骨髓间充质干细胞移植治疗肺气肿：静脉和气管途径谁更有优势？

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.014

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (14): 2211-2215.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.014

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骨髓间充质干细胞移植治疗肺气肿：静脉和气管途径谁更有优势？

赵晓建¹，卢彩平²，褚伟伟¹，张亚肖¹，张冰¹，甄强¹，谭国梁¹，王仁锋¹，刘家宝¹，吴琳³

¹Department of Thoracic Surgery, ²Department of Endocrinology, ³Department of Cardiology, First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

修回日期:2015-03-09 出版日期:2015-04-02 发布日期:2015-04-02
通讯作者: 卢彩平，硕士，主治医师，石家庄市第一医院内分泌科，河北省石家庄市 050000
作者简介:赵晓建，男，1981年生，汉族，2007年山西医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事普胸疾病及胸腔镜手术研究。
基金资助:
the Scientific Support Plan of Shijiazhuang City, No. 121461793

Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for treatment of emphysema: intravenous versus intratracheal approach

石家庄市第一医院，¹胸外科，²内分泌科，³心内科，河北省石家庄市 050000

Revised:2015-03-09 Online:2015-04-02 Published:2015-04-02
Contact: Lu Cai-ping, Master, Attending physician, Department of Endocrinology, First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
About author:Zhao Xiao-jian, Master, Attending physician, Department of Thoracic Surgery, First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞移植可以抑制肺气肿炎症反应及细胞凋亡，治疗肺功能严重损害已经得到实验证实。

目的：探讨不同途径移植骨髓间充质干细胞对实验性肺气肿炎症反应及细胞凋亡的抑制作用。

方法：Wistar雌性大鼠随机分对照组、静脉组及气管组，均用烟熏加气管内滴注猪胰弹性蛋白酶法建立肺气肿模型。静脉组和气管组经尾静脉及气管途径移植雄性大鼠骨髓间充质干细胞，对照组尾静脉和气管内注射PBS，移植后14 d观察大鼠肺组织病理学变化，检测肺泡壁细胞凋亡指数，支气管肺泡灌洗液肿瘤坏死因子α水平。

结果与结论：与对照组相比，静脉组及气管组均能减轻肺气肿病理改变，降低肿瘤坏死因子α水平及凋亡指数，差异有显著性意义(P < 0.01)；但是静脉组与气管组比较，肺气肿病理改变、肿瘤坏死因子α水平及凋亡指数差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明两种途径移植骨髓间充质干细胞对肺气肿均有明显的治疗作用，从方便易行的角度考虑经静脉移植骨髓间充质干细胞治疗肺气肿较为有优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Pulmonary Emphysema, Apoptosis

赵晓建，卢彩平，褚伟伟，张亚肖，张冰，甄强，谭国梁，王仁锋，刘家宝，吴琳. 骨髓间充质干细胞移植治疗肺气肿：静脉和气管途径谁更有优势？[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(14): 2211-2215.

Zhao Xiao-jian, Lu Cai-ping, Chu Wei-wei, Zhang Ya-xiao, Zhang Bing, Zhen Qiang, Tan Guo-liang, Wang Ren-feng, Liu Jia-bao, Wu Lin. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for treatment of emphysema: intravenous versus intratracheal approach[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(14): 2211-2215.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 实验中纳入Wistar大鼠总数25只，其中1只用于提取骨髓间充质干细胞，其余24只大鼠造模成功率100%，均进入结果分析。
2.2 骨髓间充质干细胞形态及鉴定 细胞悬液中骨髓间充质干细胞呈圆形，悬浮状态。24 h后出现贴壁细胞，72 h后贴壁细胞多呈三角形、多角形或梭形，胞体饱满，胞浆半透明，细胞核呈圆形，核仁明显，常向外伸出2-4个长短不同突起。培养7 d时胞体增大，细胞形状逐渐以梭形为主，相互之间连接更加紧密，见图1。传代后细胞生长速度加快，密度增大，形态较均一，为长梭形，呈漩涡状或平行生长，光性较强。培养10-14 d时细胞达80%融合，细胞呈平行排列生长或漩涡状生长。流式细胞仪检测细胞表面标志表达阳性率，CD44为84.69%，CD90为90.54%，CD71为70.32%，CD45为2.87%^[12]。

2.3 大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数和细胞分类计数 与对照组比较，静脉组及气管组大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数，中性粒细胞、淋巴细胞百分比明显下降(P < 0.01)；静脉组与气管组比较，支气管肺泡灌洗液中细胞总数及分类计数差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α水平 与对照组相比，静脉组及气管组大鼠支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α水平降低(P < 0.01)；静脉组与气管组相比差异无显著性意义(P > 0. 05)，见表2。

