外源性硫化氢预处理骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.011

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (49): 8532-8538.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.011

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

外源性硫化氢预处理骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死

解杨婧¹，王爱玲¹，郭增¹，李从圣²，王春苗¹，郝玉瑜¹

1安徽医科大学第一附属医院心血管内科，安徽省合肥市 230032
2合肥市第一人民医院急诊科，安徽省合肥市 230061

修回日期:2013-09-11 出版日期:2013-12-03 发布日期:2013-12-03
通讯作者: 王爱玲，主任医师，教授，博士生导师，安徽医科大学第一附属医院心血管内科，安徽省合肥市 230032 wal@ah.edu.cn
作者简介:解杨婧★，女，1987年生，安徽省合肥市人，汉族，安徽医科大学第一附属医院心血管内科在读硕士，主要从事干细胞与心血管疾病研究。 josiaxie@163.com
基金资助:
安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2008A156)*

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells preconditioned with hydrogen sulfide in the treatment of rat myocardial infarction

Xie Yang-jing¹, Wang Ai-ling¹, Guo Zeng¹, Li Cong-sheng², Wang Chun-miao¹, Hao Yu-yu¹

1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China
2Department of Emergency, First People’s Hospital of Hefei City, Hefei 230061, Anhui Province, China

Revised:2013-09-11 Online:2013-12-03 Published:2013-12-03
Contact: Wang Ai-ling, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China wal@ah.edu.cn
About author:Xie Yang-jing★, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China josiaxie@163.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Anhui Educational Bureau, No. KJ2008A156*

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞移植可促进心肌修复，治疗心肌梗死，但移植后细胞存活率低等原因制约了其应用与发展。
目的：探讨硫化氢预处理对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死效果的影响。
方法：从(100±20) g SD大鼠中分离培养骨髓间充质干细胞，第4代时按实验分组处理，移植前2 h给予DAPI标记。将50只体质量(200±20) g雄性SD大鼠分为心肌梗死组和假手术组，心肌梗死组结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型，假手术组只穿线不结扎，每组10只。模型建立24 h后，分组在梗死心肌周围选择4个点，分别注射生理盐水、骨髓间充质干细胞、硫化氢预处理骨髓间充质干细胞及硫化氢。细胞移植4周后用超声心动图检测心功能指标，Masson染色测定梗死交界区胶原。
结果与结论：生理盐水组大鼠心肌纤维化严重，梗死区域无心肌组织再生；外源性硫化氢处理后的骨髓间充质干细胞移植组比单用硫化氢或者骨髓间充质干细胞组心肌纤维化程度轻，胶原组织中可见较多心肌细胞再生。硫化氢预处理骨髓间充质干细胞组左室射血分数、左室短轴缩短率显著高于硫化氢组及骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。提示硫化氢预处理骨髓间充质干细胞可提高移植后的细胞存活率，改善梗死后心功能，其作用优于单用硫化氢或者骨髓间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 骨髓间充质干细胞, 心肌梗死, 硫化氢, 预处理, 超声心动图, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation can promote cardiac repair after myocardial infarction, but it has been limited by the low cell survival rate.
OBJECTIVE: To study the effect of hydrogen sulfide (H₂S) on the BMSCs transplantation for treatment of myocardial infarction.
METHODS: BMSCs were separated and cultivated form Sprague-Dawley rats weighing (100±20) g. The 4th generation cells were used for later experiment, and marked by DAPI at 2 hours before use. Fifty male Sprague-Dawley rats, weighing (200±20) g had been divided into five groups: Sham group (n=10) and four transplantation groups: BMSCs (n=10), H₂S-BMSCs (n=10), H₂S (n=10), normal saline (n=10). The myocardial infarction model of four groups was established except of sham group (only thread without ligation). The cardiac function was measured by echocardiogram at 4 weeks after cell transplantation. The collagen in the infarction area was tested by Masson staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Severe myocardial fibrosis was found in the normal saline group, with no myocardial regeneration in the infarct area. H₂S-BMSCs group had less collagen and more cardiac muscle tissue than BMSCs or H₂S groups. Left ventricular ejection fraction and left ventricular fractional shortening of the H₂S-BMSCs group were significantly higher than those of the BMSCs or H₂S groups (P < 0.05). The cells survival rate and cardiac function of myocardial infarction rats can be promoted by H₂S-preconditioned BMSCs transplantation, which is superior to BMSCs or H₂S alone.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, stem cell transplantation, myocardial ischemia, echocardiography, stress

中图分类号:

R394.2

解杨婧，王爱玲，郭增，李从圣，王春苗，郝玉瑜. 外源性硫化氢预处理骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8532-8538.

