芒果苷对缺氧损伤骨髓间充质干细胞凋亡的保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (49): 8481-8487.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.004

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芒果苷对缺氧损伤骨髓间充质干细胞凋亡的保护

李晓峰¹，罗世兴²，赵劲民¹，程建文¹，谭桢¹

1广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西壮族自治区南宁市 530021
2广西医科大学第九附属医院暨北海市人民医院骨科，广西壮族自治区北海市 536000

修回日期:2013-09-14 出版日期:2013-12-03 发布日期:2013-12-03
通讯作者: 赵劲民，博士，教授，广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西壮族自治区南宁市 530021 zhaojinmin@126.com
作者简介:李晓峰☆，男，1974年生，吉林省德惠县人，汉族，2011年广西医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事创伤外科手外科、组织工程研究。 xiaofengli74@163.com
基金资助:
广西卫生厅中医药科技专项(GZKZ 10-011)*；广西研究生教育创新项目(2010105981002D26)*；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20104503110002)*；广西科技厅人口健康与食品安全关键技术研究开发项目(桂科攻 1140003A-31)*；广西卫生厅自筹经费科研课题(Z2012059)*；广西教育厅立项项目(桂教201010LX050)*

Mangiferin protects bone marrow-derived mesenchymal stem cells against hypoxia-induced apoptosis

Li Xiao-feng¹, Luo Shi-xing², Zhao Jin-min¹, Cheng Jian-wen¹, Tan Zhen¹

1Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
2Department of Orthopedics, Ninth Hospital (Beihai People’s Hospital), Guangxi Medical University, Nanning 536000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2013-09-14 Online:2013-12-03 Published:2013-12-03
Contact: Zhao Jin-min, M.D., Professor, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China zhaojinmin@126.com
About author:Li Xiao-feng☆, M.D., Attending physician, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China xiaofengli74@163.com
Supported by:
the Science and Technology Program for Traditional Chinese Medicine, Department of Health of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. GZKZ 10-011*; Post-graduate Education Innovation Program of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2010105981002D26*; the Scientific Research Foundation for Doctors of High Institutes, No. 20104503110002*; the Development Program for the Key Technology of Population Health and Food Safety, Department of Science and Technology, Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 1140003A-31*; the Scientific Research Program of Self-provided Funds of Department of Science and Technology, Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. Z2012059*; the Program from the Department of Education of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 201010LX050*

摘要/Abstract

摘要：

背景：缺氧性死亡限制了细胞移植和组织再生中细胞的应用。
目的：观察芒果苷对氯化钴作用下骨髓间充质干细胞缺氧损伤性凋亡的保护作用。
方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，应用氯化钴建立细胞缺氧模型，以芒果苷对缺氧损伤下的骨髓间充质干细胞进行保护，通过MTT实验观察芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的保护作用；采用流式细胞仪检测芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧保护的细胞凋亡及线粒体膜电位检测结果。
结果与结论：氯化钴能显著抑制大鼠骨髓间充质干细胞的生长，并且呈明显的剂量依赖关系。氯化钴200 μmol/L处理细胞12 h，诱导细胞凋亡率为(42.49±3.96)%；处理细胞24 h，诱导细胞凋亡率为(46.37±4.49)%，随着芒果苷浓度的增加，大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的凋亡率逐步减少(P < 0.01)，芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤具有保护作用，且呈浓度依赖性。结果提示，氯化钴缺氧模型能成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡，具有剂量准确可控、无特殊设备要求、易操作等优点；芒果苷能有效抑制缺氧损伤时骨髓间充质干细胞的凋亡，对细胞具有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 缺氧, 凋亡, 芒果苷, 氯化钴, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Hypoxic death limits application of cells in transplantation and tissue regeneration.
OBJECTIVE: To investigate the protective effects of mangiferin on bone marrow-derived mesenchymal stem cells against hypoxia injury-induced apoptosis resulted from cobalt chloride.
METHODS: Rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells were in vitro cultured and hypoxia cell model was established by cobalt chloride. Model cells were treated with mangiferin. Protective effects of mangiferin were detected using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; cell apoptosis and mitochondrial membrane potential were detected using flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Cobalt chloride significantly inhibited growth of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a dose-dependent manner. The apoptosis rate of cells was (42.49±3.96)% after treated with 200 μmol/L cobalt chloride for 12 hours, (46.37±4.49)% after treated for 24 hours. With increasing concentration of mangiferin, apoptosis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in hypoxic model was gradually reduced (P < 0.01), indicating that mangiferin has a protective effect in a concentration-dependent manner on rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells in hypoxic injury. Cobalt chloride can induce hypoxic model successfully in bone marrow-derived mesenchymal stem cells. There are some advantages of accurate dose control, no special equipment requirements, and easy operation. Mangiferin can effectively inhibit bone marrow-derived mesenchymal stem cells apoptosis under hypoxic injury.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, hypoxia, apoptosis, membrane potentials, mitochondria

