诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞转分化的miRNA

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.016

中国组织工程研究

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞转分化的miRNA

张成¹，章少中¹，张亚洲²，张国恒¹，王韵茹²，董红燕²，张中明¹

徐州医学院，1心血管病研究所，2徐州医学院生物学教研室、神经生物学研究中心实验室，江苏省徐州市 221002

修回日期:2013-08-16 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 通讯作者：董红燕，教授，徐州医学院生物学教研室、神经生物学研究中心实验室，江苏省徐州市 221002 dhyxzh163.@163.com 并列通讯作者：张中明，博士，教授，徐州医学院心血管病研究所，江苏省徐州市 221002 zhang_zmxz@163.com
作者简介:张成★，男，1984年生，山东省宁阳县人，汉族，2013年徐州医学院毕业，硕士，主要从事缺血性心脏病的研究。 zhangcheng19851204@163.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(31071307)*

MicroRNA-1 and microRNA-499 directly reprogram cardiac myofibroblasts into cardiomyocyte-like cells

Zhang Cheng¹, Zhang Shao-zhong¹, Zhang Ya-zhou², Zhang Guo-heng¹, Wang Yun-ru², Dong Hong-yan², Zhang Zhong-ming¹

1Institute of Cardiovascular Disease, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China; 2Department of Biology, Neurobiological Research Center Laboratory, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China

Revised:2013-08-16 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Dong Hong-yan, Professor, Department of Biology, Neurobiological Research Center Laboratory, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China dhyxzh163.@163.com Corresponding author: Zhang Zhong-ming, M.D., Professor, Institute of Cardiovascular Disease, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China zhang_zmxz@163.com
About author:Zhang Cheng★, Master, Institute of Cardiovascular Disease, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China zhangcheng19851204@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31071307*

摘要/Abstract

摘要：

背景：微小RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，miRNA参与调控基因表达，在促进前体细胞增殖与分化中发挥了重要的作用。miRNA是否可促进前体细胞向心肌细胞的分化则鲜见报道。
目的：验证转入特定miRNA(miRNA-1、miRNA-499)诱导新生小鼠心脏肌成纤维细胞转分化为心肌样细胞的可行性。
方法：体外培养新生小鼠心脏成纤维细胞，常氧培养传代至P2；37 ℃低氧(体积分数3%O2)培养48 h；免疫荧光染色检测心脏成纤维细胞特异性标记物波形蛋白的表达，免疫荧光染色、流式细胞技术检测心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维细胞表型转化的标记物α-平滑肌激动蛋白的表达。实验分为4组：miRNA-1转染组、miRNA-499转染组、miRNA-1/miRNA-499共转染组及空白对照组，采用miRNA芯片检测心脏肌成纤维细胞与心肌细胞中微小RNA的表达差异；real-time qPCR方法验证芯片检测结果。
结果与结论：心脏肌成纤维细胞中过表达miR-1、miR-499后，心脏发育不同阶段特异性因子发生不同程度的表达变化，与空白对照组相比，其余3组GATA4、Tbx5、Mef-2c、α-MHC表达明显增高，Mesp1、Isl1表达均无显著变化。结果表明，特定miRNAs可诱导心脏肌成纤维细胞表达心肌细胞特异性性标志物，具备诱导心脏肌成纤维细胞向心肌细胞直接转分化的潜力。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, miR-1, miR-499, 微小RNA, 心脏成纤维细胞, 心脏肌成纤维细胞, 转分化, 心肌细胞, 波形蛋白, α-平滑肌激动蛋白, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: MicroRNAs are a class of small non-coding RNA molecules. MicroRNA is involved in the regulation of gene expression, and plays an important role in promoting the proliferation and differentiation of precursor cells. Whether microRNAs can promote progenitor cells to differentiate into myocardial cells has been rarely reported.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of direct reprogramming of neonatal mouse cardiac myofibroblasts to cardiomyocyte-like cells by specific microRNAs (microRNA-1 and microRNA-499).
METHODS: Cardiac fibroblasts isolated from neonatal mice were cultured in vitro at 37 ℃ under normal oxygen, cells were used at the second passage for the following experiments, and then cultured at 37 ℃ in 3% O2 for 48 hours. Immuno?uorescent staining was used to detect expression of vimentin which is a specific marker for Cardiac fibroblasts. Immuno?uorescent staining and flow cytometry assay were employed to detect expression of α-smooth muscle actin which is a specific marker for cardiac myofibroblasts. There were four groups in the experiment: microRNA-1 group, microRNA-499 group, microRNA-1/microRNA-499 co-tranfection group, and blank control group. MicroRNA profile between cardiac myofibroblasts and myocardial cells was determined by microarray analysis via the miRCURYTM Array microarray kit. MicroRNA microarray results were validated by real-time quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: After overexpression of microRNA-1 and microRNA-499 in cardiac myofibroblasts, specific factors of heart development at different stages had different expressions; compared with the blank control group, the expression of GATA4, Tbx5, Mef-2c, α-MHC increased significantly in the remaining three groups, but Mesp1, Isl1 expression was not significantly changed). The results provide strong evidence for the capacity of microRNAs to induce expression of cardiomyocyte markers in cardiac myofibroblasts and demonstrate the potential of specific microRNAs that can direct reprogram cardiac myofibroblasts to cardiomyocytes in vitro.