Xie Yang-jing, Wang Ai-ling, Guo Zeng, Li Cong-sheng, Wang Chun-miao, Hao Yu-yu. Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells preconditioned with hydrogen sulfide in the treatment of rat myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8532-8538.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验大鼠共50只，假手术组10只，存活9只；心肌梗死组40只，存活34只，死亡原因可能与冠状动脉结扎位置较高，梗死范围较大，从而导致大鼠心功能衰竭有关。

最终进入结果分析，假手术组9只，骨髓间充质干细胞组9只，硫化氢预处理骨髓间充质干细胞组9只，硫化氢组8只，生理盐水组8只。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及移植后标记 见图1-3。

原代骨髓间充质干细胞分离后24 h内即可有贴壁细胞，72 h换液后可见少量呈簇状生长的细胞团，见图1。后每3 d换液，可见细胞逐渐增多，7 d左右即可铺满70%-80%，此时细胞排列紧密，抱团生长，呈长梭形。按1∶2传代后，细胞均匀分布于瓶底，并铺展成多边形，传至第4代用于实验，见图2。细胞移植前2 h给予DAPI标记，见图3。

2.3 大鼠心肌梗死模型的鉴定 大鼠麻醉固定后，立即连接心电图，3个导联分别接于大鼠双前肢和左后肢。结扎前，心电图显示大鼠心率为160-200次/min，可见P波和QRS波，为心房心室起搏图形。结扎左前降支后，心电图可见ST段抬高，心率减慢，提示心肌梗死，造模成功。

2.4 Masson染色检测各组大鼠心肌梗死交界区胶原见图4。

Masson染色后的心肌细胞呈红色，核深染，胶原组织呈蓝色。

假手术组心肌组织排列整齐，间质纤维化少见。心肌梗死动物中，生理盐水组心肌纤维化严重，梗死区域间质可见蓝色胶原组织，无心肌组织再生；硫化氢组、骨髓间充质干细胞组、硫化氢预处理骨髓间充质干细胞组均有不同程度的梗死后纤维化，胶原组织中少有心肌细胞再生。

外源性硫化氢处理后的骨髓间充质干细胞移植比单用硫化氢或者骨髓间充质干细胞心肌纤维化程度轻，胶原组织中可见较多心肌细胞再生。

2.5 超声心动图检测各组大鼠心功能指标 细胞移植后4周，将各组大鼠麻醉，观察心脏彩超情况，见表1。

心肌梗死组左室收缩末期内径、左室舒张末期内径较假手术组明显增加，左室射血分数、左室短轴缩短率明显降低。

各实验处理组中，硫化氢组、骨髓间充质干细胞组及硫化氢预处理骨髓间充质干细胞组左室射血分数、左室短轴缩短率显著高于生理盐水组(P < 0.05)；硫化氢组与骨髓间充质干细胞组相比，左室射血分数、左室短轴缩短率2组数据差异无显著性意义(P > 0.05)；硫化氢预处理骨髓间充质干细胞组分别与硫化氢组、骨髓间充质干细胞组相比差异有显著性意义 (P < 0.05)。

参考文献

[1] Braunwald E, Bristow MR. Congestive heart failure: fifty years of progress. Circulation. 2000;102(20 Suppl 4): IV14-23.

[2] Puymirat E, Ducrocq G. [Comparison between European Society of Cardiology (ESC) and American College of Cardiology/American Heart Association (ACC/AHA) guidelines for initial management of ST-elevation myocardial infarction (STEMI)]. Ann Cardiol Angeiol (Paris). 2013.

[3] Hillis LD, Smith PK, Anderson JL, et al. 2011 ACCF/AHA guideline for coronary artery bypass graft surgery: executive summary: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Thorac Cardiovasc Surg. 2012;143(1): 4-34.

[4] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 2001;410(6829): 701-705.

