K562细胞株侧群细胞中部分白细胞分化抗原的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.021

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (49): 8596-8601.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.021

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

K562细胞株侧群细胞中部分白细胞分化抗原的表达

范瑞华¹，郭殿选²，张铁成¹，岳顺¹，黄明德¹，姚榕¹

1南京医科大学附属淮安第一医院肿瘤内科，江苏省淮安市 223300
2淮安市第二人民医院老年病科，江苏省淮安市 223002

修回日期:2013-09-25 出版日期:2013-12-03 发布日期:2013-12-03
通讯作者: 郭殿选，淮安市第二人民医院老年病科，江苏省淮安市223002 guodianxuan@163.com
作者简介:范瑞华★，女，1977年生，山西省左权县人，汉族，2009年昆明医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事血液肿瘤的诊断和治疗研究。 fanruihuabaobao@163.com

Some leukocyte differentiation antigens express in side population cells in leukemia K562 cell line

Fan Rui-hua¹, Guo Dian-xuan², Zhang Tie-cheng¹, Yue Shun¹, Huang Ming-de¹, Yao Rong¹

1Department of Oncology, Huaian First People’s Hospital, Nanjing Medical University, Huaian 233300, Jiangsu Province, China
2Department of Geratology, the Second People’s Hospital of Huaian, Huaian 223002, Jiangsu Province, China

Revised:2013-09-25 Online:2013-12-03 Published:2013-12-03
Contact: Guo Dian-xuan, Department of Geratology, the Second People’s Hospital of Huaian, Huaian 223002, Jiangsu Province, China guodianxuan@163.com
About author:Fan Rui-hua★, Master, Attending physician, Department of Oncology, Huaian First People’s Hospital, Nanjing Medical University, Huaian 233300, Jiangsu Province, China fanruihuabaobao@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：白血病侧群细胞表型的研究对于理解肿瘤细胞的异质性和起源、分子标记和靶向治疗等都有积极意义。
目的：鉴定人慢性粒细胞白血病细胞株K562中是否存在侧群细胞，并观察侧群细胞亚群与非侧群细胞亚群中部分白细胞分化抗原的表达差异。
方法：采用流式细胞术检测K562细胞株中是否存在侧群细胞；并进一步分析K562侧群细胞和非侧群细胞两亚群间CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38+、HLA-DR+细胞的表达情况。
结果与结论：经Hoechst33342染色，流式细胞仪分析结果显示在K562中存在侧群细胞，这部分细胞比例少，为(2.7±0.5)%；统计学分析侧群细胞和非侧群细胞亚群中CD34⁺、CD34⁺CD38^-细胞表达率差异有显著性意义，而CD34⁺CD38⁺细胞表达率和HLA-DR+细胞表达率差异均无显著性意义；侧群细胞和非侧群细胞相比在分化抗原表达上有异质性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 白血病干细胞, 侧群细胞, 非侧群细胞, 流式细胞术, K562细胞株

Abstract:

BACKGROUND: To study the phenotypes of side population cells in leukemia is important for understanding the heterogeneity and origin of tumor cells, molecular markers and targeted therapy.
OBJECTIVE: To identify whether the human chronic myeloid leukemia cell line-K562 contains side population cells or not, and to further observe the differences in expressions of leukocyte differentiation antigens from side population cell subset and non-side population cells subset.
METHODS: Flow cytometry was used to detect whether there were side population cells in the K562 cell lines. Then, the expression of CD34⁺, CD34⁺CD38^-, CD34⁺CD38⁺, HLA-DR⁺ cells in the side population subsets and non-side population subsets.
RESULTS AND CONCLUSION: Flow cytometry results showed that the K562 cell line contained side population cells, and the proportion of side population cells was much lower. The side population cells accounted for (2.7±0.5)% of viable cells in K562. The expressions of CD34⁺ cells and CD34⁺CD38^- cells in the side population subset were significantly higher than those in the non-side population subsets. The expressions of CD34⁺CD38⁺ cells and HLA-DR⁺ cells in the side population subset and non-side population subset did not have a significant difference. Heterogeneity was found in the differentiation antigen expression between the side population subset and non-side population subset.

