基于微流控芯片评估富血小板血浆促进子宫内膜细胞的增殖

doi:10.12307/2025.410

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (10): 2091-2096.doi: 10.12307/2025.410

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基于微流控芯片评估富血小板血浆促进子宫内膜细胞的增殖

闻哲嘉，吕芳

苏州大学附属第二医院生殖中心，江苏省苏州市 215004

收稿日期:2024-01-11 接受日期:2024-03-06 出版日期:2025-04-08 发布日期:2024-08-22
通讯作者: 吕芳，博士，研究员，副教授，硕士生导师，苏州大学附属第二医院生殖医学中心，江苏省苏州市 215004
作者简介:闻哲嘉，女，1993年生，江苏省苏州市人，汉族，苏州大学附属第二医院在读硕士，主要从事微流控芯片和子宫内膜间质细胞的生物学行为方面的研究。
基金资助:
苏州市医疗卫生科技创新应用基础研究(SKJY2021096)，项目负责人：吕芳；苏州大学附属第二医院科教兴院人才托举项目A类(XKTJ-RC202002)，项目负责人：吕芳；国家卫生健康委员会生殖健康药具重点实验室开放课题(KF2023-2)，项目负责人：吕芳

Promotion of endometrial cell proliferation evaluated by platelet-rich plasma based on microfluidic chips

Wen Zhejia, Lyu Fang

Reproductive Medicine Center, Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China

Received:2024-01-11 Accepted:2024-03-06 Online:2025-04-08 Published:2024-08-22
Contact: Lyu Fang, PhD, Researcher, Associate professor, Master’s supervisor, Reproductive Medicine Center, Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
About author:Wen Zhejia, Master candidate, Reproductive Medicine Center, Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
Supported by:
Basic Research on Innovative Application of Medical and Health Technology in Suzhou City, No. SKJY2021096 (to LF); Class A Talent Support Project for Science and Education Revitalization of Affiliated Second Hospital of Suzhou University, No. XKTJ-RC202002 (to LF); Open Project of Key Laboratory of Reproductive Health Pharmaceuticals of National Health Commission, No. KF2023-2 (to LF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
微流控芯片：通过将样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米甚至更小的芯片上，由微通道形成网络，实现控制流体贯穿整个体外培养系统。
富血小板血浆：通过离心自体全血并从中提取出的血小板浓缩物。富血小板血浆中含有大量的生长因子(如血小板源性生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1等)以及蛋白质和其他生物活性成分。

背景：富血小板血浆可促进薄型子宫内膜细胞的增殖，但存在剂量难以控制、取样困难等问题。微流控芯片具有高通量、低消耗、操作简便等优点，为模拟子宫内膜细胞在体微环境提供了新途径。
目的：利用三通道微流控芯片构建富血小板血浆促进子宫内膜细胞增殖的研究模型。
方法：从1名女性外周静脉血中提取富血小板血浆。采用含不同浓度[0%(对照)，0.5%，1%，2%]富血小板血浆的无血清细胞培养基培养人子宫内膜间质细胞，采用划痕实验检测细胞迁移，CCK-8法检测细胞增殖。利用聚二甲基硅氧烷胶制备微流控芯片，该微流控芯片设计有3个通道，中间通道为细胞外基质水凝胶通道，左右两侧分别为人子宫内膜间质细胞及富血小板血浆通道，3个通道之间保存有可以相互沟通以及实现物质交换的面积，实验组两侧通道分别加入人子宫内膜间质细胞(绿色荧光蛋白GFP标记)和含0.5%富血小板血浆的无血清培养基，对照组两侧通道分别加入人子宫内膜间质细胞(绿色荧光蛋白GFP标记)和无血清细胞培养基，共培养48 h后，采用Ki67免疫荧光染色观察细胞增殖与迁移。
结果与结论：①细胞划痕实验和CCK-8检测结果显示，与对照组相比，0.5%，1%，2%浓度的富血小板血浆可促进人子宫内膜间质细胞的迁移与增殖(P < 0.05)，并且0.5%浓度富血小板血浆的促进细胞迁移与增殖作用强于其他2个浓度(P < 0.05)；②Ki67免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，实验组人子宫内膜间质细胞的增殖和迁移能力更强；③实验证实通过三通道微流控芯片可以模拟子宫内膜细胞的微环境，同时利用该系统验证了富血小板血浆可显著促进子宫内膜间质细胞的增殖与迁移。
https://orcid.org/0009-0001-5881-7561 (闻哲嘉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 微流控芯片, 富血小板血浆, 子宫内膜间质细胞, 子宫内膜增殖, 迁移, 细胞外基质, 薄型子宫内膜, 子宫内膜相关疾病