中图分类号:

R394.2

李晓峰，罗世兴，赵劲民，程建文，谭桢. 芒果苷对缺氧损伤骨髓间充质干细胞凋亡的保护[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8481-8487.

Li Xiao-feng, Luo Shi-xing, Zhao Jin-min, Cheng Jian-wen, Tan Zhen. Mangiferin protects bone marrow-derived mesenchymal stem cells against hypoxia-induced apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8481-8487.

图/表（结果） 5

2.1 氯化钴对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的细胞毒性 MTT法证实，氯化钴能显著抑制大鼠骨髓间充质干细胞的生长，并且呈明显的剂量依赖关系，见图1和表1。

其中氯化钴200 μmol/L处理24 h与正常细胞组的A值比值为53.41%，抑制率即为53.41%，接近IC₅₀，确定为以后实验浓度作用组。

2.2 芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤保护的MTT实验结果 MTT实验证实，芒果苷能显著保护缺氧损伤的大鼠骨髓间充质干细胞，并且呈明显地时间和剂量依赖关系，见表2。

氯化钴处理细胞12 h，芒果苷20 μmol/L组与单纯氯化钴200 μmol/L组的保护作用差异有显著性意义(P < 0.05)；随着芒果苷浓度的升高，芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞的保护作用逐渐增强，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

用氯化钴处理细胞24 h，随着芒果苷浓度的升高，芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞的保护作用逐渐增强，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

2.3 芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧保护的细胞凋亡率检测结果 芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的保护作用呈时间及浓度依赖性，见表3及图2。

用氯化钴200 μmol/L处理细胞12 h，诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率为(42.49±3.96)%。芒果苷20 μmol/L组无明显保护作用，芒果苷40 μmol/L组有显著保护作用(P < 0.05)；随着芒果苷浓度的升高，芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞的保护作用逐渐增强，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

用氯化钴200 μmol/L处理细胞24 h，诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率为(46.37±4.49)%，芒果苷20 μmol/L组有显著保护作用(P < 0.05)，随着芒果苷浓度的升高，芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞的保护作用逐渐增强，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

2.4 芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤保护的线粒体膜电位检测结果 见表4及图3。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的线粒体膜电位保护作用呈时间依赖性及浓度依赖性。

用氯化钴200 μmol/L处理细胞12 h，诱导细胞线粒体膜电位凋亡率为(35.60±3.18)%。芒果苷20 μmol/L组无明显保护作用，芒果苷40 μmol/L组有显著的保护作用(P < 0.05)；随着芒果苷浓度的升高，芒果苷的保护作用逐渐增强，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。用氯化钴200 μmol/L处理细胞24 h，诱导凋亡率为(42.57± 4.30)%，芒果苷20 μmol/L组有显著保护作用(P < 0.05)，随着芒果苷浓度的升高，芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞的保护作用逐渐增强，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

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引言

材料方法

设计：细胞生物学对比观察实验。

时间及地点：于2010年7月至2011年9月在广西医科大学基础医学院中心实验室完成。

材料：取SPF级4周龄SD大鼠，雄性，由广西医科大学动物实验中心提供，合格证号: SCXK(桂) 2009-0002。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤凋亡保护实验的主要试剂与仪器：

方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的培养：2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，体积分数75%乙醇全身浸泡消毒10 min。无菌条件取股骨及胫骨，PBS清洗3次。剪掉股骨和胫骨的骨骺端，用添加青、链霉素的L-DMEM培养基冲出骨髓，反复吹打并制成单细胞悬液，离心，弃上清，重悬以1×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于25 cm²培养瓶中，置37 ℃、CO₂饱和湿度培养箱中培养。使用第3代细胞进行实验。

大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定：流式细胞仪检测细胞表面标记；体外定向诱导分化成骨细胞及成脂细胞。具体操作及结果参见作者前期研究^[1]。

