Mycobacterium tuberculosis by downregulating the expression of IκBα-p65. To conclude, BYL-719 inhibits aberrant osteoclastogenesis induced by Mycobacterium tuberculosis through the downregulation of IκBα/p65. Therefore, the IκBα/p65 signaling pathway is a potential therapeutic target for osteoarticular tuberculosis, and BYL-719 holds potential value for the preventing and amelioration of bone destruction in osteoarticular tuberculosis. BYL-719 has the potential to prevent and ameliorate bone destruction in osteoarticular tuberculosis.

Key words: BYL-719, Mycobacterium tuberculosis infection, osteoclast, osteoarticular tuberculosis, PI3K/AKT, RAW264.7, bacillus calmette-cuerin vaccine, NF-κB

中图分类号:

张俊, 郭建, 贾麒钰, 汤丽丽, 王茜, 阿卜杜萨拉木·阿力木江, 吴桐, 买合木提·亚库甫, 马创. BYL-719对结核杆菌诱导异常破骨细胞分化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 355-360.

Zhang Jun, Guo Jian, Jia Qiyu, Tang Lili, Wang Xi, Abudusalamu · Alimujiang, Wu Tong, Maihemuti · Yakufu, Ma Chuang. Effect and mechanism of BYL-719 on Mycobacterium tuberculosis-induced differentiation of abnormal osteoclasts [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(2): 355-360.

图/表（结果） 8

2.1 细胞免疫荧光观察体外结核感染情况用MOI为10的卡介苗感染RAW264.7细胞4 h，然后用20 μg/mL庆大霉素杀死细胞外细菌，用Ag85B抗体进行细胞免疫荧光染色。结果显示，RAW264.7细胞的细胞质中出现了明显的Ag85B阳性信号，见图1。
2.2 CCK-8检测BYL-719对RAW264.7细胞的增殖与毒性作用用不同浓度BYL-719(0，2.5，5，10，20，40，
80 nmol/L)分别处理RAW264.7细胞24，48，72 h。CCK-8检测结果分析显示，与0 nmol/L相比，在40 nmol/L及以下浓度的BYL-719干预下，各组细胞存活率大于80%，说明这些浓度的药物没有细胞毒性，见图2。在随后的实验中BYL-719使用浓度为40 nmol/L。
2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测BYL-719对结核杆菌感染下破骨分化的影响用100 ng/mL RANKL诱导各组RAW264.7细胞向破骨分化3-5 d，抗酒石酸酸性磷酸酶染色测定各组RAW264.7细胞向破骨分化情况。抗酒石酸酸性磷酸酶主要存在于破骨细胞和肺泡巨噬细胞，它反映了破骨细胞的活性及骨吸收能力，是破骨细胞的良好标志物。具有3个及以上细胞核的抗酒石酸

酸性磷酸酶阳性细胞(在镜下可见胞质内酶活性部位呈红橙色，细胞核内呈阴性)被鉴定为成熟破骨细胞。结果显示，卡介苗组抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞较空白对照组明显增多(P < 0.000 1)，而卡介苗+
BYL-719组的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞较卡介苗组显著减少(P < 0.000 1)，见图3。
2.4 鬼笔环肽染色检测BYL-719对结核杆菌感染下破骨融合能力的影响各组RAW264.7细胞RANKL诱导破骨分化3-5 d后，进行鬼笔环肽染色测定。鬼笔环肽能结合和稳定丝状肌动蛋白，通过荧光可视化显示出微丝骨架在细胞中的分布。结果显示，卡介苗组破骨细胞的丝状肌动蛋白环较空白对照组明显增大，而在BYL-719干预后，这一过程被抑制，见图4。提示BYL-719可以抑制结核杆菌感染下破骨细胞的融合能力。
2.5 RT-qRCP检测破骨分化相关基因的表达各组用RANKL处理3-5 d后提取细胞总RNA，进行反转录
RT-qRCP检测破骨相关基因c-Fos、NFATc1、CtsK和MMP9的表达。结果显示，卡介苗组在结核杆菌感染后促进了c-Fos、NFATc1、CtsK和MMP9的表达(P < 0.05)，而在BYL-719干预后，这一过程被明显抑制(P < 0.05)，见图5。