Key words: stem cells, myocytes, cardiac, microRNAs, fibroblasts

中图分类号:

R394.2

张成，章少中，张亚洲，张国恒，王韵茹，董红燕，张中明. 诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞转分化的miRNA[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.016.

Zhang Cheng1, Zhang Shao-zhong, Zhang Ya-zhou, Zhang Guo-heng, Wang Yun-ru, Dong Hong-yan, Zhang Zhong-ming. MicroRNA-1 and microRNA-499 directly reprogram cardiac myofibroblasts into cardiomyocyte-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.016.

图/表（结果） 5

2.1 心脏肌成纤维细胞鉴定波形蛋白特异性表达于心脏成纤维细胞，免疫荧光染色观察波形蛋白表达，结果表明心脏成纤维细胞纯度为 97%，见图1。

心脏成纤维细胞常氧传代至P2代，37 ℃低氧(体积分数3%O2)培养48 h，免疫荧光双染色观察波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白，流式细胞技术检测α-平滑肌肌动蛋白表达量。结果显示，α-平滑肌肌动蛋白特异性表达于心脏肌成纤维细胞，心脏成纤维细胞转化为心脏肌成纤维细胞效率为96.8%，见图2。
琼脂糖电泳和A260/A280的比值测定结果显示，所得RNA样本浓度和纯度达到了miRNA芯片和反转录为cDNA和real-time qPCR的实验要求。miRNA芯片分析了心肌细胞与心脏肌成纤维细胞中miRNA的表达差异，结果表明，miR-1和miR-499在心肌细胞中高表达。real-time qPCR对芯片验证结果也显示，与心脏肌成纤维细胞相比，心肌细胞中miR-1和miR-499表达量显著增加(P < 0.05)，见图3，表2。
2.2 miR-1和miR-499转染心脏肌成纤维细胞的效率携带特定miRNA的慢病毒(MOI=40)转染心脏肌成纤维细胞，3 d后，荧光显微镜下可见细胞表达绿色荧光，细胞计数检测病毒转染成功率约为80%，见图4。
2.3 心脏肌成纤维细胞中过表达miR-1和miR-499对心肌细胞发育不同阶段特异性因子的影响 Real-time qPCR检测结果显示，心脏肌成纤维细胞中过表达miR-1和miR-499后，与对照组相比，单纯转染miR-1、miR-499和联合转染miR-1/miR-499后第7天，GATA4、Tbx5、Mef-2c表达明显增高，与转染第7天比较，转染第14天时，GATA4、Tbx5、Mef-2c表达进一步增高(P < 0.05)。与对照组相比，转染第7及14天，单纯转染miR-1、miR-499和联合转染miR-1/miR-499组Mesp1、Isl1表达均无显著变化(P > 0.05)。转染第7天，与对照组相比，单纯转染miR-1、miR-499和联合转染miR-1/miR-499组α-MHC表达显著增高，在第14天时，α-MHC表达进一步增高(P < 0.05)，cTnT在转染第14天开始增高。