氯化钴对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的细胞毒性实验：①96孔板中间10列各孔中加入第3代骨髓间充质干细胞悬液200 μL，每孔含1×10⁴/孔，第1列和第12列加培养基200 μL。②培养箱中温育24 h。③第2列和第11列作为正常对照。按浓度梯度在第3-10列加入含氯化钴的无血清培养基孵育24 h(加入浓度依次为0，50，100，200，400，600，800，1 000 μmol/L)。④弃培养基，各孔更换200 μL新鲜的培养基。每日换液至48 h。⑤所有孔中各加入50 μL MTT，并用铝箔包裹培养板，于CO₂培养箱中温育4 h。⑥弃培养基和MTT，所有孔中各加入200 μL DMSO。492 nm处记录吸光度值(A)。读板仪用第1列的各孔调零。⑦分析以药物浓度为横坐标(X轴)，A值为纵坐标(Y轴)绘制曲线图。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤保护的MTT实验：①96孔板中间十列各孔中加入第3代大鼠骨髓间充质干细胞悬液200 μL，1×10⁴/孔，第1列和第12列加培养基200 μL。②CO₂培养箱中温育24 h。③芒果苷预保护：按浓度梯度在第2-11列加入芒果苷孵育2 h (浓度依次为10，20，30，40，50，60，80，120，160，200 μmol/L)。 ④吸去2-11列的培养基，PBS清洗2次，加入含氯化钴200 μmol/L的无血清培养基200 μL，并按上述浓度梯度加入芒果苷。⑤CO₂培养箱中温育24 h。⑥换新鲜培养基并每日换液至48 h。⑦所有孔中各加入50 μL MTT。铝箔包裹培养板，CO₂培养箱中温育4 h。⑧弃培养基和MTT，所有孔中各加入200 μL DMSO。⑨在492 nm处记录A值。读板仪用第1列的各孔调零。⑩分析以药物浓度为横坐标(X轴)，A值为纵坐标(Y轴)绘制曲线图。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤保护的细胞凋亡检测：①取第3代大鼠骨髓间充质干细胞，以5×10⁵/孔接种6孔板，饱和湿度下37 ℃，含体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h。②芒果苷预保护：按浓度梯度加入芒果苷孵育2 h(浓度依次为20，40，80，160 μmol/L)。③弃培养基，用PBS清洗2次，加入含200 μmol/L氯化钴的无血清培养基，再次加入芒果苷，再次加入上述浓度芒果苷，同时设立正常细胞对照组、无血清组、200 μmol/L氯化钴组，培养12 h及24 h。④消化，收集细胞。⑤按试剂盒操作并流式细胞仪进行凋亡检测。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤保护的线粒体膜电位检测：①取第3代大鼠骨髓间充质干细胞，以5×10⁵/孔接种6孔板，CO₂培养箱中培养24 h。②芒果苷预保护：按浓度梯度加入芒果苷孵育2 h(浓度依次为20，40，80，160 μmol/L)。③弃培养基，用PBS清洗2次，加入含200 μmol/L氯化钴的无血清培养基，再次加入上述浓度芒果苷，同时设立正常细胞组、无血清组、200 μmol/L氯化钴组，培养12 h及24 h。④消化，收集细胞。⑤按试剂盒操作并流式细胞仪进行线粒体膜电位检测分析。

主要观察指标：①氯化钴对骨髓间充质干细胞缺氧损伤的细胞毒性。②芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤保护的MTT实验结果。③芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧保护的细胞凋亡检测结果。④芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤保护的线粒体膜电位检测结果。

统计学分析：由第一作者应用SPSS 15.0统计软件数据处理，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LCD法；若数据不符合正态分布，则采用秩和检验；P < 0.05为差异有显著性意义。实验结果均经重复3次。

全文链接：

讨论

骨髓间充质干细胞是存在骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞、神经元细胞及肝细胞等^[2-4]。李晓峰等^[1]应用全骨髓贴壁法获得了高纯度、增殖能力强、数量足的大鼠骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞移植已经证实有效地治疗心肌梗死、下肢缺血、急性肾功能衰竭和肝移植^[5-6]。然而，移植细胞的死亡限制了组织再生。移植入器官的干细胞死亡主要机制之一由缺血引起。有研究表明在移植骨髓间充质干细胞至缺血心肌4 d后，99%的细胞死亡^[7]。周美玲等^[8]发现低氧条件下预处理骨髓间充质干细胞能增强对心肌细胞凋亡的保护效应。