2.6 Western blot实验检测破骨分化相关蛋白的表达通过Western blot检测各组破骨分化相关蛋白c-Fos、NFATc1、CtsK和MMP9的表达情况。结果显示，相较于空白对照组，卡介苗组结核杆菌感染显著上调了破骨相关蛋白c-Fos、NFATc1、CtsK和MMP9的表达(P < 0.05)，而BYL-719的干预抑制了这一作用，差异有显著性意义(P <
0.05)，见图6。
2.7 BYL-719对结核杆菌感染诱导的异常破骨分化的抑制作用与核因子κB p65信号通路有关对核因子κB p65基因表达的检测显示，相较于空白对照组，卡介苗组细

胞在诱导破骨分化过程中显著上调了该基因的表达水平(P < 0.001)，提示核因子核因子κB信号通路过度激活；而BYL-719的干预对这一过程表现出明显的抑制作用(P <
0.05)。同时，对核因子κB p65蛋白表达的检测结果与
RT-qRCP检测结果是一致的，卡介苗组p65蛋白表达水平较空白对照组显著增高(P < 0.001)，提示结核杆菌感染促进了核因子κB信号通路的激活；同样的，在BYL-719干预后，卡介苗+BYL-719组的核因子κB p65蛋白的表达较卡介苗组明显降低(P < 0.05)，见图7。

2.8 BYL-719通过抑制核因子κB p65的核转位抑制结核杆菌诱导的破骨细胞生成为了进一步研究潜在机制，将各组RAW264.7细胞用RANKL诱导72 h(卡介苗感染于铺板24 h后进行)，在没有胎牛血清的情况下饥饿细胞12 h，各组分别处理细胞15，30和60 min。对核因子κB p65、磷酸化核因子κB p65、IκBα和P-IκBα进行蛋白质印迹检测。结果表明，在结核杆菌感染下，BYL-719对IκBα的总量影响不大，但下调了P-IκBα，从而明显降低了P-IκBα与IκBα比值。因此，IκBα降解减少，抑制了p65的磷酸化并阻止了p65/p50异二聚体核移位，见图8。此外，通过对核因子κB p65进行免疫荧光染色观察到，在RANKL诱导下，核因子κB p65的核转位较明显，核内出现淡绿色荧光，而卡介苗感染再次加强了这一过程，核内荧光信号升高；重要的是，当使用BYL-719干预时，核因子κB p65的核内绿色荧光再次减弱，提示BYL-719能抑制核因子κB p65的核转位，见图9。