单纯转染miRNA 与联合转染miRNAs各实验组之间相比，上述各心脏特异性因子表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

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引言

心肌梗死后，心肌细胞大量减少，成纤维细胞发生表型转化，转变为α-平滑肌肌动蛋白呈阳性的心脏肌成纤维细胞^[1-2]，研究显示，心脏肌成纤维细胞既能合成分泌胶原，又能产生收缩功能，具有成纤维细胞和平滑肌细胞的双重特征，在组织纤维化中起着核心作用。

心脏肌成纤维细胞被激活可导致胶原过度沉积和纤维化的进行性发展，虽然心脏局部成纤维细胞的肌成纤维化可改善心脏重塑，有利于组织修复，但过量心脏肌成纤维细胞增生，引起过多的胶原沉积并导致心肌僵硬度增加，舒张功能障碍^[3]。因此，不难理解，缺血性心脏病的主要病理基础，一是心肌梗死造成的心肌细胞大量缺失，成体心脏缺乏有效自体修复机制，二是梗死局部心脏肌成纤维细胞大量增殖、产生过量的胶原，导致心肌纤维化，引发心肌电传导异常、顺应性降低及负性心肌重塑。因此，如能将缺血心肌中心脏肌成纤维细胞直接转分化为功能性心肌细胞，可以在补充缺失的心肌细胞的同时有效地抑制心脏肌成纤维细胞过度增殖，可能成为缺血性心脏病的新治疗策略。

微小RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，长度为21-25 nt，广泛存在真核生物中，通过与目标mRNA配对，调控基因表达，参与生命一系列活动^[4-6]。miRNA 通过与靶基因3’-UTR 区(3-非翻译区)发生完全或非完全的互补结合，引起靶基因的 mRNA 直接降解或转录后翻译抑制，对基因表达发挥负性调节作用^[7-8]。

近来研究发现，特定miRNAs对心脏细胞的增殖与分化发挥了很重要的作用，在脊椎动物胚胎发育中，miR-1直接调节Notch配体表达来抑制Notch信号通路，进而促进前体细胞向心肌细胞的分化^[9]。过表达miR-1转录后抑制靶基因Hand2表达使心脏祖细胞较早的退出细胞周期，抑制细胞增殖，促进分化进程^[10]。研究还发现，miR-499也与人类胚胎干细胞向心肌细胞分化密切相关，上调 miR-499的表达可促进胚胎细胞心脏特异性转录因子Mef-2c的表达^[11]。联合应用miR-1和miR-499可促进心脏祖细胞分化，miR-1抑制HDAC4而促进细胞分化，miR-499通过抑制Sox6而促进心脏祖细胞向心肌细胞分化^[12]。然而，迄今为止，miR-1和miR-499是否具有诱导成体细胞转分化的作用则鲜见报道。

实验通过在心脏肌成纤维细胞中过表达miR-1和 miR-499，观察心肌细胞发育不同阶段特异性细胞因子表达的变化，初步探讨miR-1和miR-499诱导心脏肌成纤维细胞向心肌细胞转分化中的作用。

材料方法

设计：病毒包装，细胞实验。

时间及地点：于2012-05-01在徐州医学院神经生物学实验室完成。

材料：

miRNA-1和miRNA-499诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞直接转分化实验试剂及仪器：

实验动物：健康C57小鼠，鼠龄1-3 d，由徐州医学院实验动物中心提供。许可证号：SCXK(苏)2010- 0003，使用许可证号：SYXK(苏)2010-0011。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