[5] Pittenger MF, Martin BJ. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res. 2004;95(1): 9-20.

[6] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(18): 10344-10349.

[7] Anversa P, Cheng W, Liu Y, et al. Apoptosis and myocardial infarction. Basic Res Cardiol. 1998;93 Suppl 3: 8-12.

[8] Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med. 2001;7(4): 430-436.

[9] Marelli D, Desrosiers C, el-Alfy M, et al. Cell transplantation for myocardial repair: an experimental approach. Cell Transplant. 1992;1(6): 383-390.

[10] Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 2002;105(1): 93-98.

[11] Abe K, Kimura H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator. J Neurosci. 1996;6(3): 1066-1071.

[12] Wang R. Two's company, three's a crowd: can H2S be the third endogenous gaseous transmitter? FASEB J. 2002; 16(13):1792-1798.

[13] Olson KR, Donald JA. Nervous control of circulation--the role of gasotransmitters, NO, CO, and H2S. Acta Histochem. 2009; 111(3): 244-256.

[14] Yong QC, Cheong JL, Hua F, et al. Regulation of heart function by endogenous gaseous mediators-crosstalk between nitric oxide and hydrogen sulfide. Antioxid Redox Signal. 2011;14(11): 2081-2091.

[15] Chen X, Jhee KH, Kruger WD. Production of the neuromodulator H2S by cystathionine beta-synthase via the condensation of cysteine and homocysteine. J Biol Chem. 2004;279(50): 52082-52086.

[16] Kamoun P. Endogenous production of hydrogen sulfide in mammals. Amino Acids. 2004;26(3): 243-254.

[17] Robert K, Vialard F, Thiery E, et al. Expression of the cystathionine beta synthase (CBS) gene during mouse development and immunolocalization in adult brain. J Histochem Cytochem. 2003;51(3): 363-371.

[18] Ishii I, Akahoshi N, Yu XN, et al. Murine cystathionine gamma-lyase: complete cDNA and genomic sequences, promoter activity, tissue distribution and developmental expression. Biochem J. 2004;381(Pt 1): 113-123.

[19] Zhao W, Zhang J, Lu Y, et al. The vasorelaxant effect of H(2)S as a novel endogenous gaseous K(ATP) channel opener. EMBO J. 2001;20(21): 6008-6016.

[20] Nagao M, Duenes JA, Sarr MG. Role of hydrogen sulfide as a gasotransmitter in modulating contractile activity of circular muscle of rat jejunum. J Gastrointest Surg. 2012;16(2): 334-343.

[21] Szabó G, Veres G, Radovits T, et al. Cardioprotective effects of hydrogen sulfide. Nitric Oxide. 2011;25(2): 201-210.

[22] Huang C, Kan J, Liu X, et al. Cardioprotective effects of a novel hydrogen sulfide agent-controlled release formulation of s-propargyl-cysteine on heart failure rats and molecular mechanisms. PLoS One. 2013;8(7): e69205.

[23] Yao LL, Huang XW, Wang YG, et al. Hydrogen sulfide protects cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis by preventing GSK-3beta-dependent opening of mPTP. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010;298(5): H1310-1319.

[24] Cao Y, Adhikari S, Ang AD, et al. Mechanism of induction of pancreatic acinar cell apoptosis by hydrogen sulfide. Am J Physiol Cell Physiol. 2006;291(3): C503-510.

[25] Baskar R, Li L, Moore PK. Hydrogen sulfide-induces DNA damage and changes in apoptotic gene expression in human lung fibroblast cells. FASEB J. 2007;21(1): 247-255.

[26] Wang T, Tang W, Sun S, et al. Intravenous infusion of bone marrow mesenchymal stem cells improves myocardial function in a rat model of myocardial ischemia. Crit Care Med. 2007;35(11): 2587-2593.

[27] Nardi NB, Camassola M. Isolation and culture of rodent bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells. Methods Mol Biol. 2011;698: 151-160.

[28] Tang YL, Zhao Q, Qin X, et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 2005;80(1): 229-236; 236-237.

[29] Xie X, Sun A, Zhu W, et al. Transplantation of mesenchymal stem cells preconditioned with hydrogen sulfide enhances repair of myocardial infarction in rats. Tohoku J Exp Med. 2012;226(1): 29-36.