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引言

随着耐药结核病的发病率不断上升，结核感染呈现出令人担忧的趋势[1]，即3%的新发病例和18%的前发病例是耐多药结核病，全球面临着结核耐药形势恶化的挑战[2]。骨关节结核作为最常见的肺外结核类型，正在遵循肺结核的趋势而变化[3-4]，脊柱的受累导致病灶清除困难、感染复发、耐药菌、手术风险大、花费高、畸形、神经功能缺陷、截瘫甚至死亡等诸多问题[5-6]。2018年的肌肉骨骼感染国际共识会议强调了结核性骨髓炎这一临床挑战[7]。骨关节结核导致的个人劳动能力丧失、家庭经济负担加重、国家医疗资源投入加大等系列问题日益突出，已然成为亟待解决的公共卫生问题[8]。
越来越多的证据表明，骨关节结核病灶中的骨质破坏与破骨细胞分化异常密切相关[9]。据报道，结核杆菌诱导小鼠颅骨中破骨细胞的大量募集[10]。此外，在兔的骨关节结核模型病灶中也观察到破骨细胞的过度激活[11]。结核杆菌感染通过引起异常破骨细胞激活，导致骨稳态失衡，骨吸收增加，从而造成骨质破坏。近期研究表明，成纤维细胞生长因子9可以通过刺激磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase，PI3K/AKT)信号通路，促进破骨细胞生成[12]。PI3K/AKT信号通路是调节骨代谢中细胞生长、迁移、分化和免疫反应调节等活动的重要途径[13-14]。一项对小鼠上颌骨代谢的研究也发现，抑制PI3K/AKT信号通路有助于减少破骨分化[15]。此外，一些药物或化学成分也被证实能通过抑制PI3K/AKT信号通路来改善破骨细胞过度活化引起的骨质破坏，展现出全新的临床应用价值[16-17]。积累的证据表明，PI3K/AKT信号通路对于破骨细胞的分化至关重要。在全球结核疫情形势严峻、新型抗结核药物研发进展缓慢的当下，以骨关节结核造成的骨质破坏为切入点，探究PI3K/AKT信号通路在结核感染下异常破骨激活过程中的作用，并阐明骨关节结核破骨致病机制，将为新型骨关节结核抗骨质破坏治疗的开发提供科学理论依据，具有重大的临床意义。
鉴于PI3K/AKT信号通路在结核病灶破骨激活过程中具体的作用及机制尚不明确，该项研究以小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)为研究对象，建立体外结核感染模型，探究PI3K/AKT信号通路抑制剂BYL-719对结核感染下破骨细胞分化的影响，对PI3K/AKT信号通路在结核感染下破骨分化中的作用及机制进行探索，期望能为骨关节结核的抗骨质破坏治疗寻找潜在靶点和提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年12月至2023年11月在新疆医科大学第一附属医院科技楼完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞及卡介苗小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7购自普诺赛(武汉，中国)；牛结核杆菌卡介苗(BCG，bacillus calmette-cuerin vaccine，瑞楚生物，中国)。
1.3.2 主要实验试剂 DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Sigma，美国)；青霉素-链霉素双抗溶液(Biosharp，中国)；CCK-8试剂盒(Bioss，中国)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(Solarbio，中国)；罗丹明标记鬼笔环肽(Solarbio，中国)；总RNA提取试剂盒(成都福际，中国)；PCR引物(生工，中国)；TB Green® Premix Ex Taq™Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，日本)；Ag85b抗体(Bioss，中国)；c-Fos、NFATc1、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)9、CtsK、p65、P-p65、IκBα、P-IκBα抗体(Abcom，英国)；β-actin抗体(Proteintech，中国)；高效RIPA裂解液(Solarbio，中国)；核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)、BYL-719 (MCE，美国)；庆大霉素(Biosharp，中国)。
1.3.3 主要实验仪器 CO2恒温细胞培养箱(Thermo，美国)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)；多功能酶标仪(Thermo，美国)；激光共聚焦显微镜(Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞免疫荧光观察体外结核杆菌感染取培养生长状态良好的RAW264.7细胞，以1×105/孔细胞密度接种于6孔板，每孔加入2 mL完全培养基。24 h细胞贴壁后，用MOI为10的卡介苗(由减毒牛型结核杆菌制成的干粉活菌苗，含量为1×106个/mg，为细胞实验专用型)感染RAW264.7细胞4 h，20 μg/mL庆大霉素杀死细胞外细菌。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞3次，40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，PBS漂洗，0.25%TritonX-100处理细胞10 min，PBS漂洗两三遍，然后用3%的BSA封闭30 min。3% BSA封闭缓冲液1∶200稀释一级抗体(抗Ag85B：不同类型结核杆菌的标记抗原)，4 ℃孵育过夜。第2天复温30 min后，去除一抗，PBS漂洗两三遍。然后荧光二抗(3%BSA稀释，1∶400)避光孵育1 h，DAPI复染核。荧光显微镜下观察拍照。
1.4.2 CCK-8实验 RAW264.7细胞以4×103/孔细胞密度接种于96孔板，每孔加入100 μL完全培养基，每组5个复孔。接种24 h后，BYL-719以培养基稀释，采用含不同浓度PI3K/AKT信号通路抑制剂BYL-719(2.5，5，10，20，40，80 nmol/L)的新鲜DMEM完全培养基替代。细胞培养 24，48，72 h后，加入CCK-8溶液(10 μL/孔)，并在37 ℃下恒温孵育箱避光孵育60 min。酶标仪测定A450吸光度。
1.4.3 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 RAW264.7细胞以2×105/孔细胞密度接种于6孔板，每孔加入2 mL完全培养基。24 h后分组处理，实验分为空白对照组、BYL-719组、卡介苗组、卡介苗+ BYL-719组。空白对照组无特殊处理，BYL-719组加入40 nmol/L BYL-719，卡介苗组加入卡介苗感染4 h，卡介苗+BYL-719组在卡介苗感染4 h后加入40 nmol/L BYL-719。各组用2 mL含有100 ng/mL RANKL和20 μg/mL庆大霉素(以杀死细胞外细菌)的DMEM完全培养基培养细胞，培养基每2 d更换1次。破骨诱导3-5 d后，显微镜下可见大量破骨细胞生成。使用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，PBS冲洗，然后根据试剂说明进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。显微镜下观察拍照。
1.4.4 鬼笔环肽染色 RAW264.7细胞以每皿1×105细胞密度接种于激光共聚焦小皿。24 h后分组处理方法同1.4.3。
100 ng/mL RANKL破骨诱导3-5 d后，细胞使用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3遍，0.25%TritonX-100处理细胞10 min，PBS漂洗，然后根据试剂说明进行鬼笔环肽染色。激光共聚焦显微镜下观察丝状肌动蛋白的荧光图像，拍照。
1.4.5 RT-qRCP实验 RAW264.7细胞分组及处理同1.4.3。破骨诱导3-5 d后，按照试剂盒说明书提取各组细胞总RNA。反转录cDNA 第一链，反转录条件：25 ℃5 min、50 ℃30 min、85 ℃5 s。然后进行RT-qRCP，PCR的循环条件：95 ℃20 s预变性；95 ℃5 s、60 ℃30 s，共40个循环，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算破骨细胞分化相关靶基因的表达水平，内参基因β-actin为标准，实验重复3次。引物序列信息见表1。