实验方法：

细胞培养与鉴定：新生1-3 d C57小鼠，雌雄不拘，乙醚吸入麻醉，无菌取心脏，将左心室剪碎，2.5 g/L胰酶0.6 g/L胶原酶反复消化，离心；收集细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中，采用差速贴壁法培养90 min，倾去上清液，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM继续培养，待细胞生长融合至80%，免疫组织化学鉴定心脏成纤维细胞特异性标志物波形蛋白。简言之，40 g/L多聚甲醛固定10 min，0.1%Triton X-100透膜15 min，4% BSA封闭，然后加入波形蛋白一抗(1∶200)，4 ℃冰箱中过夜；最后加入1∶200的波形蛋白二抗，37 ℃放置3 h后，荧光显微镜下观察。

心脏成纤维细胞常氧培养传代至P2，37 ℃低氧(体积分数3%O₂)培养48 h，采用免疫组织化学(方法同上)鉴定心脏肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白，流式细胞技术检测α-平滑肌肌动蛋白表达。

miRNAs芯片分析：胰酶消化收集心脏肌成纤维细胞，淋巴细胞分离液纯化心肌细胞，严格按照Trizol reagent 说明书进行总RNA提取，采用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳对提取总RNA进行浓度和纯度的质控。运用高通量miRCURY核酸微阵列技术对两样本进行分析。real-time qPCR对芯片结果进行验证。

取500 ng反转录成cDNA作为PCR的模板，实验重复3次，以公式2^-^△△^CT计算目的基因相对与内参基因的相对表达量。引物序列U6上游引物F：5’GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T3 ，下游引物R：5’CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT3’； mmu-miR-1a-3p上游引物F：5’GGG TGG AAT GTA AAG AAG T3’，下引物游R：5’TGC GTG TCG TGG AGT C3’；mmu-miR-499-3p上游引物GSP：5’GGG AAC ATC ACA GCA AGT C3’，下游引物R：5’CAG TGC GTG TCG TGG A3’。

miR-1和miR-499的合成与转染：根据Mirbase公布的小鼠mmu-mir-1a-1(MI0000139)，mmu-mir-499 (MI0004676)序列包装病毒，进行下游实验，过表达miRNAs转染效率可由主动表达GFP绿色荧光蛋白表达来测定。

心脏肌成纤维细胞接种于24孔板中，接种前细胞计数，在细胞融合度达30%-50%时以MOI值40加入慢病毒，同时加入Polybrene(一种阳离子聚合物，协助慢病毒对细胞的转染过程)和Enhanced Infection Solution (ENi.S.)。37 ℃、体积分数3%O₂培养12 h，更换完全培养基，以后每天更换新鲜培养基。倒置显微镜下观察细胞生长状况，荧光显微镜下观察细胞转染状况，病毒转染细胞成功显示绿色荧光。

实验共分4组：①miRNA-1转染组。②miRNA-499转染组。③miRNA-1/miRNA-499共转染组。④空白对照组(不携带特定miRNA的空载体病毒)。

引物序列：mmu-miR-1a-3p上游引物F：5’CGG CCG CGA CTC TAG GAG ACT GAG ACA CAG GCG AC3’，下游引物R：5’ATA AGC TTG ATA TCG CTG CCG GTC CAT CGG TCC AT 3’；mmu-miR-499-3p上游引物F：5’CGG CCG CGA CTC TAG AAG ACT GCC ACG CCC CCT AC3’，下游引物R：5’ATA AGC TTG ATA TCG CCC ACC CCA AAC ACC ACC TAA3。

Real-time quantitative PCR检测心肌细胞特异性因子表达：严格按照Trizol reagent说明书提取上述各实验组总RNA，分光光度法测定提取RNA的浓度和纯度，然后反转录成cDNA。再取500 ng cDNA，混匀，5 000 r/min短暂离心1 min，配置的PCR反应溶液置于Real-time PCR仪上进行PCR反应，95 ℃、5 min；40个PCR循环(95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，20 s)。各样品的目的基因和内参(GAPDH)分别进行Real-time PCR反应。数据采用2 ^-^△△^CT法进行分析。PCR引物见表1。

主要观察指标：①波形蛋白及α-平滑肌肌动蛋白表达情况。②心脏肌成纤维细胞与心肌细胞中miRNA的表达差异。③心脏肌成纤维细胞感染病毒后Isl1、Mesp1、Tbx5、Mef-2c、Gata4、α-MHC及cTnT的表达情况。

