2.1  人脐血间充质干细胞的形态及表面标志物  第3-6代人脐血间充质干细胞的形态，见图1，在倒置显微镜下，细胞呈贴壁生长，呈成纤维细胞样，排列有序，细胞形态均一，折光性好，边界清晰；从第3代传代到第6代，细胞形态无明显变化。

流式细胞仪检测结果显示：第6代人脐血间充质干细胞表达CD105的阳性率为98%，CD29的阳性率为99.9%，CD90的阳性率为66.9%，CD34、CD45的阳性率分别为0.3%，0.20%，见图2。

2.2  CM-DiL荧光染剂标记的人脐血间充质干细胞  标记第1天，细胞呈梭形贴壁生长，在荧光显微镜下观察，细胞膜和细胞质呈现红色荧光，细胞核未被标记呈黑色；在低倍镜下细胞呈类圆形或环形，在高倍镜下细胞呈梭形；第7，14天时，红色荧光仍然很强；第21天时荧光强度明显减弱，高倍镜下很难看出细胞形态，见图3。

第1，7，14，21天CM-DiL标记阳性率分别为99.8%，66.9%，31.7%，4.1%，见图4。

2.3  实验动物数量分析  实验组参加实验小鼠20只，进入结果分析15只，剩余5只于移植后第28天与移植后第21天无差异，未纳入实验分析；对照组参加实验小鼠20只，进入结果分析15只，有4只小鼠于移植后第7-14天之间陆续死亡，死亡小鼠口、鼻可见出血，解剖小鼠可见内脏出血，考虑为血小板过低，死于出血，剩余1只小鼠于移植后28天与第21天无差异，未纳入实验分析；正常组参加实验小鼠10只均进入结果分析。

2.4  骨髓造血损伤小鼠模型  总剂量为6 Gy X射线照射建立骨髓造血损伤小鼠模型。造模后第1，5，7，14天小鼠外周血出现白细胞、红细胞、血小板计数和血红蛋白浓度下降，以造模后第7天下降最为明显，造模后第14天外周血三系开始恢复，造模后第21天时外周血恢复正常。骨髓涂片显示，造模后第1，5，7，14天小鼠骨髓出现造血功能抑制，骨髓增生减低，有核细胞明显减少，以第7天为甚，造模后第14天骨髓增生较前有所恢复；造模后第21天小鼠骨髓造血功能恢复，与正常小鼠骨髓涂片相比无差异。造模后第1，5，7，14，21天骨髓涂片与正常小鼠骨髓涂片对比，见图5。

2.5  人脐血间充质干细胞移植治疗骨髓造血损伤小鼠

2.5.1  小鼠一般情况  移植后7 d，实验组和对照组小鼠毛发蓬松，各小鼠喜抱团卷曲在一起，反应迟钝，活动迟缓，进食及饮水减少，活动减少，小鼠耳郭、趾尖出现苍白。正常组小鼠无明显变化。移植后第14-21天，实验组和对照组小鼠进食及饮水量逐渐恢复，活动增加，小鼠耳郭和趾尖逐渐恢复红润；第21天以后实验组和对照组一般情况与正常组小鼠无明显差异，但实验组与对照组小鼠毛发较正常组小鼠仍较蓬松。

2.5.2  小鼠外周血血象恢复情况  各组小鼠外周血白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板变化，见表1-4。与正常组比较，实验组及对照组白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白浓度、血小板计数显著下降，其中血小板下降最为明显，在第7天时三系下降最为明显，第14天时白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板较前有所恢复，第21天时三系恢复正常；实验组与对照组在第7天和第14天时各项指标比较，差异有显著性意义。

2.5.3  小鼠骨髓涂片结果  与正常组相比，移植后1，5，7，14天实验组及对照组小鼠骨髓均出现增生减低，有核细胞明显减少，以第7天为甚，移植后第14天骨髓增生较前有所恢复，但实验组有核细胞数量较对照组明显增多；移植后21天实验组及对照组小鼠骨髓造血功能恢复，与正常组相比无差异，见图6。

2.5.4  小鼠骨髓活检结果  移植后第1，5，7天实验组及对照组小鼠骨髓均出现造血功能抑制，有核细胞增生减低，非造血细胞比例升高，特别是第7天时有核细胞数量明显减少，脂肪组织增多，可见大量空泡；移植后第14天，两组小鼠造血功能较前均有恢复，实验组骨髓增生明显比对照组好，有核细胞成簇分布，有核细胞增生活跃；移植后第21天两组小鼠骨髓造血功能恢复正常，见图7。