[30] Dai W, Hale SL, Martin BJ, et al. Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium: short- and long-term effects. Circulation. 2005;112(2): 214-223.

[31] Nygren JM, Jovinge S, Breitbach M, et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 2004;10(5): 494-501.

[32] Hu X, Yu SP, Fraser JL, et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. J Thorac Cardiovasc Surg. 2008; 135(4): 799-808.

[33] Tang G, Wu L, Liang W, et al. Direct stimulation of K(ATP) channels by exogenous and endogenous hydrogen sulfide in vascular smooth muscle cells. Mol Pharmacol. 2005;68(6): 1757-1764.

[34] Predmore BL, Lefer DJ. Development of hydrogen sulfide-based therapeutics for cardiovascular disease. J Cardiovasc Transl Res. 2010;3(5): 487-498.

[35] Calvert JW, Coetzee WA, Lefer DJ. Novel insights into hydrogen sulfide--mediated cytoprotection. Antioxid Redox Signal. 2010;12(10): 1203-1217.

[36] Gallyas F. Involvement of redox-signalling in endogenous hydrogen sulfide production. Br J Pharmacol. 2012;166(8): 2228-2230.

[37] Xie X, Sun A, Zhu W, et al. Transplantation of mesenchymal stem cells preconditioned with hydrogen sulfide enhances repair of myocardial infarction in rats. Tohoku J Exp Med. 2012;226(1): 29-36.

[38] Hu Y, Chen X, Pan TT, et al. Cardioprotection induced by hydrogen sulfide preconditioning involves activation of ERK and PI3K/Akt pathways. Pflugers Arch. 2008;455(4): 607-616.

[39] Shao JL, Wan XH, Chen Y, et al. H2S protects hippocampal neurons from anoxia-reoxygenation through cAMP-mediated PI3K/Akt/p70S6K cell-survival signaling pathways. J Mol Neurosci. 2011;43(3): 453-460.

引言

心肌梗死是心血管系统常见病，可使心肌细胞不可逆损伤和瘢痕形成，最终导致心力衰竭^[1]。目前临床治疗心肌梗死的方法包括药物治疗、介入治疗及手术治疗等。2012年欧洲心脏病学会和美国心脏病学院/美国心脏协会急性心肌梗死治疗指南中均强调再灌注治疗的重要性^[2]。针对在急性心肌梗死再灌注治疗时间窗的患者，急诊经皮冠状动脉介入治疗可使患者获益，但术后需长期服用抗血小板药物增加了治疗成本。2011年美国心脏病学会基金会/美国心脏协会冠状动脉搭桥指南指出^[3]，对于多支病变，冠状动脉介入后再狭窄及心肌梗死后遗症的患者，可选择外科冠状动脉搭桥，但对于老年或一般情况较差的患者，外科手术的风险明显增加。无论是介入还是搭桥，这些再灌注治疗可在一定程度上缓解患者症状，改善冠状动脉血流，但并不能修复已经梗死的心肌，恢复梗死区心肌功能。

骨髓间充质干细胞是骨髓内除造血干细胞外的另一类成体干细胞，具有定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞等中胚层细胞的能力^[4]。由于骨髓间充质干细胞具有来源广泛，体外可大量扩增，基因转染率高等优点^[5]，可用于修复心肌细胞，抑制心肌细胞凋亡，改善心功能，抑制心室重构等^[6-8]。这些作用虽然已被证实，但是移植后的细胞存活率低等原因限制了骨髓间充质干细胞的治疗效果^[9]，Toma等^[10]的研究显示，在移植4 d后，只有0.44%的细胞存活，分化成心肌细胞的更少。因此，增加移植后细胞存活率对提高细胞移植的治疗效果非常重要。

