动员自身骨髓干细胞与缺血再灌注肾损伤细胞的凋亡与增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (49): 8488-8497.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.005

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动员自身骨髓干细胞与缺血再灌注肾损伤细胞的凋亡与增殖

毕凌云¹，杨达胜¹，赵德安¹，梁斌¹，张瑞霞¹，白海涛²

1新乡医学院第一附属医院儿科，河南省卫辉市 453100
2厦门大学附属第一医院儿科，福建省厦门市 361003

修回日期:2013-09-20 出版日期:2013-12-03 发布日期:2013-12-03
通讯作者: 杨达胜，教授，主任医师，副院长，新乡医学院第一附属医院，河南省卫辉市 453100 yds0811@126.com
作者简介:毕凌云☆，女，1978年生，汉族，河南省新乡市人，博士，讲师，主治医师，主要从事小儿肾脏病及儿童血液净化方面的研究。woailtt2006@163.com
基金资助:
2006年河南省医学科技公关项目-89*；2009年新乡医学院第七批省级重点学科开放课题(ZD200909)*

Mobilization of autologous bone marrow stem cells is involved in cell apoptosis and proliferation following renal ischemia-reperfusion injuries

Bi Ling-yun¹, Yang Da-sheng¹, Zhao De-an¹, Liang Bin¹, Zhang Rui-xia¹, Bai Hai-tao²

1Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China
2Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, Fujian Province, China

Revised:2013-09-20 Online:2013-12-03 Published:2013-12-03
Contact: Yang Da-sheng, Professor, Chief physician, Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China yds0811@126.com
About author:Bi Ling-yun☆, M.D., Lecturer, Attending physician, Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China woailtt2006@163.com
Supported by:
the Medical Technology Tackle Key Project of Henan Province in 2006, No. 89*; Open Topics of Provincial Key Disciplines in Xinxiang Medical College in 2009 (7th Batch), No. ZD200909*

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓干细胞具有多项分化潜能，可分化为肾组织固有细胞、修复损伤肾组织。
目的：探讨粒细胞集落刺激因子联合干细胞因子动员自身骨髓干细胞对大鼠缺血再灌注肾损伤细胞凋亡与增殖的影响。
方法：160只大鼠尿筛阴性后随机均分为正常对照组、模型组、细胞因子治疗组、治疗对照组。模型组和细胞因子治疗组建立大鼠单侧肾脏缺血再灌注损伤模型；细胞因子治疗组和治疗对照组于造模后24 h开始皮下注射粒细胞集落刺激因子(50 μg/kg，1次/d)和干细胞因子(200 μg/kg，1次/d)，连续5 d；模型组不给药，正常对照组不予干预。TUNEL法检测细胞凋亡；免疫组织化学法(SABC法)检测肾组织CD34+细胞、Caspase-3、Bcl-2、细胞增殖核抗原表达情况。
结果与结论：细胞因子治疗组肾组织内CD34+细胞较正常对照组、模型组明显增多(P < 0.05)。不同时间点模型组和细胞因子治疗组凋亡指数、Capase-3表达量均高于正常对照组和治疗对照组(P < 0.05)，且模型组均显著高于细胞因子治疗组(P < 0.05)。不同时间点模型组和细胞因子治疗组Bcl-2阳性表达细胞均高于正常对照组和治疗对照组(P < 0.05)。细胞因子治疗组显著高于模型组，然后随着时间推移Bcl-2表达量明显减少(P < 0.05)。模型组和细胞因子治疗组均可见细胞增殖核抗原阳性表达细胞；模型组于第24天增殖指数达峰值，后逐渐下降。细胞因子治疗组在第10天即达到高峰，持续至第17天，然后逐渐下降。说明粒细胞集落刺激因子联合干细胞因子动员自身骨髓干细胞可以促进肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞的增殖和减少细胞凋亡，从而有利于肾小管损伤的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 肾损伤, 干细胞因子, 粒细胞集落刺激因子, 肾缺血再灌注损伤, 细胞凋亡, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow stem cells are defined by their multi-potential ability, and can be differentiated into intrinsic cells in the kidney.
OBJECTIVE: To study the effects of mobilizing autologous bone marrow stem cells by granulocyte colony-stimulating factor plus stem cell factor on cell apoptosis and proliferation of rats with renal ischemia-reperfusion injury.
METHODS: Totally 160 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: control group, model group, cytokine treatment group, cytokine control group. Rat models of unilateral renal ischemia-reperfusion injury were established in the model and cytokine treatment groups. Rats in the cytokine treatment group and cytokine control group received subcutaneous injection of granulocyte colony-stimulating factor (50 μg/kg) and stem cell factor (200 μg/kg), once a day, for 5 continuous days. Rats in the model and control groups had no treatment. Apoptotic cells were detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling method, and the expression of CD34-positive cells, Caspase-3, Bcl-2, proliferating cell nuclear antigen in the kidney were measured using immunohistochemistry staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of CD34-positive cells in renal tissue of the cytokine treatment group was significantly higher than that of the control group and model group (P < 0.05). The apoptotic index and expression of Capase-3 in the model group and cytokine treatment group were higher than those in the control group and cytokine control group (P < 0.05). The apoptotic index and expression of Capase-3 in the cytokine treatment group were lower than that in the model group (P < 0.05). The expression of Bcl-2 in the model group and cytokine treatment group was higher than that in the control group and cytokine control group (P < 0.05). The expression of Bcl-2 in the cytokine treatment group was higher than that in the model group (P < 0.05); however, as time went on, Bcl-2 expression was obviously decreased. Proliferating cell nuclear antigen expressed both in the model group and in the cytokine treatment group. Additionally, the proliferative index reached peak at 24 days in the model group, and then decreased gradually; while in the cytokine treatment group, it reached the peak at 10 days, maintained a high level until the 17th day, and then decreased gradually. Mobilization of autologous bone marrow stem cells by combination of granulocyte colony-stimulating factor and stem cell factor can increase proliferation and decrease apoptosis of renal tubular epithelial cells after renal ischemia-reperfusion injury, and thus, promote the recovery from renal tubular injury.