2.5.5  CM-DiL示踪结果  移植后第1，5，7，14，21天荧光显微镜观察可见涂片中有少部分细胞在绿色光激发下细胞膜和细胞质呈红色，在蓝色光激发下有核细胞的细胞核均染成蓝色。在荧光显微镜下，同一视野中细胞质和细胞膜呈红色，同时细胞核呈蓝色的细胞，即为标记的人脐血间充质干细胞，见图8。

骨髓是造血干细胞在成体中定居的主要部位，也是造血微环境所在的部位。造血微环境是指造血干细胞存在于其中的一群组织细胞和细胞外基质，它们分泌多种信号分子，控制着造血干细胞的自我更新和祖细胞的产生^[1-2]。骨髓基质细胞由成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、成骨细胞、内皮细胞及脂肪细胞等组成^[3]。由发育早期中、外胚层发育而来的间充质干细胞具有强大的生物学特性，如免疫调控、向多个胚层细胞分化及支持造血等^[4]。间充质干细胞可分化成多种骨髓基质细胞，对造血起支持作用^[5]。人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUBMSCs)具有来源广、取材方便、感染病毒可能性小、可以耐受免疫反应^[6]、不存在伦理争议等优点。在对人脐血间充质干细胞造血支持方面的研究中发现，其可以支持和促进造血细胞生长；与骨髓间充质干细胞相比，人脐血间充质干细胞更为幼稚，其增殖分化能力更强。人脐血间充质干细胞不但具有支持造血功能，在一定条件下还可诱导其向脂肪细胞、骨细胞分   化^[7]。目前人脐血间充质干细胞用于修复急性造血功能损伤的研究较少。因此，该研究制备骨髓造血损伤小鼠模型，给予尾静脉移植CM-DiL荧光标记的人脐血间充质干细胞，研究人脐血间充质干细胞在小鼠体内的归巢，为临床应用脐血间充质干细胞促进骨髓造血功能恢复提供理论依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年1月至2018年7月在西南医科大学附属医院医学实验中心室完成。

1.3  材料  人脐血间充质干细胞由四川新生命干细胞科技股份有限公司提供；流式抗体CD90、CD29、CD105、CD34、CD45(美国BD公司)；CM-DiL荧光染剂(美国Invitrogen公司)；DAPI荧光染剂(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM/F12、胎牛血清(美国Gibco公司)。

实验动物：SPF级雄性BALB/c小鼠50只，8-10周龄，体质量20-28 g，购买于成都达硕生物公司，实验动物机构许可证号SCXK(川)2015-030。

1.4  方法

1.4.1  细胞培养  将冻存管中的人脐血间充质干细胞复苏后转移至细胞培养瓶中，加入含体积分数为10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM/F12培养基，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，每两三天换1次培养基，注意每天观察细胞生长情况。观察到细胞长满培养瓶的80%-90%时进行细胞传代。

1.4.2  流式细胞术检测人脐血间充质干细胞表面标记物  取生长良好的第6代人脐血间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态、贴壁及生长情况，用0.25%胰酶消化，制成细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1的细胞悬液，用流式细胞仪检测 CD105、CD29、CD90、CD34、CD45的表达。

1.4.3  CM-DiL荧光染剂标记人脐血间充质干细胞  取生长状态良好的第6代人脐血间充质干细胞，用0.25%胰酶消化，重悬，细胞计数板计数，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，加入1 mL浓度为 5 μmol/L的CM-DiL细胞标记液，37 ℃避光孵育5 min，然后4 ℃避光孵育15 min，离心2次后加入DMEM/F12完全培养基5 mL，接种至T25细胞培养瓶，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养。标记第1，7，14，21天在倒置荧光显微镜下观察荧光标记情况，用流式细胞仪检测CM-DiL标记率。

1.4.4  建立骨髓造血损伤小鼠模型  选取SPF级BALB/c小鼠50只，随机分成3组：实验组20只、对照组20只、正常组10只。用X射线对实验组和对照组BALB/c小鼠进行全身辐照，总剂量6 Gy，时间6 min，距离小鼠直线距离   100 cm，建立骨髓造血损伤模型。对照组造模后第1，5，7，14，21天进行外周血常规及骨髓涂片检测。

1.4.5  人脐血间充质干细胞移植  取第6代对数生长期的经CM-Dil标记的脐血间充质干细胞，0.25%胰酶消化离心后加入PBS重悬混匀，调整细胞终浓度为2.5×10¹⁰ L^-1。造模后2 h，实验组小鼠尾静脉注射人脐血间充质干细胞悬液0.2 mL(含细胞5×10⁶个)，对照组及正常组小鼠尾静脉注射0.2 mL生理盐水。