Abstract: BACKGROUND: Platelet-rich plasma is used to promote the proliferation of thin endometrial cells, but there are problems with difficult dose control and sampling. Microfluidic-chips have the advantages of high throughput, low consumption, and simplified operation, providing a new approach to simulate the in vivo microenvironment of endometrial cells.
OBJECTIVE: To establish a model of promoting endometrial cell proliferation with platelet-rich plasma by the three-channel microfluidic-chip.
METHODS: Platelet-rich plasma was extracted from peripheral venous blood of a female. Human endometrial stromal cells were cultured in serum-free cell media with different concentrations of platelet-rich plasma [0%(control), 0.5%, 1%, and 2%]. Cell migration was detected by scratch test. Cell proliferation was
detected by CCK-8 assay. A microfluidic chip was prepared by using polydimethylsiloxane adhesive. The microfluidic chip was designed with three channels. The middle channel was the extracellular matrix hydrogel channel. Human endometrial stromal cells and platelet-rich plasma channels were found on the left and right sides. There was an area between the three channels that could communicate with each other and realize material exchange. Human endometrial stromal cells (labeled with green fluorescent protein GFP) and serum-free medium containing 0.5% platelet-rich plasma were added to both sides of the experimental group. Human endometrial stromal cells (labeled with green fluorescent protein GFP) and serum-free cell media were added to both sides of the control group. After co-culture for 48 hours, the cell proliferation and migration were observed by Ki67 immunofluorescence staining.
RESLUTS AND CONCLUSION: (1) The results of cell scratch test and CCK-8 assay showed that compared with the control group, platelet-rich plasma at 0.5%, 1%, and 2% concentrations could promote the migration and proliferation of human endometrial stromal cells (P < 0.05). In addition, the promotion of cell migration and proliferation of platelet-rich plasma with 0.5% concentration was stronger than that of the other two concentrations (P < 0.05). (2) Ki67 immunofluorescence staining showed that compared with the control group, the proliferation and migration abilities of endometrial stromal cells were stronger in the experimental group. (3) The experiment proves that the microenvironment of endometrial cells can be simulated by the three-channel microfluidic chip. At the same time, the system has proven that platelet-rich plasma can significantly promote the proliferation and migration of endometrial stromal cells.

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Key words: microfluidic-chip, platelet-rich plasma, endometrial stromal cell, endometrium proliferation, migration, extracellular matrix, thin endometrium, endometrial-related disease

中图分类号:

闻哲嘉, 吕芳. 基于微流控芯片评估富血小板血浆促进子宫内膜细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(10): 2091-2096.

Wen Zhejia, Lyu Fang. Promotion of endometrial cell proliferation evaluated by platelet-rich plasma based on microfluidic chips[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(10): 2091-2096.

图/表（结果） 3

2.1 富血小板血浆的制备外周血中血小板富集之前，血常规检测：血小板浓度为28×109 L-1。富血小板血浆中的血小板浓度为4 490×109 L-1，将血小板富集了约15倍，符合富血小板血浆制备标准[13](富血小板血浆中的血小板浓度≥4倍患者血小板基础浓度)。
2.2 不同浓度富血小板血浆对人子宫内膜间质细胞迁移的影响划痕实验结果显示，与对照组比较，0.5%，1%，2%的富血小板血浆能够促进体外子宫内膜间质细胞的迁移，并且在细胞与富血小板血浆共培养36 h时出现了显著的迁移，同时0.5%浓度富血小板血浆促进人子宫内膜间质细胞迁移的能力强于其他2个浓度(P < 0.001)，见图3。

2.3 不同浓度富血小板血浆对人子宫内膜间质细胞增殖的影响随着培养时间的延长，各组细胞吸光度值升高，与对照组相比，0.5%，1%，2%浓度的富血小板血浆可促进体外子宫内膜间质细胞增殖，并且0.5%浓度富血小板血浆促进人子宫内膜间质细胞增殖的能力强于其他2个浓度(P < 0.001)，见图4。