全文链接：

Key words: stem cells, leukemia, myelogenous, chronic, BCR-ABL positive, K562 cells, flow cytometry, antigens, differentiation

中图分类号:

R394.2

范瑞华，郭殿选，张铁成，岳顺，黄明德，姚榕 . K562细胞株侧群细胞中部分白细胞分化抗原的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8596-8601.

Fan Rui-hua, Guo Dian-xuan, Zhang Tie-cheng, Yue Shun, Huang Ming-de, Yao Rong . Some leukocyte differentiation antigens express in side population cells in leukemia K562 cell line[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8596-8601.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：细胞学体外对比观察。

时间及地点：于2008年8月至2010年8月在淮安市第一人民医院中心实验室完成。

材料：

细胞株：人慢性粒细胞白血病细胞株K562购自中科院上海细胞库。

检测K562细胞株侧群细胞中部分白细胞分化抗原表达所需试剂：

检测K562细胞株侧群细胞中部分白细胞分化抗原表达所需仪器：

实验方法：

主要溶液的配置：

Verapamil溶液(1 mol/mL)：Verapamil干粉2.5 mg+蒸馏水5 mL，轻吹打，充分溶解，现配现用。

Hoechst33342溶液(1 g/L)：Hoechst33342干粉 2.5 mg+蒸馏水2.5 mL，轻吹打，充分溶解，现配现用。

K562侧群细胞预制和分选：将K562细胞培养于含体积分数10%胎牛血清，0.2%谷氨酰胺的RPMI1640培养基，常规条件孵育；细胞预制和分选参照文后文献[4]的方法进行。

细胞预制：选择对数生长期K562细胞，计数，调节细胞悬液浓度至10⁹ L^-¹，准备2只无菌干燥标准流式上样管(5 mL规格，聚丙烯材料)，两管中分别加入上述细胞悬液1 mL，再加入Hoechst33342溶液至终质量浓度为5 mg/L，在对照管同时加入Verapamil溶液调节至终质量浓度50 mg/L，吹打均匀后，37 ℃恒温水浴箱作用 120 min，期间每15 min柔和晃动上样管1次，混匀溶液使细胞充分染色，染色完成后 4 ℃ 1 000 r/min离心 10 min，弃上清，加入4 ℃ PBS吹洗1次，4 ℃1 000 r/min离心10 min，小心抽弃上清，重悬于4 ℃含体积分数为2%胎牛血清的PBS中，置于4 ℃环境中待上机检测侧群细胞比例。

细胞分选：确定侧群细胞的百分率后，根据实验目的，扩大K562细胞的培养，仍取对数生长期的K562细胞悬液，要求细胞浓度为1×10⁹ L^-¹的单细胞悬液共约 40 mL，分装到无菌干燥标准流式上样管(毎管分装1 mL细胞悬液)，按上述步骤染色过程细致准备，ALTRA流式细胞仪更换鞘液为乙醇进行清洗后换为双蒸水；分别上Hoechst33342管和Hoechst33342+ verapamil管进行检测，设置左右收集的细胞群；换上偏振板，调整参数，使偏振板在最佳位置的液滴上，打开左、右分选，使左右两条液流分开，开始分选；并用玻片在左边收集，观察里面是否含有微球；在电脑中选择SP方案，接受上面的分选参数，全程需要振荡；收集结束后在无菌条件下取下收集管，1 000 r/min离心10 min后弃上清，加入含体积分数为10%小牛血清的1640培养液吹打均匀。这样就将K562分为两个细胞亚群，分别称为K562侧群细胞及K562非侧群细胞。

流式细胞仪检测分选后两亚群细胞部分白细胞分化抗原的表达：白细胞分化抗原检测CD34-PE，CD38-FITC，HLA-DR-FITC分子表达，抗体加样，室温孵育20 min，10 g/L多聚甲醛固定30 min，上流式细胞仪EPICS-XL检测，激发光波长为488 nm，标记PE、FITC荧光素的检测波长分别为576 nm、520 nm。以不加任何抗体作为荧光表达阴性对照，记录各样本阳性细胞表达率，统计学分析其各亚群细胞部分白细胞分化抗原CD34⁺、CD34⁺CD38^-、CD34⁺CD38⁺、HLA-DR⁺细胞表达差异性。