1.4.6 Western blot实验 RAW264.7细胞分组及处理同1.4.3。破骨诱导3-5 d后，用含有新鲜蛋白酶抑制剂PMSF(1 mmol/L)的高效RIPA裂解液裂解细胞，提取各组细胞总蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒测定各组蛋白浓度。取等量蛋白在10%的SDS-PAGE凝胶中运行，然后转移到PVDF膜上，室温下用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，用相应抗鼠稀释一抗(c-Fos、NFATc1、MMP9、CtsK、p65，稀释比例分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶5 000)孵育，4 ℃过夜。第2天，TBST洗涤，室温下山羊抗兔二抗(1∶5 000)避光孵育1 h，TBST洗涤。采用ECL化学发光法显影，Image J软件对破骨细胞分化相关蛋白各条带灰度值进行定量测定，实验重复3次。
1.4.7 Western blot及细胞免疫荧光检测为了进一步研究潜在机制，对RAW264.7细胞分组及处理(同1.4.3)。破骨诱导3-5 d后，在没有胎牛血清的情况下饥饿细胞12 h，然后各组再分别处理细胞15，30和60 min。分别提取各组细胞总蛋白，Western blot检测p65、P-p65、IκBα和P-IκBα表达情况(方法同1.4.6，一抗稀释比例分别为1∶5 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶5 000)。此外，通过细胞免疫荧光实验(方法同1.4.1，p65一抗稀释比例1∶200)，观察各组细胞饥饿后分别处理1 h的p65核位移情况。
1.5 主要观察指标 ①RAW264.7细胞体外结核感染情况；②BYL-719对RAW264.7细胞的增殖与毒性作用；③BYL-719对结核杆菌感染后破骨细胞分化、融合的影响；④破骨细胞相关基因及蛋白的表达。
1.6 统计学分析对各项检测结果使用SPSS 25.0统计学软件方法对数据进行统计学处理，计量数据符合正态分布方差齐，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05时认为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过新疆医科大学统计学专家审核、通过。