硫化氢曾被认为是一种有臭鸡蛋气味的毒性气体。近年来，研究者证实硫化氢是继一氧化氮、一氧化碳后又一个重要的气体递质，参与调节人体的生理及病理过程^[11-14]。在哺乳动物组织中，内源性硫化氢的产生通过2条依赖5’磷酸吡哆盐途径。含硫氨基酸在胱硫醚-β-合酶、胱硫醚-γ-裂解酶和3-巯基转移酶的作用下生成内源性硫化氢^[15]。这3种酶在人体组织中大量存在，并呈不均匀分布^[16]。神经系统中含胱硫醚-β-合酶较多，而在心血管系统中的硫化氢主要来源于胱硫醚-γ-裂解酶^[17-18]。胱硫醚-γ-裂解酶不仅存在于血管平滑肌细胞中，也在内皮细胞中证实了其存在^[19-20]。硫化氢对心脏的保护作用主要是类似一氧化氮的舒血管作用以及保护心肌急性缺血而导致的心肌细胞损伤^[21-22]。近几年对硫化氢的研究更多专注于它在体内或体外对细胞的保护作用，并发现它可以保护多种细胞^[23]，如抗伤害应激、抗炎等，但也有报道称硫化氢可诱导细胞凋亡^[24-25]。

实验利用硫化氢对细胞的保护作用，将骨髓间充质干细胞直接移植与硫化氢预处理的骨髓间充质干细胞移植相比较，通过建立大鼠心肌梗死模型、超声心动图等手段检测和评估各组疗效，探讨硫化氢预处理对骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死效果的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年4月至2013年2月在中国科学技术大学生命科学院和安徽医科大学动物实验中心完成。

材料：

外源性硫化氢预处理骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死实验的主要试剂及仪器：

实验动物：体质量(100±20) g SFP级SD大鼠，雌雄均可，用于骨髓间充质干细胞的分离和培养；另有50只体质量(200±20) g SPF级SD雄性大鼠用于动物实验。由安徽医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(皖)2011-002。实验过程中对动物的处置应符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离、培养^[26-27]：SFP级SD大鼠(100±20) g，麻醉断颈处死后，无菌条件下分离双下肢肌肉组织取股骨及胫骨，放入PBS中冲洗2次，显露骨髓腔，用不含胎牛血清的低糖DMEM液冲洗骨髓腔，获取骨髓细胞悬液。将冲洗液收集离心管中，离心弃上清。在细胞沉淀中加入含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养液，小心吹打均匀成细胞悬液。将细胞悬液移入备好的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%的CO₂细胞培养箱内。培养两三天后，更换培养液弃去悬浮细胞，以后每隔两三天更换培养液。细胞长至铺满培养瓶底部70%-80%，接近融合时，按1∶2进行传代。取第4代细胞用于后续实验。

大鼠心肌梗死模型的建立^[28]：SD大鼠(200±20) g称质量后，用1%水合氯醛腹腔注射麻醉。待大鼠肌张力丧失，气管插管，连接心电图，呼吸机正压辅助呼吸。剪去胸部毛发并消毒局部皮肤。沿左侧胸骨旁线剪开约1.5 cm皮肤切口，依次钝性分离胸部肌肉，暴露3-5肋，并向两边扩开，打开胸腔、心包，暴露左心耳，于左心耳下方约2 mm处用7号带线缝针进行结扎左冠状动脉前降支，并描记即刻心电图，出现ST段弓背向上型抬高并持续半小时以上及局部组织颜色变白作为确定心肌梗死模型复制成功的标志，术后腹腔内注射青毒素40×10⁴ U/d，连续3 d，预防感染，造模后大鼠单只单笼饲养。

动物分组：用于动物实验的大鼠共50只，心肌梗死组40只大鼠结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型，假手术组10只大鼠只穿线不结扎。造模成功后观察24 h，将40只模型大鼠按随机数字表法分为4组(n=10)，分别在梗死区域注射生理盐水、骨髓间充质干细胞、硫化氢预处理骨髓间充质干细胞及硫化氢。5组大鼠间体质量差异无显著性意义(P > 0.05)。

骨髓间充质干细胞移植前分组干预^[29]：选择第4代骨髓间充质干细胞。硫化氢预处理骨髓间充质干细胞组：于移植前30 min将200 μmol/L NaHS加入至培养液中；硫化氢组：将200 μmol/L NaHS加入300 μL PBS中；骨髓间充质干细胞组则不做任何处理，直接使用细胞悬液；生理盐水500 μL为对照组。