主要观察指标：K562细胞株侧群细胞的比例，侧群细胞与非侧群细胞两亚群CD34⁺、CD34⁺CD38^-、CD34⁺CD38⁺、HLA-DR⁺细胞表达的差异。

统计学分析：正态分布计量资料以x(_)±s表示，两组间比较采用成组t 检验，采用SPSS 13.0统计软件进行数据的统计处理，以P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

近年来在成体多种组织、胚胎中都发现了侧群细胞，研究发现它们具有自我更新和多向分化潜能，同源性高，在体内能够分化产生不同组织类型的细胞，所以有学者认为用侧群细胞分选干细胞的方法更能反映干细胞的功能学特点，可能是一种很有前途的生物学方法，尤其是在缺乏肿瘤干细胞表面标记的实体肿瘤研究中，应用这种方法分选肿瘤干细胞的比较多，例如在胶质瘤、鼻咽癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤、肝癌、胆囊癌、卵巢癌以及皮肤癌等肿瘤的研究中^[6-27]，多数研究中都认为侧群细胞具有干细胞的特征，人们推测具有侧群细胞表型的肿瘤细胞可能是干细胞样肿瘤细胞或者就是肿瘤干细胞，应用侧群细胞分选的方法来分离和鉴定肿瘤干细胞也越来越多。

同时如何有效分离纯化肿瘤干细胞是目前研究肿瘤干细胞的一个主要内容和难点，近年来血液肿瘤研究中也有利用侧群细胞分选方法来分离和纯化血液肿瘤干细胞，例如在多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和NCI-H929中侧群细胞比例在0.8%-1.9%^[28]；在成人T细胞白血病/淋巴瘤(Adult T-cell leukemia/lymphoma ATLL)的12株细胞系中，发现并不是所有的ATLL细胞株都能检测到侧群细胞，其中有4个细胞株检测到侧群细胞存在，分别是HUT-102(0.47%)、ATL-2(5.5%)、ATL-16T(0.93%)和ATL-43Tb(3.0%)，剩余的8个细胞株SezM3、ATL-35T、Sez627C、ED-40515、MT-1、SLB-1、MT-2以及MT-4中就没有检测到侧群细胞存在^[29]。Patrawala等^[30]在急性白血病细胞株HL-60的检测中没有发现侧群细胞，但是在HL-60中加了低浓度的阿霉素后可以检测到侧群细胞，并且随着阿霉素浓度的增加，HL-60细胞中侧群细胞的比例也随着增加；在急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4中侧群细胞比例<1%^[31]；可以看到在血液系统肿瘤的研究中，有越来越多研究者利用这种方法来获取干细胞，但并不是所有的细胞株中都可以检测到侧群细胞。

结合前述的干细胞和侧群细胞理论，应用流式细胞仪分析的方法，检测血液肿瘤细胞株中是否存在侧群细胞，从而为血液肿瘤干细胞的分离和鉴定提供一些实验依据。经Hoechst33342染色，流式细胞仪分析结果显示在3个血液肿瘤细胞株NB4、Raji和K562/ADM细胞株中均存在侧群细胞，这群细胞比例均少，分别为0.8%、2.7%和1.3%，能被Verapamil完全抑制^[32]。K562细胞株是从1例慢性粒细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia CML)急变危象建系，常用来作为白血病诱导分化实验的工具细胞系，可能是由于白血病细胞异质性的结果，K562细胞在分化抗原表达上近乎是一个“裸细胞”，CD34、CD38和HLA-DR是能反映细胞阶段性特征的分化抗原，表达均处于极低水平^[33]。CD34是骨髓造血干细胞最重要的标志，广泛表达于骨髓造血干细胞和定向分化的祖细胞，随着细胞分化成熟逐渐失去表达，伴随干细胞分化为早期祖细胞CD38和HLA-DR等分化抗原也开始表达。所以作者对K562侧群细胞进行分化抗原的研究为理解白血病干细胞的起源、白血病细胞异质性有重要的意义。