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Key words: stem cells, kidney, ischemia-reperfusion injury, reperfusion injury, stem cell factor, granulocyte colony-stimulating factor

中图分类号:

R394.2

毕凌云，杨达胜，赵德安，梁斌，张瑞霞，白海涛. 动员自身骨髓干细胞与缺血再灌注肾损伤细胞的凋亡与增殖[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8488-8497.

Bi Ling-yun, Yang Da-sheng, Zhao De-an, Liang Bin, Zhang Rui-xia, Bai Hai-tao. Mobilization of autologous bone marrow stem cells is involved in cell apoptosis and proliferation following renal ischemia-reperfusion injuries[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8488-8497.

图/表（结果） 13

2.1 实验动物数量分析 实验共纳入SD大鼠160只，均分为4组进行实验观察，每组40只，分别于每时间点留取8只标本，实验过程中7只大鼠死亡，模型组死亡5只，细胞因子治疗组死亡2只，均死于感染。见表1。

2.2 肾组织细胞凋亡和凋亡指数的比较 见表2，图1-3。

模型组和细胞因子治疗组凋亡指数高于两对照组(P < 0.05)，模型组显著高于细胞因子治疗组(P < 0.05)，随着时间推移肾小管上皮细胞凋亡逐渐减少。

2.3 肾组织Caspase-3表达 见表3，图4-6。

模型组和细胞因子治疗组Capase-3表达量高于正常对照组和治疗对照组(P < 0.05)，模型组均显著高于细胞因子治疗组(P < 0.05)。模型组、细胞因子治疗组大鼠同组对照手术后第10，17，24，31天均较前一时间点减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 肾组织Bcl-2表达 模型组和细胞因子治疗组Bcl-2阳性表达细胞均高于正常对照组和治疗对照组 (P < 0.05)。模型组、细胞因子治疗组同组对照在手术后第10，17天均较前一时间点显著增强(P < 0.05)，造模后第17天两组表达量最高，且细胞因子治疗组显著高于模型组，然后随着时间推移Bcl-2表达量明显减少(P < 0.05)。见图7-9，表4。

2.5 肾组织细胞增殖核抗原表达 见图10-12，表5。

各时间点正常对照组和治疗对照组肾小管上皮细胞增殖指数相比较，差别无显著性意义(P > 0.05)。模型组和细胞因子治疗组不同时间点均有明显的细胞增殖核抗原阳性表达细胞(P < 0.05)。增殖指数显示模型组于第24天达峰值，后逐渐下降。细胞因子治疗组在第10天即达到高峰，持续至17 d，然后逐渐下降。

2.6 肾组织CD34⁺细胞表达 见图13-15。

造模干预后第5天、第10天及第17天，模型组和细胞因子治疗组肾组织CD34⁺细胞较正常对照组和治疗对照组显著增多(P < 0.05)，并且同时间点细胞因子治疗组较模型组增多更明显(P < 0.05)。手术后第24天细胞因子治疗组肾组织CD34⁺细胞恢复正常，而模型组仍偏高，但与其他3组比较，差异无显著性意义。

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引言

材料方法

设计：动物实验，对照观察。

时间及地点：实验于2010年1月至2011年6月在新乡医学院第一附属医院中心实验室完成。

材料：

动员自身骨髓干细胞对大鼠缺血再灌注肾损伤细胞凋亡与增殖实验的主要试剂及药物：

实验动物：健康雄性8-10周龄SD大鼠160只，体质量250-280 g，由郑州大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(豫)2009-052。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