细胞缺氧损伤模型的建立对于研究细胞缺血损伤机制、缺血适应变化及药物缺氧保护机制等意义重大。目前，细胞缺氧模型一般有两类：物理性缺氧复氧模型和化学性细胞缺氧复氧模型。物理性缺氧复氧模型中常用方法有氮气饱和法、液体石蜡覆盖法、低糖培养法等多种方法^[9-11]。然而，使用物理性模型很难达到比较理想的缺氧模拟效果，其特异性不高，且操作相对复杂，费用较高，设备要求高，耗时较长。因此，不利于实验条件的精确调控。化学细胞缺氧模型最常见的是应用连二亚硫酸钠和氯化钴等造模方法^[12-13]。应用连二亚硫酸钠不易确定药物最佳作用浓度，缺氧时间不易控制，复氧后化学药物残留可对细胞有持续损伤作用。

文章以氯化钴构建大鼠骨髓间充质干细胞缺氧诱导模型，利用正常氧条件下，Co²⁺通过细胞内离子置换使亚铁螯合酶失活，抑制细胞氧化反应，从而达到模拟细胞缺氧的目的。氯化钴缺氧模型具有剂量准确可控、无特殊设备要求、易操作等优点，是一种比较好的化学缺氧诱导剂^[14]。缺氧，会引起细胞氧化应激反应，对细胞产生损害^[15]。应用抗氧化剂能清除自由基，减轻氧化应激带来的细胞损害^[16-17]。

抗氧化剂通常是还原剂，包括：①自由基吸收剂^[18-19]：如酚类抗氧化剂、维生素E、类胡萝卜素。②氧清除剂^[20]：如抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、异抗坏血酸和异抗坏血酸钠等。③金属离子螯合剂：枸橼酸、EDTA和磷酸衍生物^[21-22]。体内还有谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等酶，以及各种过氧化酶减轻氧化应激对机体的损伤^[23-25]。

芒果甙是一种四羟基吡啶的碳糖甙，属双苯吡酮类化合物。现代药理和临床研究证明，芒果甙以及含芒果甙植物提取物具有多方面生理和药理作用，如抗氧化、抗病毒、调节凋亡、抗炎症、抗癌、抗糖尿病等作用^[26-31]。Campos-Esparza等^[28]研究发现芒果苷对局部缺血的脑损伤模型神经具有保护作用，这些作用有助于显着减少谷氨酸诱导的神经元细胞凋亡。Pardo-Andreu等^[32]发现芒果苷对线粒体具有强抗氧化性。Satish Rao等^[33]研究证实芒果苷预处理增加了HepG2细胞存活，抑制氯化镉诱导的细胞凋亡。目前，芒果苷对缺氧损伤的细胞保护作用尚未见报道。

作者通过MTT细胞实验研究结果显示, 随着氯化钴作用时间和浓度的增加, 对大鼠骨髓间充质干细胞的抑制率逐渐增加，呈现一定的时间、剂量依赖性；芒果苷能减少氯化钴对大鼠骨髓间充质干细胞的抑制率，减少氯化钴对细胞的毒性作用，其保护结果有非常显著的统计学意义。

本实验通过流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤模型下的细胞凋亡率——Annexin V和碘化丙啶双染色，发现芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤具有保护作用，具有浓度依赖性；随着芒果苷浓度的增加，大鼠骨髓间充质干细胞在缺氧损伤模型下的凋亡率逐步减少，差异有非常显著性意义。通过流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤模型下线粒体膜电位凋亡结果，基本与Annexin V和碘化丙啶双染色凋亡率检测一致。说明氯化钴可通过细胞外及线粒体两个途径诱导凋亡。芒果苷也能对这两个通路进行调控，保护大鼠骨髓间充质干细胞，减少凋亡率。

实验结果提示，氯化钴能通过缺氧损伤模型诱发大鼠骨髓间充质干细胞凋亡。文章首次报道芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤诱发的凋亡具有保护作用，其保护机制通过细胞外和细胞内两个凋亡途径同时进行调控。芒果苷对细胞凋亡途径其他凋亡相关基因和蛋白表达的调控，还有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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芒果苷对缺氧损伤骨髓间充质干细胞凋亡的保护

Mangiferin protects bone marrow-derived mesenchymal stem cells against hypoxia-induced apoptosis

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