结直肠腺癌组织中CD44+/Oct4+癌干细胞的形态及分布

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (49): 8461-8467.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.001

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结直肠腺癌组织中CD44⁺/Oct4⁺癌干细胞的形态及分布

张登才^1，2，刘斌^1，2，3，张丽华⁴，张彩兰¹，杨艳丽¹，苏勤军¹，史敏¹，董亮¹，哈英娣¹

1解放军兰州军区兰州总医院病理科，甘肃省兰州市 730050
2兰州大学基础医学院病理学研究所，甘肃省兰州市 730000
3甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，甘肃省兰州市 730000
4兰州石化总医院病理科，甘肃省兰州市 730060

修回日期:2013-09-10 出版日期:2013-12-03 发布日期:2013-12-03
通讯作者: 刘斌，主任医师，教授，硕士生导师，解放军兰州军区兰州总医院病理科，甘肃省兰州市 730050 liumb@189.cn
作者简介:张登才★，男，1982年生，甘肃省古浪县人，汉族，兰州大学基础医学院病理与病理生理学专业在读硕士，医师，主要从事临床肿瘤病理研究。 zhdc137031544@gmail.com
基金资助:
甘肃省自然科学基金资助项目(096RJZA096)*

Morphology and distribution of CD44⁺/Oct4⁺ colorectal cancer stem cells

Zhang Deng-cai^{1, 2}, Liu Bin^{1, 2, 3}, Zhang Li-hua⁴, Zhang Cai-lan¹, Yang Yan-li¹, Su Qin-jun¹, Shi Min¹, Dong Liang¹, Ha Ying-di¹

1Department of Pathology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
2Institute of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
3Key Laboratory of Stem Cell and Gene Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
4Department of Pathology, General Hospital of Lanzhou Petrochemical Company, Lanzhou 730060, Gansu Province, China

Revised:2013-09-10 Online:2013-12-03 Published:2013-12-03
Contact: Liu Bin, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Pathology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; Institute of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Key Laboratory of Stem Cell and Gene Medicine, Lanzhou 730000, Gansu Province, China liumb@189.cn
About author:Zhang Deng-cai★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Pathology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; Institute of Pathology, College of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China zhdc137031544@gmail.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Gansu Province, No. 096RJZA096*

摘要/Abstract

摘要：

背景：越来越多的证据显示CD44可作为结直肠腺癌干细胞的一个特异性的标志物，近年发现胚胎干细胞转录因子Oct4在结直肠腺癌中有表达。
目的：观察CD44⁺/Oct4⁺细胞在原发性结直肠腺癌组织中的数量、位置及分布方式。
方法：取108例结直肠腺癌、18例癌旁正常肠黏膜组织及18例伴不典型增生的结直肠腺瘤标本制成48点共3块组织芯片，应用免疫组织化学双重染色和苏木精-伊红染色，定位CD44⁺/Oct4⁺肿瘤细胞，观察计数并在苏木精-伊红切片的对应位置上观察其形态特征。
结果与结论：免疫组织化学双重染色结果显示，癌旁正常肠黏膜中未见CD44⁺/Oct4⁺细胞，在伴不典型增生的腺瘤中可见极少量CD44⁺/Oct4⁺细胞，结直肠腺癌中可见到少量CD44⁺/Oct4⁺细胞。双阳性细胞主要分布在腺管样结构基底膜侧或共壁腺体的共壁侧，呈小灶状或散在点状分布；细胞呈卵圆形或立方状，胞浆稀少，胞核规则，均质深染，呈卵圆形或高柱状。其数量与结直肠癌分化程度呈负相关(r=-0.579，P < 0.01)，与肿瘤浸润深度有一定关联(r=0.236，P < 0.05)。结果提示CD44⁺/Oct4⁺细胞可能是结直肠腺癌干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 结直肠腺癌, 肿瘤干细胞, 腺瘤, CD44+/Oct4+, 组织芯片, 免疫组织化学双重染色, 省级基金, 干细胞图片文章图片

Abstract:

BACKGROUND: More and more studies employ CD44 as a specific marker of colorectal cancer stem cells. Oct4 is a transcription factor of embryonic stem cells, and it has been discovered recently that there is a higher expression in primary colorectal carcinoma.
OBJECTIVE: To investigate the quantity, location and distribution of CD44⁺/Oct4⁺ cells in primary colorectal carcinoma.
METHODS: A totally of 108 cases of human colorectal carcinoma and 18 cases of normal mucosa, 18 cases of adenoma were collected and made into three tissue microarrays, each containing of 48 dots. The locations of CD44⁺/Oct4⁺ cells were detected by double-label immunohistochemical staining and hematoxylin-eosin staining. The morphologic features of them were investigated on hematoxylin-eosin staining at the same position.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of double-label immunohistochemical staining demonstrated that there were no CD44⁺/Oct4⁺ cells in normal intestine mucosa and a very small amount of CD44⁺/Oct4⁺ cells in adenoma, and double-positive cells could also be seen in colorectal carcinoma. The number of CD44⁺/Oct4⁺ cells was rare and the cells were scattered or distributed focally along the basement of gland basal side. The cells with scarce cytoplasm were square, and its nucleus was oval or high cylindrical, deeply stained and homogeneous. The quantity of CD44⁺/Oct4⁺ cells was negatively correlated with the differentiation of colorectal cancer (r=-0.579, P < 0.01), and was associated with the depth of tumor invasion (r=0.236, P < 0.05). These findings indicate that CD44⁺/Oct4⁺ cells may be colorectal cancer stem cells.

全文链接：

Key words: stem cells, neoplastic stem cells, adenoma, antigens, CD44

中图分类号:

R394.2

张登才，刘斌，张丽华，张彩兰，杨艳丽，苏勤军，史敏，董亮，哈英娣 . 结直肠腺癌组织中CD44⁺/Oct4⁺癌干细胞的形态及分布[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8461-8467.

Zhang Deng-cai, Liu Bin, Zhang Li-hua, Zhang Cai-lan, Yang Yan-li, Su Qin-jun, Shi Min, Dong Liang, Ha Ying-di . Morphology and distribution of CD44⁺/Oct4⁺ colorectal cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8461-8467.

图/表（结果） 3

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引言

结直肠癌占肿瘤发病率的第4位，肿瘤相关疾病死亡率的第2位^[1]，对人类的健康和生命有着严重危害。传统治疗手段是通过手术、化疗、放疗等方法尽量去除已经存在的肿瘤细胞，但是经过根治性切除术和辅助化疗后仍有30%-50%的患者在两三年内复发^[2]。近年研究发现，肿瘤中存在具有自我更新特性的细胞亚群即肿瘤干细胞，是引发肿瘤并维持其生长的根源，并在肿瘤的复发、转移中起着决定性作用^[3-5]。但是，对肿瘤干细胞的分离鉴定尤其是实体瘤干细胞存在很多困难，目前多采用肿瘤细胞的表面生物学标记对其分离。

近几年陆续发现了CD133、CD24、CD44、CD166、ESA、Oct4、ALDH1等可作为结直肠癌肿瘤干细胞标志物^[6]，其中CD44是结直肠癌干细胞的一个重要且公认的表面标志^[7-11]。八聚体结合蛋4(Oct4)是维持干细胞多能性和自我更新的转录因子，是常见的胚胎干细胞表面标志。资料显示，胚胎干细胞自我更新主要在基因转录水平受到精细调控，Oct4被公认是人胚胎干细胞的核心调控基因之一^[12]。

最近研究发现Oct4在某些上皮性恶性肿瘤中呈现高表达，其中恶性肿瘤的发生、发展和预后与其表达的强度成高度正相关，其在维持细胞的自我更新与多潜能性中起着重要作用^[13]。但是到目前为止，结直肠肿瘤干细胞还缺乏特异性好、稳定性高、实用性强的单个或一组分选标志，而利用CD44联合Oct4标记结直肠腺癌干细胞尚无文献报道。

实验利用组织芯片及免疫组织化学、免疫组织化学双染技术，采用连续切片的方法，定位标记CD44⁺/Oct4⁺细胞，观察其在结直肠腺癌中分布、数量及形态，探讨其在癌旁正常黏膜及不同组织中的表达以及与结直肠癌病理分级、浸润程度的关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：利用组织芯片技术、免疫组织化学双染技术进行观察性实验。