2.4 微流控芯片系统显示富血小板血浆对人子宫内膜间质细胞增殖增殖和迁移的影响与对照组比较，实验组的人子宫内膜间质细胞增殖、迁移显著，并且能够突破中间的细胞外基质水凝胶层，在芯片通道内实现3D立体的生长(图5)。这可能与富血小板血浆中的细胞因子或者一些可溶性的生长因子能够通过细胞外基质水凝胶扩散，从而介导子宫内膜间质细胞的一些生物学行为，如增殖、迁移等。因此，此次实验证实了微流控芯片能够实现对体内子宫内膜组织微环境的3D模拟，使子宫内膜间质细胞保持了一定的增殖与迁移能力。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，组间比较进行单向方差分析。
1.2 时间及地点实验于2023年3-12月在苏州大学附属第二医院实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞与血液来源人子宫内膜间质细胞系购自ATCC细胞库(美国)。成人外周静脉血样本来自1名28岁的健康育龄期妇女，已排除乙肝、丙肝、梅毒及艾滋等传染性及血液方面疾病，供者对研究知情同意并签署了知情同意书。研究方案已通过经苏州大学附属第二医院医学伦理委员会批准，函号：EC2023(217)号。
1.3.2 主要试剂与仪器无酚红DMEM/F12、丙酮酸钠、碳酸氢钠、青霉素-链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒1%(Gibco，美国)；碳吸附胎牛血清(Viva Cell，中国)；嘌呤霉素(MCE，美国)；大鼠尾胶原Ⅰ型(Corning，美国)、M基质胶(Corning，美国)；纤粘连蛋白(来源人血)(Solarbio，中国)；绿色荧光细胞追踪剂(5 μg/mL，Thermo Fisher Scientific美国)；兔单克隆抗体Ki67(Affinity，中国，AF0198)；驴抗兔 IgG(Abcam，英国，ab175470)；倒置显微镜(IMT-2，日本OLYMPUS公司)；多功能酶标仪(Infinite 200 PRO，瑞士TECAN公司)；激光共聚焦扫描显微镜(LSM880，德国Zeiss公司)。
1.4 方法
1.4.1 人子宫内膜间质细胞培养基的制备无酚红DMEM/F12 43 mL，碳吸附特级胎牛血清5 mL，1%青霉素-链霉素 500 μL，碳酸氢钠(1.5 g/L)与丙酮酸(1 mmol/L)(称量0.75 g碳酸氧钠，0.055 g丙酮酸，溶于10 mL灭菌PBS中，用无菌针头式过滤器除菌过滤1遍) 混合液1 mL，1%胰岛素-转铁蛋白-硒500 μL，500 ng/mL嘌呤霉素(根据配置浓度，先配置10 000×原液，即5 mg/mL)5 μL。
1.4.2 细胞外基质水凝胶溶液的制备在4 ℃低温环境下操作，将大鼠尾胶原Ⅰ型(8 mg/mL)溶液用无酚红DMEM/F12混合至生理pH值(7.35-7.45)，再将基质胶(10 mg/mL)与大鼠尾胶原Ⅰ型溶液按体积比4∶1混合[9]。
1.4.3 富血小板血浆的制备采集志愿者20 mL外周血于抗凝管(cf-DNA血液抗凝剂)中，18 ℃下300×g离心20 min，离心后主要分为上层血浆层，含有血小板及白细胞，中间薄膜层为富含白细胞层，下层主要为红细胞层。取上层液体转移至新的无菌离心管，18 ℃下600×g离心15min，留取血浆沉淀。取0.5 mL血浆沉淀重悬，使用血常规计数富血小板含量，其余分装保存于-80 ℃备用[10]。
1.4.4 富血小板血浆对人子宫内膜间质细胞迁移的影响将人子宫内膜间质细胞按照5×105/孔的密度接种于6孔板中，细胞融合至约90%时，使用无菌200 μL移液枪吸头在6孔板每个孔的相同位置刮擦单层的细胞，形成均匀一致的划痕，用PBS清洗划痕区域3次以去除细胞碎片。然后加入含不同浓度[0%(对照)，0.5%，1%，2%]富血小板血浆的无血清培养基。培养0，12，24，36，48 h，通过倒置显微镜观察划痕状态并收集代表性图像。采用Image J软件计算细胞迁移面积，迁移面积(%)=某一时间划痕面积/初始划痕面积。
1.4.5 富血小板血浆对人子宫内膜间质细胞增殖的影响将人子宫内膜间质细胞按照3 000个/孔的密度接种于96孔板中，加入含不同浓度[0%(对照)，0.5%，1%，2%]富血小板血浆的无血清培养基，每种浓度设置3个复孔，2个空白孔仅加入无血清培养基且无细胞。置于细胞培养箱常规培养，每隔12 h，每孔加 10 μL CCK-8 溶液37 ℃避光孵育1 h，使用功能酶标仪测定450 nm处的吸光度值，绘制细胞生长曲线。
1.4.6 微流控芯片的制备及其中细胞的接种及培养