缺血再灌注肾损伤模型的建立及动物分组：160只大鼠尿筛阴性后随机均分为4组：正常对照组、模型组、细胞因子治疗组、治疗对照组。模型组和细胞因子治疗组参照Supavekin等^[18]的方法建立大鼠单侧肾脏缺血再灌注损伤模型；细胞因子治疗组于造模后24 h开始皮下注射粒细胞集落刺激因子(50 μg/kg，1次/d)和干细胞因子(200 μg/kg，1次/d)，连续5 d^[19]；模型组不给药，治疗对照组同时间及同剂量给正常大鼠注射治疗粒细胞集落刺激因子和干细胞因子，正常对照组仅正常喂养，不予干预。由于骨髓动员剂通常在用药后3-5 d可使外周血干细胞达到高峰^[20]，结合预实验结果，选取干预措施第5天为检测起始时间点。

肾组织标本留取：干预后5，10，17，24，31 d每组随机取出8只大鼠留取标本。10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，摘除左肾，生理盐水冲洗，用手术刀片切成1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm大小的组织块，置于体积分数10%中性甲醛缓冲液中固定。

TUNEL法检测肾小管细胞凋亡：实验步骤：①4 µm石蜡切片常规脱蜡至水。②体积分数0.3%H₂O₂的甲醇液室温作用5 min，0.01 mol/L PBS洗涤。③20 mg/L蛋白酶K处理，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗涤。④加入TUNEL反应混合液50 µL，37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗涤。⑤POD转换液50 µL，37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗涤。⑥DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。

计算凋亡指数(apoptotic index，AI)：在普通光学显微镜下连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)%。

免疫组织化学检查：实验步骤：免疫组织化学检测采用链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶方法(SABC法)。 4 µm石蜡切片常规脱蜡、水化，枸橼酸缓冲液微波修复，高火5 min，中火5 min，5%BSA封闭后，分别以兔抗大鼠CD34多克隆抗体(1∶200)、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体(1∶100)、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体(1∶100)、兔抗大鼠细胞增殖核抗原多克隆抗体(1∶100)作为一抗，4 ℃过夜，PBS洗后加入山羊抗兔lgG作为二抗，37 ℃恒温箱孵育30 min，PBS洗涤后显色。用PBS代替一抗作空白对照。

免疫组织化学结果的评价：光镜下组织呈棕色或棕黄色颗粒性沉淀区域为阳性染色部位。CD34，Caspase-3，Bcl-2和细胞增殖核抗原染色结果在400倍镜下每例切片随机选择10个不重叠的视野，应用IDA-2000计算机图像自动分析系统对选取视野内免疫组织化学阳性信号进行图像分析，分别计数每个视野CD34，Caspase-3，Bcl-2和细胞增殖核抗原阳性细胞数目占总肾小管细胞数的百分比，取其平均值为免疫组织化学染色结果。

主要观察指标：观察肾组织凋亡细胞和CD34，Caspase-3，Bcl-2，细胞增殖核抗原表达变化，观察骨髓干细胞动员剂作用下损伤肾组织内是否有干细胞，并且能够抑制细胞凋亡、发挥修复损伤肾组织的作用。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件分析，各组数据均采用x(_)±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用两组独立样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

肾脏是发生缺血再灌注损伤极为常见的器官之一，尤其肾移植，不可避免的要经历一定程度的缺血再灌注损伤。肾移植患者术后都有一个多尿期，在这一时期中患者易发生低钠、低钾、低氯血症。正常情况下，肾小球滤过液流经近端小管后，67%的钠、钾、氯和水被重吸收；小管液在流经髓袢的过程中又有约20%的钠、钾、氯被重吸收，而实验观察到的细胞凋亡刚好主要主要集中在皮髓质交界处肾小管中，髓质肾小管次之，而在皮质中则主要以近曲小管为主，此结果与国内同类研究的结果一致^[21-22]。肾缺血再灌注后细胞凋亡的过度发生必将破坏髓袢、近曲小管等处的组织结构和对水、钠、钾、氯的重吸收功能，所以可以推测细胞凋亡可能是肾移植后发生多尿和低钠、低钾、低氯的重要病理生理基础之一。

肾缺血再灌注损伤在临床常见，发病率较高，但目前尚缺乏有效治疗措施，因此如何对抗这一病理损伤过程越来越引起人们的重视。随着对干细胞的深入研究，发现干细胞动员剂可以用于治疗和预防心肌、脑等重要组织器官的缺血再灌注损伤^[23-24]。目前，粒细胞集落刺激因子及干细胞因子与缺血再灌注的相关研究还主要集中在心脏和神经系统中，在其它器官中的相关研究鲜有报道。关于干细胞动员剂能否对缺血再灌注的肾脏起保护作用及其相关机制的研究，目前国内外相关报道罕见。作者前期实验联合使用骨髓间充质干细胞动员剂干细胞因子和粒细胞集落刺激因子，能明显增加损伤肾组织髓间充质干细胞的数量，减轻肾组织损伤程度^[25]。