讨论

骨修复重建是一个动态反应过程，在成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间维持着微妙平衡，骨稳态失衡将导致病理性炎症性骨疾病[18-19]。研究表明，结核杆菌感染正是通过诱导异常破骨细胞活化、增强骨吸收导致骨代谢平衡紊乱，从而造成骨质破坏[20-21]。而在此次研究过程中，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色和鬼笔环肽染色也观察到结核杆菌诱导破骨细胞的大量募集。随着对诱导破骨细胞分化机制的不断深入探索，越来越多的研究表明，破骨细胞的分化是包括PI3K-AKT、MAPK和共刺激调节途径在内的多种途径共同参与的结果，PI3K-AKT信号通路在破骨细胞谱系分化过程中扮演着重要角色[22-24]。这些证据表明，PI3K-AKT信号通路在结核杆菌感染诱导的异常破骨细胞生成过程中发挥着重要作用。
结核杆菌是一种细胞内细菌，通过巨噬细胞吞噬躲避宿主免疫防御而在细胞内存活和复制[25]。此次研究使用的牛结核杆菌卡介苗是由减毒牛型结核杆菌制成的活菌苗。目前，世界上多数国家都已将卡介苗列为计划免疫必须接种的疫苗之一，具有安全性。卡介苗感染RAW264.7细胞后，通过结核杆菌标记抗原Ag85B免疫荧光染色，观察到RAW264.7细胞对结核杆菌的吞噬。诱导RAW264.7细胞破骨分化是目前体外研究破骨细胞时最常用的诱导方法，它突破了破骨细胞不能增殖传代的限制，可获得的细胞具有数量大、细胞纯度高、均一性好、骨吸收能力也较强等诸多优点[26]。在RANKL诱导下，使用PI3K/AKT抑制剂BYL-719干预卡介苗感染下的破骨细胞生成，抗酒石酸酸性磷酸酶染色和鬼笔环肽染色结果显示，结核杆菌感染诱导了异常的破骨细胞生成、成熟，而BYL-719明显抑制了这一作用。与染色结果一致的，RT-qRCP和Western blot也检测到破骨细胞特异性蛋白(包括MMP9和CtsK)在卡介苗组表达显著增多，它们的分泌与破骨细胞降解有机骨基质密切相关[27]，而BYL-719明显抑制了这一过程，初步得出结论，BYL-719能抑制结核杆菌感染诱导的破骨细胞过度分化和成熟，对结核杆菌引起的骨吸收具有保护作用。
据报道，巨噬细胞可上调核因子κB的表达，后者的激活主要启动了下游c-Fos和NFATc1的表达，这对破骨细胞的细胞命运起着至关重要的作用，是促进破骨细胞的分化和功能成熟，从而增强吞噬作用的关键[28]。在此次项研究中，RAW264.7细胞吞噬卡介苗后，同样显著上调了核因子κB p65基因及蛋白的表达水平；同时，下游c-Fos和NFATc1的表达同步增高，说明结核杆菌可以通过上调核因子κB信号通路的激活来促进破骨细胞生成、成熟，从而造成骨关节结核中的骨质破坏；而这一作用能被BYL-719
抑制。因此，研究认为BYL-719对骨关节结核中骨质破坏治疗的潜在靶点可能与核因子κB p65有关。
此次研究进一步探索了BYL-719通过调节核因子κB信号通路与破骨细胞生成之间的潜在机制。作为破骨细胞生成、成熟的主要调节途径之一，核因子κB通常稳定地存在于细胞胞浆中，但在RANKL刺激下核因子κB可迅速进入细胞核[29]。核因子κB的核位移是一个动态过程，正常情况下核因子κB在细胞质中被IκBα蛋白抑制，在IκBα磷酸化后，IκBα解除了对核因子κB的抑制，然后p65位移到细胞核，通过与核因子κB反应元件结合来促进基因转录[30-31]。多项研究表明，抑制IκBα磷酸化是抑制破骨细胞生成、成熟，减少骨吸收的有效途径[32-33]。与这些研究结论相一致的，此次研究结果也表明BYL-719对IκBα的总量没有明显影响，但是显著下调了P-IκBα，从而降低了P-IκBα与IκBα的比率；IκBα降解减少，抑制了p65的磷酸化并阻止了p65/p50异二聚体核移位。与Western blot结果相一致的，研究中p65免疫荧光结果表明，结核杆菌感染促进了p65核位移，从而上调了破骨相关基因的转录，促进了破骨细胞生成、成熟，造成了骨关节结核中明显的骨质破坏；而BYL-719通过抑制核因子κB p65磷酸化，下调p65/p50异二聚体核移位。总之，BYL-719通过下调IκBα/p65信号通路抑制结核杆菌诱导的异常破骨细胞生成、成熟，具有抗骨质破坏作用。
然而，此次研究也存在一些局限性。首先，由于生物安全问题和实验条件的限制，使用了牛结核杆菌卡介苗代替强毒力H37Rv株作为感染源；此外，还需要进一步的动物研究明确其效果，为临床应用奠定基础；最后，BYL-719的安全浓度及全身反应性有待临床进一步探讨。
结论：结核杆菌感染导致破骨细胞过度分化，而BYL-719可通过下调IκBα/p65信号通路进而抑制结核杆菌诱导的异常破骨细胞分化、成熟。简言之，IκBα/p65信号通路可作为骨关节结核潜在治疗靶点，BYL-719具有有效预防和改善骨关节结核中骨质破坏的潜在应用价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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BYL-719对结核杆菌诱导异常破骨细胞分化的作用及机制

Effect and mechanism of BYL-719 on Mycobacterium tuberculosis-induced differentiation of abnormal osteoclasts

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