干细胞移植^[30]：建立心肌梗死模型后观察24 h。将第4代骨髓间充质干细胞进行实验处理，并在移植前2 h用DAPI标记，注意避光。用PBS清洗并消化细胞，将细胞悬液调至总量为500 μL，调整每组细胞计数约1.0×10⁶。移植时，在梗死区域选择5个注射点，用2 mL注射器吸取需要移植的实验组细胞或生理盐水，每点心肌内注射100 μL，斜行缓慢进针防止刺穿心肌。结束后，观察大鼠循环稳定后，逐层关闭胸腔，并用20 mL注射器抽尽胸腔积气。

取材及标本制作：移植后4周后麻醉动物。开胸、暴露心脏，在不停跳情况下迅速取出心脏，用生理盐水快速冲洗干净，用解剖刀沿心脏短轴方向切开，于30 s内迅速切下梗死及梗死周围区心肌组织，石蜡包埋及切片。

主要观察指标：

骨髓间充质干细胞形态及移植后标记：在细胞分离后培养的过程中须注意观察细胞成长的形态，大小及细胞状态，以保证后续试验所用的细胞状态良好，避免因细胞状态引起的实验误差。移植前用DAPI标记，实验结束后制作心肌标本观察干细胞移植情况。

心肌梗死造模成功的证据：将大鼠麻醉、固定后立即接通心电监护，术中监测大鼠心电改变的情况，以此做为心肌梗死造模成功的证据。

超声心动图：用1%水合氯醛麻醉大鼠并固定，备皮，暴露胸部皮肤。用二维多普勒超声心动仪检测左室舒张末期内径、左室收缩末期内径，并根据公式计算左室射血分数和左室短轴缩短率。

心肌组织Masson染色：取结扎梗死区域心肌组织石蜡切片，在37 ℃下用二甲苯脱蜡2次，用体积分数100%，95%，85%，75%乙醇逐级水化，然后水洗10 min。用丽春红酸性品红液染色10 min后用蒸馏水清洗。再用1%磷钼酸溶液染色2 min，苯胺蓝或亮绿染色液染色 5 min后用蒸馏水清洗。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。用显微镜观察梗死区域结构变化，记录图像。

统计学分析：统计学处理为第一作者，用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料用x(_)±s表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

多年来，国内外研究者对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死进行了多方面的实验，包括移植途径、移植数量、移植最佳时间、归巢等，但移植后细胞存活率低成为了该技术的瓶颈。研究表明影响移植后细胞存活率的主要因素包括移植后微环境，细胞因子的作用等。为了提高移植效率，常用的方法是缺氧预处理^[31]，这种方法可在增强移植后干细胞短时间内的存活力，减少凋亡，修复梗死心肌^[32]。国外另有研究者从基因、分子水平干预移植前的骨髓间充质干细胞，虽取得一定成果，但是投入成本较高，技术复杂等原因制约了其进一步应用。

本实验用一定量的外源性硫化氢受体NaHS预处理骨髓间充质干细胞，利用硫化氢的生理作用从而达到增加细胞移植效率的目的。从实验的Masson染色结果中可以看出，硫化氢、骨髓间充质干细胞、硫化氢预处理干细胞组中，已经梗死的心肌胶原中都有不同程度的心肌组织再生。大鼠心脏彩超也得到了类似的结论，这3组的心功能比对照组有明显改善。不仅如此，结果显示单纯的硫化氢注射于梗死心肌周围也能起到一定的改善心功能的作用，梗死胶原中心肌细胞再生极少，反而在梗死周边部分可看到较多的心肌细胞包裹胶原组织。心脏彩超也证实了单纯的硫化氢也可有改善心功能的作用。尽管在Masson染色切片中可看出骨髓间充质干细胞移植组中细胞再生的情况优于硫化氢组，但是彩超结果表示2组相比射血分数差异无显著性意义，因不能排除实验操作中注射细胞或者NaHS时导继发心肌细胞减少，故以心脏彩超结果为准，认为2组间差异无显著性意义。梗死心肌细胞不可再生，虽然有研究表明硫化氢在心血管系统中也有修复心肌、抗缺血再灌注的作用，但效果局限。骨髓间充质干细胞又因其移植后存活率低的问题也达不到良好的治疗效果。所以，作者观察了用硫化氢预处理后的骨髓间充质干细胞移植组是否能够达到更理想的疗效。Masson染色结果显示梗死区域的胶原基本被再生的心肌组织包裹，心脏彩超中的心功能也较其他组明显改善。