1.5  主要观察指标  ①各组小鼠的精神状态、饮食情况等；②移植后第1，5，7，14，21天进行外周血常规检测，了解外周血血象恢复情况；③移植后第1，5，7，14，21天进行骨髓活检了解骨髓增生情况；④取实验组小鼠移植后第1，5，7，14，21天骨髓涂片进行DAPI荧光染色，在正置荧光显微镜下观察CM-DiL及DAPI标记细胞的形态及染色情况。

1.6  统计学分析  采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

CM-DiL属于细胞膜荧光染料，与细胞膜的脂质分子结合对细胞进行染色，染色后对细胞生长影响小，细胞膜和细胞质发红色荧光，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好，能很好地长期示踪细胞，被广泛应用于干细胞移植研究中^[9]。研究表明，4-10 μmol/L范围内的CM-DiL对细胞染色效果较好^[10]。该实验使用5 μmol/L CM-DiL对第3-6代人脐血间充质干细胞进行标记，倒置荧光显微镜下观察细胞膜及细胞质发红色荧光，荧光表达强度随着时间的增加呈进行性下降。将CM-DiL标记的人脐血间充质干细胞经尾静脉输入骨髓造血损伤小鼠体内，在移植后第1，5，7，14，21天取小鼠骨髓涂片进行DAPI染色，荧光显微镜下观察可见细胞质呈红色，细胞核呈蓝色，移植后人脐血间充质干细胞稳定定植于骨髓。该研究采用物理方法建立骨髓造血损伤动物模型，此方法简单、方便、花费时间短。张曦等^[11]研究显示5-6.5 Gy的照射剂量都可达到骨髓微环境损伤，建立骨髓造血损伤小鼠模型，但在6.5 Gy剂量照射时动物出现了死亡。为确保实验中尽可能多的动物存活，该实验采用总辐照剂量为6 Gy照射6 min，能量6 MeV，距离100 cm，吸收率100 cGy/min，制备骨髓造血损伤小鼠模型。造模后第1，5，7天小鼠外周血出现三系降低，骨髓涂片显示小鼠骨髓增生减低，有核细胞明显减少，以造模后第7天最为明显，第14天小鼠的外周血及骨髓造血开始恢复，第21天时外周血及骨髓造血恢复正常。

造血干/祖细胞在骨髓造血微环境中增殖、分化、发育和成熟，而基质细胞是造血微环境的主要组成部分，通过分泌细胞因子、化学因子和细胞黏附分子调节造血细胞的发育，对造血干细胞的维持、定位、增殖、分化、发育发挥着关键作用^[1-2]。间充质干细胞是基质细胞中的重要组成部分，具有低免疫原性，能分泌多种细胞因子和细胞外基质^[2]，促进造血干细胞增殖并抑制其分化；体外培养间充质干细胞能促进造血干细胞增殖^[12]，证明间充质干细胞在骨髓造血微环境中对造血调控的重要作用^[13]。大量研究表明间充质干细胞移植可降低辐照引起的造血细胞死亡，增加骨髓细胞存活，修复造血功能，同时间充质干细胞能朝着损伤部位聚集。胡锴勋等^[14]实验证实间充质干细胞通过分泌细胞因子降低照射细胞P53蛋白表达，促使细胞周期由静息期(G₀)向合成期(G₁)及有丝分裂期(S)转变，减少细胞凋亡，从而促进血细胞增殖，加快造血重建；WALENDA等^[15]发现骨髓间充质干细胞联合干细胞因子、血小板生成素、重组人酸性成纤维细胞生长因子共同移植比单独移植骨髓间充质干细胞对造血功能修复能力强，能更快使细胞集落形成和改善造血功能。与骨髓间充质干细胞相比，人脐血间充质干细胞可合成、分泌更多的血小板生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子，促进CD34⁺细胞扩增，促进细胞集落形成、单位克隆形成^[16]。目前间充质干细胞移植促进骨髓造血恢复的机制尚未完全阐明，但目前研究表明可能有以下几点^[17-21]：①间充质干细胞参与形成造血微环境，并可分化为成纤维细胞、脂肪细胞、成骨细胞等基质细胞；实验发现来源于间充质干细胞的成骨细胞对原始造血细胞有着重要的调节作用；②间充质干细胞通过分泌多种细胞因子调控造血，如干细胞因子、巨核细胞集落刺激因子、fms样酪氨酸激酶3配体以及多种白细胞介素等；③间充质干细胞可直接与造血细胞相接触， 通过配受体调节造血细胞分化成熟；④间充质干细胞可减少照射后骨髓细胞的凋亡，加速DNA合成和有丝分裂，促进造血细胞增殖^[14]。目前众多研究小组从脐血中分离并培养出了人脐血间充质干细胞^[22-24]，人脐血间充质干细胞由纤维样细胞形成，细胞形态均一，细胞表面标志物与骨髓间充质干细胞相似^[25]。该研究对骨髓造血损伤小鼠模型输注人脐血间充质干细胞，观察外周血及骨髓造血恢复情况。与正常组比较，移植后第1，5，7天实验组和对照组小鼠外周血出现三系降低，白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板进行性下降，在第7天时下降最为明显，且对照组下降较实验组更为明显；骨髓涂片及骨髓病理切片显示小鼠骨髓增生进行性减低，有核细胞明显减少，骨髓造血功能抑制，非造血细胞比例增加，脂肪组织增多，可见大量空泡，以移植后第7天最为明显；第14天时白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板较前有所上升，骨髓有核细胞数增多，且实验组外周血上升较快，骨髓有核细胞数较多；第21天时，实验组和对照组外周血和骨髓增生情况基本恢复正常。以上结果表明实验组小鼠骨髓受损伤程度较对照组轻，且实验组小鼠骨髓恢复较对照组更快，说明人脐血间充质干细胞可减轻放疗导致的骨髓造血损伤，促进骨髓造血恢复，且人脐血间充质干细胞取材方便，感染病毒的可能性小，可以耐受免疫反应^[6]，不存在伦理争议等优势。移植后第1，5，7，14，21天小鼠骨髓涂片经DAPI染色后在荧光显微镜下观察可见经CM-DiL标记的人脐血间充质干细胞胞质呈红色，细胞核呈蓝色，说明人脐血间充质干细胞稳定定植于骨髓。