作者这次实验结果表明，治疗对照组肾组织切片仅见少量细胞增殖核抗原阳性细胞，和正常对照组无明显差异，表明干细胞动员剂本身促进细胞增殖可能性小。另外，作者同期实验结果已经证实干细胞动员剂动员的自身骨髓干细胞可以归巢至缺血再灌注损伤的肾组织。并且归巢到肾小管的量与外周血中CD34⁺细胞数量呈正相关，模型组和细胞因子治疗组肾组织CD34⁺细胞均增多，并且细胞因子治疗组较模型组增多更明显，而正常对照组和治疗对照组肾组织CD34⁺细胞无增加。说干细胞因子和粒细胞集落刺激因子可促使外周血干细胞增加，但肾组织损伤是干细胞“归巢”的重要因素^[26]。

这次实验采用TUNEL法和免疫组化法对大鼠肾组织进行凋亡细胞及Caspase-3蛋白的检测。结果显示，不同时间点模型组和细胞因子治疗组凋亡细胞均明显多于正常对照组和治疗对照组，Caspase-3在缺血再灌注后表达明显上调，Caspase-3的表达与细胞凋亡的分布基本一致，说明了肾缺血后再灌注确实触发了细胞凋亡的发生。细胞因子治疗组凋亡细胞及Caspase-3的表达显著低于模型组，说明粒细胞集落刺激因子和干细胞因子能够通过抑制Caspase-3的表达从而抑制细胞凋亡的发生，由此减轻肾脏缺血再灌注的损伤，促进肾小管的修复。

Bcl-2是重要的抗细胞凋亡基因之一。实验中Bcl-2在正常对照组和治疗对照组均仅有少量表达，在模型组和细胞因子治疗组Bcl-2表达显著上升，且细胞因子治疗组显著高于模型组，说明缺血再灌注肾损伤后，Bcl-2适应性上调表达，粒细胞集落刺激因子+干细胞因子有利于Bcl-2过表达，从而抑制缺血再灌注损伤诱发的肾小管上皮细胞凋亡，加快肾小管的修复。

综上所述，细胞凋亡在肾缺血再灌注损伤中起着重要作用，干细胞动员剂动员自身骨髓干细胞可抑制细胞凋亡，以促进肾小管上皮细胞的修复，其机制可能是上调Bcl-2和下调Caspase-3表达而实现的。

细胞增殖核抗原又称为周期蛋白，是一种细胞核内蛋白质，增殖细胞核抗原已经是评价细胞增殖状态的一个较为成熟的指标。作者这次实验中，正常对照组和治疗对照组肾组织不同时间点均可见少量增殖细胞核抗原阳性细胞，而模型组和细胞因子治疗组则均可见明显的增殖细胞核抗原阳性细胞。模型组和细胞因子治疗组较正常对照组和治疗对照组增殖细胞核抗原阳性细胞数明显增多，细胞因子治疗组的细胞增殖程度高于模型组。增殖指数显示模型组于第24天达峰值，后逐渐下降。细胞因子治疗组在第10天即达到高峰，持续至17 d，然后逐渐下降。即细胞因子治疗组损伤肾小管修复的速度比模型组快。由此说明肾脏在缺血再灌注损伤后出现了细胞增殖，且增殖细胞核抗原表达随着肾小管上皮细胞修复逐渐减少，而粒细胞集落刺激因子联合干细胞因子动员自身骨髓干细胞可以明显加快缺血再灌注损伤后肾小管细胞的增殖速度，从而加速肾小管上皮细胞修复。

另外，就缺血再灌注损伤后肾小管细胞增殖的范围而言，外髓区、皮-髓质交界处和皮质区均存在增殖细胞核抗原阳性细胞，其间分布无明显差异，提示肾小管细胞的增殖可涉及以细胞坏死、变性为主的皮质区与皮-髓质交界处的肾小管和以细胞凋亡为主的外髓区的肾小管，从而参与了各段肾小管上皮结构的修复与维持。

综上所述，干细胞动员剂主要是通过动员自身骨髓干细胞促进肾小管上皮细胞的增殖和减少细胞凋亡，从而利于肾小管损伤的修复，是否存在其他机制参与，尚需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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动员自身骨髓干细胞与缺血再灌注肾损伤细胞的凋亡与增殖

Mobilization of autologous bone marrow stem cells is involved in cell apoptosis and proliferation following renal ischemia-reperfusion injuries

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