时间及地点：实验于2013年2至5月在解放军兰州军区兰州总医院病理科完成。

材料：

结直肠腺癌组织观察CD44⁺/Oct4⁺癌干细胞的形态及分布实验用试剂：

病理标本：从解放军兰州军区兰州总医院病理科外检数据库中检索2008至2012年所有结直肠腺癌手术患者档案，按WHO病理分级标准，随机调取高、中、低分化结直肠腺癌石蜡包埋标本各36例，所有标本术前均未行放化疗。患者中男73例，女35例，年龄24-89岁，平均年龄60.93岁。其中53例伴淋巴结转移和/或远处转移。另取18例结直肠腺瘤(均伴不典型增生)和18例癌旁(距癌组织> 5 cm)正常肠黏膜组织作为对照组，对照组标本收集自解放军兰州军区兰州总医院病理科2011至2012年外检病例。所有外检标本24 h内取相应癌组织，经体积分数4%中性甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋。

实验方法：

手工制作组织芯片：调取所选病例组织蜡块及相应的苏木精-伊红染色病理切片，显微镜下观察切片，找到典型病变部位后低倍镜下用伊红作上标记。取20 mL普通注射器针头，磨平针尖，匹配16号骨髓穿刺针针芯在空白蜡块上手工打孔，然后根据苏木精-伊红切片上标记的典型病变部位，在供体蜡块相应位置穿刺出组织柱(直径约1.5 mm)放入空白蜡块上打好的孔中，记录组织编号。重复上述步骤即可按模板制成6×8阵列蜡块。共制作结直肠高、中、低分化腺癌微阵列蜡块3块，每个蜡块包含6排癌组织(36点)、1排腺瘤组织(6点)和1排癌旁正常黏膜组织(6点)。后续工作与常规组织切片基本相同，3 μm厚切片，苏木精-伊红染色可裱贴于普通载玻片上，用于免疫组织化学的蜡片应裱于经2% 3-氨丙基-乙氧基甲硅烷(APES)丙酮液处理过的载玻片上。微阵列蜡块应用新刀片在切片机上切片，在裱片时操作要轻，速度掌握适宜，否则容易离断或组织阵列偏移。另外，还要注意水温，水温过低切片展不开，过高易拉长，拉断，保持在48 ℃左右较合适。苏木精-伊红染色后复验所得组织芯片的每个位点，见图1，2(该组织芯片制作方法简便易行，具体方法另有论著已被《诊断病理学杂志》接受待刊)。

免疫组织化学及免疫组织化学双重染色步骤：3块组织芯片连续切片各4张(厚4 μm)，分别做苏木精-伊红染色、免疫组织化学及免疫组织化学双重染色。免疫组织化学S-P法分别标记CD44和Oct4，操作步骤按说明书进行，DAB显色，阳性显色为棕黄色，苏木精复染核，中性树脂胶封固。免疫组织化学双重染色步骤：依照说明书进行，EDTA修复液(pH=9.0)高压加热5 min修复抗原，先滴加Oct4抗体，BCIP/NBT(碱性磷酸酶)显色，阳性显色为蓝黑色，后滴加CD44抗体，AEC显色，阳性显色为红色，苏木精复染，水性封固剂封固。PBS代替第一抗体作阴性对照，阳性对照片由试剂公司提供。光学显微镜下观察结果。

染色结果判定原则及标准：①必须同时设对照染色，阳性对照相关抗体表达，阴性对照不表达，免疫组织化学染色结果才有可信度。②抗原表达必须在特定部位，不在抗原所在部位的阳性着色为非特异性染色。③避开出血坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达。

染色结果判断：CD44、Oct4分别表达于结直肠腺癌细胞的胞膜和胞核。免疫组织化学双染切片可见，CD44表达于细胞膜，呈红色，Oct4表达于细胞核呈蓝黑色。染色结果均由两位中级以上病理医师用盲法进行评估。

计数标准^[14]：组织芯片上每个点在40倍镜下查10个视野，每个视野在癌细胞丰富区域计数100个癌细胞(不够10个视野的位点每个视野计数200个癌细胞)，统计CD44⁺/Oct4⁺癌细胞数。阳性强度判定依CD44⁺/Oct4⁺癌细胞百分率半定量分析：未见双阳性细胞为(-)，双阳性细胞数<5%(+)，5%-15%(++)，>15%(+++)。

观察指标：分别在4倍、10倍、40倍物镜视野下观察组织芯片上每个点CD44⁺/Oct4⁺细胞数量、位置、分布方式。同时在苏木精-伊红染色切片上相应位点定位CD44⁺/Oct4⁺细胞并观察其形态特征。