2.5 大鼠肺组织病理组织形态学观察及测定结果 各组均呈现呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡等不同程度扩大，肺泡大小不一，肺泡数目明显减少，肺泡间隔变薄，部分间隔断裂致肺泡融合等肺气肿样改变，静脉组及气管组相对于对照组减轻。静脉组和气管组肺组织平均内衬间隔、单位面积平均肺泡数、平均肺泡面积相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.6 肺泡壁细胞凋亡情况 TUNEL结果显示凋亡细胞的核染色质浓集、呈深棕褐色。对照组凋亡的肺泡壁细胞数量增多，凋亡指数值显著高于静脉组及气管组(P < 0.01)，而静脉组与气管组肺泡壁细胞凋亡指数值差异无显著性意义(P > 0. 05)，见表4。

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引言

慢性阻塞性肺疾病是一种破坏性的肺部疾病，是以不完全可逆的气流受限为特征的疾病，气流受限通常呈进行性发展，与肺对有害颗粒或气体的异常炎症反应有关^[13-14]。慢性阻塞性肺疾病虽然是气道的疾病，但对全身的系统影响也不容忽视，治疗方法及疗效有限^[15-16]。而肺气肿是慢性阻塞性肺疾病主要的病理改变之一，具有极高的病死率和致残率，且有逐年上升趋势，已成为当今世界第4位的主要死亡原因^[17-18]。目前大量的动物实验证实骨髓间充质干细胞能有效的控制炎症反应并修复损害的肺组织，从而逆转肺气肿的病理进程^[19-20]，但是具体到给药途径及剂量上尚没有一致看法及标准可循^[21]。本实验旨在找出哪种给药途径能更有效地逆转肺气肿进展，修复肺部组织结构，重建肺功能。

骨髓间充质干细胞主要存在机体骨髓腔中的一种干细胞，在一定诱导条件下可分化为多种胚层细胞，更重要的是骨髓间充质干细胞具有较强的免疫调节功能，异体移植时可避免免疫排斥反应，骨髓间充质干细胞还具有独特的“归巢”、抗炎作用，能抑制和减轻症反应，修复受损的肺组织^[22-23]。本研究中骨髓间充质干细胞通过静脉及气管给药均能有效修复肺气肿组织结构，逆转病理学进程，骨髓间充质干细胞修复肺组织可能机制是^[24]：①分化形成正常肺组织Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞及血管内皮细胞，重建肺泡组织结构。②骨髓间充质干细胞分泌多种细胞因子和生长因子，抑制炎症反应，促进血管内皮细胞再生，增加肺组织毛细血管床，促进肺泡再生。③骨髓间充质干细胞与肺组织局部细胞相互作用，或者抑制机体内T淋巴细胞的活化，减轻肺组织局部炎症反应，提供肺组织修复有利的环境。本实验结果显示两种给药途径在疗效上差异无显著性意义。气管内给药后骨髓间充质干细胞在肺组织局部微环境下可直接开始修复作用，另外因为肺脏的特殊结构，经静脉注射骨髓间充质干细胞进行移植时，许多骨髓间充质干细胞会被肺组织毛细血管网拦截而滞留在肺组织中，被成为肺脏的首过效应^[25-26]。一旦骨髓间充质干细胞在肺组织毛细血管停留，则会在局部微环境的诱导和周围组织细胞相互作用下，逐步迁移到肺间质、肺泡壁、肺血管壁和气道，分化成相应的细胞来发挥作用^[27]。目前外源性骨髓间充质干细胞参与肺损伤的修复机制，并没有完全明确，但已经有很多的实验试图研究并证明其可能的修复机制^[28-29]。

本研究观察到两种途径移植骨髓间充质干细胞后肺泡壁细胞的凋亡受到抑制，炎症反应减轻，并且参与了肺泡细胞的修复与再生，最终减轻了肺气肿的病理改变，延缓了肺气肿的进程。两种移植途径并未显示出治疗效果的差异，可能需要进一步加大动物实验的样本数。就目前研究结果，从方便易行的角度考虑经静脉移植骨髓间充质干细胞治疗肺气肿较为有优势，骨髓间充质干细胞在肺组织的示踪分化情况有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年12月至2014年8月在石家庄市第一人民医院实验室完成。