国内外的学者研究硫化氢在组织和细胞中的保护机制，并已得出较统一的结论。在心脏中，硫化氢由心肌、平滑肌细胞、血管中的L-半胱氨酸通过胱硫醚-γ-裂解酶作用产生，参与了机体重要的病理生理过程。硫化氢是惟一能够介导ATP敏感的钾离子通道(ATP-sensitive K⁺ channel, KATP channel)开放的气体信号分子，通过增加K⁺外流诱导单个血管、平滑肌细胞超极化，在一定程度上修复梗死心肌^[33-34]。已有研究证明，硫化氢对心脏和其他某些器官均有不同程度的保护作用^[35-36]，而硫化氢对细胞的保护作用主要通过增加磷酸化蛋白激酶B，磷酸化细胞外信号调节激酶和磷酸化糖原合酶激酶3β的水平，对抗缺氧微环境诱导的细胞损伤^[37]。Hu等^[38-39]的研究显示，硫化氢预处理可以激活细胞中的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、细胞外信号调节激酶、蛋白激酶C通路从而保护细胞，用LY-294002阻断磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B，PD 98509阻断细胞外信号调节激酶，用白屈菜红碱特异性阻断蛋白激酶C，或用其他Akt通路抑制剂，结果硫化氢预处理后对细胞的保护作用明显减弱，用KATP阻断剂格列苯脲也能明显削弱硫化氢预处理诱导的细胞外信号调节激酶的磷酸化作用。

硫化氢对细胞的保护机制虽已基本证实，但是在骨髓间充质干细胞中的作用还需要进一步研究和证实。总而言之，硫化氢预处理骨髓间充质干细胞可提高移植后的细胞存活率，改善梗死后心功能，比基因、分子等干预手段更易操作，且更经济，可推广至实验室研究，并进一步应用于临床治疗等领域，为骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的临床研究提供理论和实践依据。

外源性硫化氢预处理骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells preconditioned with hydrogen sulfide in the treatment of rat myocardial infarction

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta 分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(在线): 3-.
[2]	陈劲松, 王中汉, 常非, 刘贺. 多种特殊状态下关节软骨缺损修复的组织工程技术[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1272-1279.
[3]	乔雪松, 陈霓, 杨风英, 牛燕媚. 运动调控间充质干细胞来源骨髓脂肪细胞的作用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1293-1298.
[4]	张圣敏, 刘超. 生物支架材料诱导脂肪来源干细胞成骨分化的最新热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1107-1116.
[5]	王田田, 王建忠. 骨髓间充质干细胞治疗早期股骨头坏死的应用与前景 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1117-1122.
[6]	王张玲, 余丽梅, 赵春华. 间充质干细胞线粒体转移治疗修复组织损伤的作用 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1123-1129.
[7]	邓俊豪, 李苗, 张里程, 唐佩福. 三维悬滴法培养间充质干细胞在组织损伤修复中的应用及优势[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1101-1106.
[8]	任春梅, 刘玉芳, 许诺, 邵苗苗, 何建亚, 李晓杰. 非编码RNAs在人牙髓干细胞中的调控作用及机制 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1130-1137.
[9]	黄文文, 李硕, 侯宗柳, 王文举. 炎症性肠病发病机制及间充质干细胞治疗的作用与问题 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1138-1143.
[10]	何林, 白晋伟, 苏伟. 基于Scopus数据分析多能干细胞研究领域的文章、作者及高影响力机构[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1144-1148.
[11]	刘春栋, 申晓青, 张艳丽, 张小根, 吴补领. 钛表面锶改性后骨髓基质干细胞黏附、迁移、增殖及成骨相关基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1009-1015.
[12]	林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.
[13]	陈钢泓, 曾超明, 陈梓铭, 廖俊星, 马元琛, 郑秋坚. 骨髓间充质干细胞关节腔注射治疗兔软骨缺损的最适浓度[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 996-1001.
[14]	张文, 雷堃, 高磊, 李宽新. 慢病毒介导骨形态发生蛋白7基因转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 985-990.
[15]	吴志峰, 罗民. 化学去细胞异体神经联合骨髓间充质干细胞修复损伤坐骨神经的生物力学评价[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 991-995.