主要观察指标：①不同组织中CD44⁺/Oct4⁺细胞的数量。②CD44⁺/Oct4⁺细胞的分布方式和位置。③苏木精-伊红染色观察结直肠腺癌组织中CD44⁺/Oct4⁺细胞的形态特征。

统计学分析：由第一作者采用IBM SPSS 20.0统计软件包处理，结直肠腺癌病理分级与CD44⁺/Oct4⁺细胞数量相关分析采用Spearman等级相关分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

自从Bonnet等^[15]首次确认了白血病干细胞的存在后，科学家们陆续从各种实体瘤(乳腺癌^[16]、中枢神经系统癌症^[17]、结肠癌^[18-19]、前列腺癌^[20]、胰腺癌^[21]、肝癌^[22])中发现了肿瘤干细胞的存在，进一步证实了肿瘤干细胞假说，为癌症的治疗方法提供了新的思路。肿瘤干细胞理论认为恶性肿瘤中存在一群数量较少的肿瘤干细胞^[23]，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性作用；而其余多数肿瘤细胞都是肿瘤干细胞异常增殖分化形成的子代细胞，仅具有有限的增殖及分化能力。现有治疗肿瘤的方法主要是针对肿瘤组织内的大多数细胞，而不是肿瘤干细胞。即使99.99%的肿瘤细胞被杀死，但只要有0.01% 的肿瘤干细胞存在，仍然会造成肿瘤的复发和转移。因此，肿瘤生物学研究的最新观点认为治疗肿瘤的关键在于治疗肿瘤干细胞，只有针对肿瘤干细胞的治疗才可能出现持久疗效，彻底清除肿瘤干细胞才有可能彻底治愈肿瘤。由此掀起了针对肿瘤干细胞靶向治疗的热潮。但是肿瘤干细胞靶向治疗的前提是找到特异性好、稳定性高、实用性强的单个或一组能够标记肿瘤干细胞的标记物。

近年陆续发现CD133、CD24、CD44、CD166、ESA、Oct4、ALDH1等有可能是结直肠癌干细胞的标记物。O’Brien等^[19]通过对NOD/SCID小鼠的研究发现，CD133⁺细胞具有致瘤性，从而证明CD133是结直肠癌干细胞的一个标志物。但是Du等^[24]利用慢病毒RNA干扰技术敲出结直肠癌细胞中的CD44、CD133基因后显示：仅CD44基因敲出能明显阻止癌细胞克隆形成以及抑制移植模型中细胞的致瘤性。该研究提示CD44在结直肠癌干细胞中具有很重要的功能意义。目前认为，CD44⁺细胞代表了CD133⁺细胞群中的小部分亚群细胞^[25]，即与CD133⁺结肠癌细胞比较，CD44⁺结肠癌细胞中更有效地富集了肿瘤干细胞。因此，越来越多的研究将CD44作为结直肠癌干细胞的一个特异性的标志物。

CD44作为一种细胞黏附分子，主要表达于上皮细胞、淋巴细胞及巨噬细胞，它能促进肿瘤细胞外基质的降解，刺激新生血管的生成，促进肿瘤细胞的侵袭转移^[26]。Oct4是与胚胎发育全能型相关的转录因子，只在全能和多能细胞中表达，正常组织不表达。它是由POU5f1编码的八基序相连转录因子，属于POU转录因子家族。Oct-4在鼠胚胎早期卵裂球、囊胚内细胞团、上胚层和原始生殖细胞以及畸胎瘤细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞内均有表达；在卵子或精子进入无丝分裂时，Oct-4表达缺失，提示其在维持细胞多能性中具有重要作用^[27]。大部分的胚胎干细胞系均表达高水平的Oct-4，Oct-4是鉴定人胚胎干细胞的重要标志。近年在一些研究中发现Oct4在消化道肿瘤，特别是结直肠腺癌中表达阳性率明显地高于正常组织和癌旁组织^[28-29]。因此Vaiopoulos等^[30]将Oct4也列为结直肠癌干细胞有价值的标志物之一。目前为止，结直肠肿瘤干细胞还缺乏特异性好、稳定性高、实用性强的单个或一组分选标志。而利用CD44联合Oct4标记结直肠腺癌干细胞的研究尚未见有文献报道。