采用标准软光刻法制作微流控芯片[11]：微流控芯片设计有3个通道，中间通道为细胞外基质水凝胶通道，其左右两侧分别为人子宫内膜间质细胞及富血小板血浆通道，3个通道之间保存有可以相互沟通以及实现物质交换的面积(图1)。将聚二甲基硅氧烷胶与固化剂邻苯二甲酸二丁酯以质量比10∶1充分混合。将混合好的聚二甲基硅氧烷胶放入真空除泡器里，抽取真空，以去除混合物中的气泡，然后将该混合物倒在通过标准光刻方法制造的含有微通道的SU-8模板上，在 70-80 ℃下烘干0.5 h；聚二甲基硅氧烷胶固化后取出，使用切割器根据需要切割聚二甲基硅氧烷胶芯片，制备所需尺寸芯片，同时使用0.5 mm打孔器在3个通道的两端打孔，作为流体进出口通道。然后将芯片放入等离子体中进行表面处理，通过聚二甲基硅氧烷胶冲压方法将聚二甲基硅氧烷胶板黏合到另一个空白聚二甲基硅氧烷胶层(厚度约100 μm)上[12]，创建一个完全封闭空间。为了在培养期间向相应细胞培养通道加入培养基，制作了4个含有直径为7 mm孔洞的聚二甲基硅氧烷胶板，这些孔洞用作介质储存器，称为细胞储液池，这些孔洞直接覆盖在下面细胞培养通道的入口和出口上。在使用微流控芯片之前首先用体积分数75%乙醇进行通道消毒，然后紫外线照射30 min消毒，风干过夜，保持通道干燥、无菌。

微流控芯片中的细胞接种与培养：在中间通道接种在4 ℃低温环境下配置的细胞外基质水凝胶约5 μL，在这个过程中，凝胶液体一定的表面张力可以保持凝胶在中间通道流动而不会扩散至两侧通道。然后将芯片放置于37 ℃温箱中10 min左右，等待成胶。当细胞外基质水凝胶在中间通道成胶后，便成功将细胞及富血小板血浆通道分隔开，以此来模拟体内子宫内膜中不同细胞层之间相隔的情况。在细胞通道注入约10 μL纤维连接蛋白溶液37 ℃下处理2 h，以促进细胞的附着。2 h后，实验组在细胞外基质水凝胶两侧通道分别加入10 µL人子宫内膜间质细胞和含0.5%富血小板血浆的无血清培养基10 µL，对照组在细胞外基质水凝胶两侧通道分别加入10 µL人子宫内膜间质细胞和无血清培养基10 µL，注入的细胞处于对数生长期且经绿色荧光细胞追踪剂标记，细胞浓度均为1×1010 L-1，然后将储液池放置在所有芯片上，以减少芯片中液体的蒸发以及为细胞更换培养基。培养48 h后，对芯片进行染色或其他实验步骤(图2)。