材料：

实验动物：①8周龄雌性Wistar大鼠 24 只，体质量(180±20) g，购于河北医科大学实验动物中心，随机分为对照组、静脉组、气管组，每组8只。②6周龄雄性Wistar大鼠1只用于提取骨髓间充质干细胞，体质量约150 g，购于河北医科大学实验动物中心。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的培养及扩增：取6周龄雄性Wistar大鼠1只，无菌操作下获取双侧股骨及胫骨。用5 mL L-DMEM培养液(含1×10⁴ U肝素)冲洗骨髓腔，反复吹打骨髓，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞，加于60%的Percoll工作液之上，1 500 r/min离心30 min，吸出白细胞层，PBS稀释，1 500 r/min离心10 min，弃上清，用含体积分数为10%的无支原体胎牛血清L-DMEM培养液重悬细胞，分瓶，在37 ℃、体积分数5%的CO₂恒温培养箱内培养，48 h换液除去未贴壁的细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，每3 d换液1次。融合80%-90%时按1︰2传代培养，流式细胞仪对第3代细胞表面蛋白CD44，CD45，CD90，CD71进行鉴定^[5-7]。

肺气肿模型的建立：各组大鼠采用烟熏加气管内滴注猪胰弹性蛋白酶法建立肺气肿模型。大鼠置于实验性被动吸烟装置内，每次10支香烟，烟熏40 min，1次/d，每周6 d，5周后10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠置于实验台上固定，头后仰70°，LED灯照射颈部，夹出大鼠舌头，塑料套管插入气管，注入猪胰弹性蛋白酶，每100 g体质量给予50 U猪胰弹性蛋白酶加生理盐水至0.5 mL，然后注入空气，确保药液全部进入肺内，适度摇动改变体位，尽量使药液肺内分布均匀，大鼠清醒放回鼠笼，继续烟熏至3个月，模型制作成功^[8-10]。

骨髓间充质干细胞移植：10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，对照组尾静脉注射PBS 200 μL，气管内注射PBS 200 μL；静脉组尾静脉注射第3代骨髓间充质干细胞悬液200 μL(细胞总数为2×10⁶)；气管组经气管内注射第3代骨髓间充质干细胞悬液200 μL(细胞总数为2×10⁶)，注入空气，注射后适度摇动并改变体位，尽量使药液在肺内分布均匀。移植后第14天处死取材^{[7, 11]}。以上实验均获得动物伦理委员会批准，严格的按照政府和国际准则执行。

支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集及相关检测：大鼠断颈处死，迅速打开胸腔，分离肺脏。将3 mL PBS通过气管注入肺内并保持压力在1.96 kPa左右，注射器反复回抽3次，回收灌洗液，回收率大于80%为合格，使用200目筛网过滤灌洗液并收集于离心管，以血细胞计数板计数细胞总数，然后支气管肺泡灌洗液离心(2 000 r/min，5 min)，分装上清液。

抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α水平：按照试剂盒说明书进行操作，根据标准曲线计算浓度。

肺组织病理组织学检查：结扎气管，气管内注入体积分数为4%甲醛溶液至肺膨胀保持压力维持在1.96 kPa，浸泡于体积分数为4%甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，常规病理组织学检查，每只大鼠随机观测5张肺组织切片，避开大、中血管及支气管区域，每张切片随机检测10个视野(区域)。显微镜观察，图文分析系统计数及计算肺组织平均内衬间隔、单位面积平均肺泡数及平均肺泡面积。

肺组织平均内衬间隔(MLI)：每个视野中心划“十”字交叉线，测出该十字线总长度(L)，计数经此十字线的肺泡间隔数(Ns)。MLI=L/Ns，其数值反映每个视野内肺泡平均直径大小。

单位面积平均肺泡数(MAN)：每个视野内计数总肺泡数(Na)，测出该视野的面积(M)，MAN=Na/M，其数值反映每个视野单位面积内肺泡密度。

平均肺泡面积(MAA)：每个视野内计数总肺泡数(Na)，测量出该视野的面积(M)，再测出苏木精-伊红染色阳性区域(肺实质)的面积(PA)，MAA=(M-PA)/Na，其数值反映每个视野内平均肺泡面积。

肺组织细胞凋亡的检测：TUNEL法原位标记肺组织石蜡切片凋亡细胞，方法同剂盒说明(Roche, USA)。石蜡切片常规脱蜡，20 mg/L蛋白酶K消化，PBS清洗，滴加50 μL TUNEL反应混合液(TdT和酶标记缓冲液以1︰9比例混匀)，37 ℃环境湿盒中孵育1 h，再次PBS清洗，滴加50 μL转化剂POD，接着DAB显色，显微镜观测。以不加TdT为阴性对照，染成棕黄色细胞核为阳性细胞。每只大鼠随机观测5张切片，避开大、中血管及支气管区域。每张切片随机观测10个高倍视野(×400)，图文分析系统计数阳性细胞数目(即凋亡细胞数)及总细胞数目。

凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

主要观察指标：①支气管肺泡灌洗液中白细胞数及肿瘤坏死因子α水平。②肺组织病理学指标。③肺组织细胞凋亡指数。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计软件分析数据，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验，显著性检验水准P < 0.05。

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