本实验利用免疫组织化学双重染色法，选取结直肠癌干细胞表面标记物CD44和Oct4，标记CD44⁺/Oct4⁺肿瘤细胞。免疫组织化学双染结果显示CD44呈胞膜红色，Oct4呈胞核蓝黑色。正常肠黏膜中未见CD44⁺/Oct4⁺细胞，在伴不典型增生腺瘤中可见极少量CD44⁺/Oct4⁺细胞，结直肠腺癌中可见到双阳性的细胞，其数量非常少(0.1%-16.0%)。同时发现，其数量与结直肠癌病理分级呈负相关(r=0.579，P < 0.01)，与浸润深度有一定关联(r=0.236，P < 0.05)。这种细胞主要分布在腺管样结构基底膜侧或共壁腺体的共壁侧，呈小灶状或散在点状分布，核的形态较一致，呈卵圆形或高柱状，胞浆较少，处于较原始的状态，属于分化比较幼稚的细胞，其与肠黏膜隐窝底部正常干细胞形态较一致。通过观察结直肠高中分化腺癌中这种细胞的分布特征发现其与肠黏膜隐窝底部正常干细胞的分布特征相似。CD44⁺/Oct4⁺细胞多位于基底侧，与基底膜黏附的这种分布规律可能与结直肠癌干细胞的功能及生长方式有密切关系。

有理论认为，肿瘤干细胞有可能来源于正常干细胞突变。正常细胞在癌变的过程中需要经历多次突变才能成为癌细胞，对一个分化成熟的细胞而言，其生命周期有限，短期内积累多次突变形成癌细胞的概率很小，但是正常的干细胞因为具有不断自我更新的能力，其生命周期较长，这就有可能积累多次突变，更容易成为癌变发生的对象。

近年研究发现，正常干细胞和已经发现的肿瘤干细胞间有以下相似的特点^[31-32]：①具有自我更新能力。②能够产生大量分化细胞。③有些已经发现的肿瘤干细胞表面抗原标记在正常干细胞中也有表达。Shackleton等^[33]在乳腺癌小鼠模型中发现乳腺癌发展前正常干细胞出现扩增，暗示正常干细胞和肿瘤干细胞之间似乎具有某种联系。

正常干细胞和肿瘤干细胞不同之处在于：正常干细胞的功能发挥是有序的，受控的，这些细胞多处于静止状态(相当于细胞处于G₀/G₁期)，只有当外界出现某种信号刺激后，比如损伤，正常干细胞就会进入受调控的自我更新与分化过程中，维持相应组织、器官的更新与修复。这是一个动态平衡的过程。而肿瘤干细胞则不然，其自我更新与分化是无序的，失控的，其结果一方面产生了大量的肿瘤细胞，另一方面还能维持肿瘤的生长与异质性。

本课题早期研究发现CD44⁺肿瘤细胞大多处于活跃增殖期，只有少数处于G₀/G₁期，这些细胞更符合肿瘤干细胞特征^[34-35]。因此CD44单独作为结直肠癌干细胞标志物不能充分反应肿瘤干细胞特性，因此CD44联合胚胎干细胞表面标志Oct4鉴定结直肠肿瘤干细胞是值得探索的研究新方向。

理论上讲，这次实验所观察106例结直肠腺癌组织中都应该或多或少找到CD44⁺/Oct4⁺细胞，但是实际观察发现有12例未见双阳性细胞(高分化7例，中分化5例)，分析原因：①随着肿瘤细胞由低向高分化的过程中Oct4的表达强度迅速下降，这种趋势较CD44更为明显。②在实验过程中造成抗原丢失或未能充分暴露。③组织芯片中每个点获取的组织标本有限。虽然本实验中结直肠腺癌CD44⁺/Oct4⁺细胞从形态、数量、分布部位上适合作为肿瘤干细胞的标志，但是其在结直肠癌肿瘤细胞系中是否表达，形态、数量是否与实体瘤中相似，致瘤能力如何将是作者接下来研究的重点。

结直肠腺癌组织中CD44⁺/Oct4⁺癌干细胞的形态及分布

Morphology and distribution of CD44⁺/Oct4⁺ colorectal cancer stem cells

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结直肠腺癌组织中CD44+/Oct4+癌干细胞的形态及分布

Morphology and distribution of CD44+/Oct4+ colorectal cancer stem cells

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Morphology and distribution of CD44⁺/Oct4⁺ colorectal cancer stem cells