Ki67免疫荧光染色：培养48 h后取下储液池，加入40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，0.1% Triton X-100室温通透细胞20 min，加入5%驴血清+2%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔单克隆抗体Ki67(1∶500)4 ℃孵育过夜；第2天，用PBST浸洗3次，每次5 min(充分洗涤)；加入相应的荧光二抗，驴抗兔 IgG(1∶500)避光室温孵育1 h，用PBST浸洗3次，每次5 min；洗涤后用DAPI染细胞核，荧光共聚焦显微镜下观察实验结果。
1.5 主要观察指标富血小板血浆对人子宫内膜间质细胞增殖与迁移的影响。
1.6 统计学分析采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计分析，对于细胞培养实验，每个实验重复3次，数据表示为x±s。组间比较进行单向方差分析。当P < 0.05时表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

此次实验设计并研制了富血小板血浆、细胞外基质以及人子宫内膜间质细胞共培养的三通道微流控芯片培养系统，利用该系统较准确地评估了富血小板血浆对子宫内膜间质细胞增殖、迁移能力的影响，验证了富血小板血浆能够显著促进子宫内膜间质细胞的增殖与迁移。富血小板血浆宫腔内灌注在薄型子宫内膜、反复植入失败、慢性子宫内膜炎和Asherman综合征等的临床应用逐渐增多[14]。大多数临床研究中，富血小板血浆在进行宫腔灌注前需要用牛凝血酶和CaCl2进行激活[10]，这种人工激活会使富血小板血浆在15 min至24 h内立即释放重要的血小板生长因子。而对于此次体外细胞培养，需要从血小板脱颗粒中缓慢释放生长因子[15]，因此并没有对富血小板血浆进行激活。由于每个人体内的血小板含量不同，体外富集之后会造成血小板数量上以及细胞因子含量的巨大差异，因此对富血小板血浆中血小板的数量进行精准定量后开展实验，以增加在体外研究富血小板血浆促进子宫内膜细胞增殖的精确性[16-17]。细胞迁移是一种复杂的现象，在各种生物过程中起着关键作用，包括胚胎发育、伤口愈合和免疫反应。肿瘤侵袭和转移扩散等病理过程也依赖于细胞迁移[18]，例如：已经进化为恶性表型的细胞可以利用上皮-间充质转化来启动运动，侵入周围组织并到达体内的远处器官[19]。在体内，组织通常具有致密的三维支架，由蛋白聚糖组成的细胞外基质以水凝胶的形式占据细胞外空间，交织着多种纤维蛋白，如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和层粘连蛋白[20]。由于复杂的细胞外微环境，体内细胞的迁移和扩散发生在周围细胞外基质不同程度的限制下，这种限制可以触发多种细胞反应[21]，因此，研究细胞的运动和迁移模式以及复制人体组织的生理学，特别是细胞外基质的机械、结构和化学特性，有重大意义[22]。此次实验设计的微流控芯片系统通过在中间通道填充细胞外基质水凝胶，实现人子宫内膜间质细胞与细胞外基质、富血小板血浆与细胞外基质的相互接触，精确模拟体内子宫微生理环境，在微观尺度上实时可视化了解富血小板血浆促进人子宫内膜间质细胞的迁移与增殖。这对于观察子宫内膜间质细胞的细胞生物学行为和分析富血小板血浆中各种生长因子和细胞因子如何协同作用，促进子宫内膜细胞的增殖和迁移，以及探讨富血小板血浆如何影响细胞外基质的组成和功能，进而对子宫内膜细胞的生长和分化产生影响的过程至关重要，同时也有利于研究富血小板血浆在体内的流体动力学特征以及营养物质代谢[23]。
微流控芯片系统在研究细胞迁移、增殖相关实验方面有一定的优势，还可以进行多通道设计，以保证细胞的多样性、复杂性[24]。当然，在该模型的微环境中缺乏性激素是一个限制。性激素是一种小尺寸的疏水性分子，对于子宫内膜的生长至关重要，但微流控芯片培养系统的聚二甲基硅氧烷胶可以吸收小的疏水性分子[25]，若加入性激素，需要修改聚二甲基硅氧烷胶制成的细胞培养通道表面的化学性能[26]，以保证性激素能发挥作用。

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[1]	张梓宁, 邓荣辉, 余家阔. 新型含Mn生物陶瓷粉体减轻软骨细胞的氧化应激损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(16): 3335-3342.
[2]	赵文琪, 于海驰, 宋艺儒, 袁天阳, 刘钦毅. 富血小板血浆及水凝胶治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(10): 2189-2200.