综上，该研究证实人脐血间充质干细胞可以减轻骨髓造血损伤小鼠骨髓受抑制程度，修复骨髓造血功能，并稳定定植于骨髓，为临床应用人脐血间充质干细胞促进骨髓造血修复提供动物实验理论基础。但该研究依然存在一些问题，如人脐血间充质干细胞促进造血恢复机制的深入研究，是否与体外培养一样通过分泌细胞因子等促进造血干细胞增殖，移植后骨髓微环境中细胞因子的变化等需进行进一步研究。

 
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

间充质干细胞：是一种多功能干细胞，由胚胎发育早期的中胚层发展而来，存在于人的各种组织、器官中，如骨、软骨、脂肪、外周血和肌肉等。骨髓组织中的间充质干细胞最多，但其在骨髓细胞中的比例仍很低，只有0.01%-1.00%，且年龄越大其含量越少，骨髓中的间充质干细胞分化能力也呈下降趋势。与骨髓相比，脐血中所含的间充质干细胞更加原始，因而有更强的增殖、分化能力。相较于骨髓间充质干细胞而言，人脐血间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、无伦理方面的限制，使得人脐血间充质干细胞成为再生医学中的另一重要来源。

骨髓造血损伤动物模型：建立骨髓造血损伤动物模型的方法有很多，主要分为物理方法、化学方法及物理化学方法等。物理方法包括各种射线，如X射线等，化学方法主要指以环磷酰胺为代表的烷化剂类化疗药物，而物理化学方法也叫混合性方法，联合应用放射线和化疗药物建立动物模型。

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至今，对脐血的研究仅仅只有短短的20年左右，人脐血间充质干细胞的研究更短，但脐血中干细胞被广泛研究应用。研究发现移植人脐血间充质干细胞对大鼠缺血性脑卒中可起保护作用，减轻细胞凋亡，防止DNA损伤；在体外实验中，人脐血间充质干细胞可分化为多巴胺能神经元细胞；人脐血间充质干细胞与海马神经元共培养，可减缓神经细胞凋亡，还可通过旁分泌功能对海马神经元起保护作用，同时可分泌血小板反应蛋白逆转阿尔茨海默病模型中神经元的突触功能障碍。人脐血间充质干细胞与成纤维细胞有超强的伤口愈合能力，与成纤维细胞比较，人脐血间充质干细胞表现出更高的细胞增殖、胶原合成及糖胺聚糖水平，人脐血间充质干细胞促进糖尿病创面愈合比成纤维细胞更强；人脐血间充质干细胞移植后通过血小板反应蛋白2刺激局部内源性软骨祖细胞分化，最终促进软骨修复等。目前对人脐血间充质干细胞研究大多还处于基础研究和动物实验阶段，其发展成熟还需要很长一段时间的积累，才能大量运用于临床。

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