关于慢性粒细胞性白血病干细胞起源目前主要有两种说法：①起源于多能造血干细胞，慢性粒细胞性白血病干细胞起源的证据来自于在自身免疫缺陷老鼠体内异基因移植的模型的发展，一系列的研究认为慢性粒细胞性白血病干细胞的表型CD34⁺CD38^-和造血干细胞的表型是一致的^[34]。造血干细胞在本质上具备利于细胞恶性生长的特点：既有自我更新和无限增生能力，又相对生存时间较长，这对细胞转化为恶性经过多个突变是需要的。②起源于造血祖细胞，人类慢性粒细胞性白血病分为两个阶段：慢性阶段(chronic phase，CP)和爆发危机期(blast crisis，BC)，而在爆发危机期，额外的突变发生于造血干细胞或粒性白细胞/巨噬细胞的前体细胞(grarmlocvte macrophage precursors，GMP)中，造成控制自我更新通路的激活，不论这个突变发生在造血干细胞还是巨噬细胞的前体细胞中，均致使巨噬细胞的前体细胞获得自我更新能力。巨噬细胞的前体细胞将进行快速的扩增，导致血液中大量巨噬细胞的前体细胞及巨噬细胞的前体细胞产生的不成熟粒细胞的囤积，此时的肿瘤干细胞就可能是巨噬细胞的前体细胞。Jamieson等^[35]的研究中发现，伴随着慢性粒细胞性白血病的发生，巨噬细胞的前体细胞大量增殖，而造血干细胞的数量却没变化，并且这种前体细胞核内β连环蛋白水平明显增高，胞内融合基因BCR-ABL扩增，其中β连环蛋白是Wnt信号通路的下游激活因子，是干细胞保持其自我更新能力的标志分子，已在前体细胞核内水平增高说明此细胞获得自我更新的能力，这种变异的前提细胞可能充当白血病干细胞的角色。最近有研究支持在慢性粒细胞性白血病患者的巨噬细胞的前体细胞中β连环蛋白确实是增加的^[36]。正是在这些起始细胞在增生和凋亡失去平衡时就导致细胞的恶变，白血病干细胞产生。

结合上述慢性粒细胞性白血病起源的研究和FACS方法可以对侧群细胞进行分离富集，在此基础上，作者利用一些特异性表面抗原标记初步对侧群细胞的免疫表型进行了研究，主要检测在两亚群细胞中这些反映早期干祖细胞阶段特征的免疫标记，发现CD34⁺、CD34⁺CD38^-、HLA-DR⁺细胞在K562侧群细胞亚群和非侧群细胞亚群中都为低表达，这个结果和研究人员检测野生状态的K562细胞株分化抗原的表达结果相比，可以看到其和作者的非侧群细胞亚群检测结果是一致的，作者分析在实验中所用的K562细胞株虽然经过长期的体外培养过程，但其生物学没有改变；作者发现，在K562侧群细胞亚群中CD34⁺、CD34⁺CD38^-细胞表达均要略高于K562非侧群细胞亚群，早期干祖细胞标志越多说明细胞分化程度越低，同时也说明K562细胞株侧群细胞亚群在这些部分表面抗原标记与K562非侧群细胞亚群相比存在异质性，而在急性髓细胞性白血病研究中^[37]，也发现急性髓细胞性白血病患者侧群细胞在免疫标记例如CD34、CD38和其他谱系标记上确实是存在有异质性的，这为研究K562细胞株侧群细胞亚群中富集了更多的白血病干细胞提供了进一步的依据。

当然目前也有关于慢性粒细胞白血病干细胞起源的其他观点，如Fang等^[38]研究认为所分离得到的BCR/ABL基因阳性、Flk-1⁺/CD34^-细胞具有血液血管干细胞的特性，是慢性粒细胞白血病发生发展的始动细胞。还有认为慢性粒细胞白血病干细胞起源于血液血管干细胞，Gunsilius等^[39]认为慢性粒细胞白血病干细胞源于慢性粒细胞白血病患者骨髓中的血液血管干细胞群体，表达BCR/ABL融合基因。这些拓宽了研究者的视线，应该进行更多的对侧群细胞亚群和非侧群细胞亚群间其他免疫表型的探讨，寻找其他特异的标记，而不是仅仅局限在这些部分的白细胞分化抗原。同时随着流式细胞技术这个强大平台的发展，对慢性粒细胞白血病干细胞表型的研究对于理解肿瘤细胞的异质性和起源，分子标记和靶向治疗等都有积极意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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Some leukocyte differentiation antigens express in side population cells in leukemia K562 cell line

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