统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件分析，数据均采用x(_)±s表示。各组间均数比较采用单因素方差分析检验，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

讨论

心肌梗死后，功能性心肌细胞的显著减少，坏死的心肌细胞逐渐被纤维组织替代，心室扩张、心肌间质纤维化，致使心脏的收缩/或舒张功能受损，并最终导致心力衰竭。倘若能将梗死区心脏肌成纤维细胞转化为心肌细胞，一方面抑制了成纤维细胞的过度增殖，减少了瘢痕的生成，另一方面增加了心肌细胞数量，此对于改善缺血心肌功能具有良好的应用前景。

在细胞发育、血管发生、肿瘤发生发展和干细胞增殖分化过程中，microRNA重要的调控作用不断被发现，此为细胞分化的调控研究带来了新的契机^[13-16]。miRNA的表达具有严格的时效性和组织特异性。研究显示，心血管系统有其特异的miRNA表达谱，例如，大鼠心脏和颈动脉 miRNA表达有所不同，在心脏中主要以 miR-1、let-7、miR-126、miR-133、miR-26a、miR-23和 miR-30c 为主，而颈动脉则以 miR-145、let-7、miR-125b、miR-125a、miR-23和 miR-143为主^[17-18]。上述研究表明，miRNA 在不同组织中可能发挥不同的生理功能。此外，miRNA 的表达也具有显著的时相性。在胚胎干细胞分化过程中，miRNA 的表达亦发生改变^[19]。因此，明确 miRNA 在心血管系统表达的组织与时间特异性是揭示其生理功能与病理作用的重要基础。

最近的研究表明，多种miRNA在心脏表达，其中部分特异表达于肌组织，包括miR-1和miR-133^[20-21]。miRNA-1家族是一类最发达的保守miRNA，包括miRNA-1-1、miRNA-1-2和miRNA-206。miRNA-133家族由miRNA-133a-1、miRNA-133a-2及miRNA-133b所组成，它们共同受到肌源性转录因子，如血清应答因子、肌细胞增强因子2和生肌决定因子调节^[22]。miR-1和miR-133是一对高度保守的特异表达于肌组织的miRNA。在胚胎干细胞命运决定早期，在干细胞向心肌前体细胞分化过程中，miR-1和miR-133发挥了相反的作用^[23]。miR-1促进干细胞向心肌前体细胞分化，而miR-133则抑制该分化过程。miR-1对干细胞向心肌前体细胞分化的促进作用可能是部分地通过抑制靶基因Dll-1的表达而实现的。在调控心肌细胞的增殖和分化过程中，miR-1与miR-133相互协调。目前的研究已发现，有13个miRNA参与了心肌肥厚发生和发展的调节，它们是miR-1、miR-133、miR-150、miR-1181b、miR-208、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-195、miR-214、miR-21、miR-129和miR-212。其中，miR-1、miR-133、miR-150和miR-1181b对心肌肥厚具有抑制作用，而miR-21对心肌肥厚的作用目前尚存在争议^[24-27]。上述大量的研究表明，miRNA在各个方面都发挥了重要的调控功能，深入全面的阐明miRNA的作用，有助于拓展对心血管疾病发生发展的认知。

在本实验中，采用高通量miRNA芯片分析了心脏肌成纤维细胞与心肌细胞中miRNA的表达差异。结果发现，与心脏肌成纤维细胞相比，心肌细胞miR-1和miR-499表达显著增加，Real-time qPCR检测结果进一步证实了上述结果。心脏肌成纤维细胞与心肌细胞中miRNA的差异表达为筛选靶miRNAs提供了实验依据。

在心肌细胞发育过程中，早期心肌细胞特异性因子Gata4、Tbx5、Mef-2c发挥了关键的作用。GATA4是具有锌指结构的转录因子，参与调控谱系提交后的心肌分化过程和原始心血管的形成。Tbx5初始表达于线性心血管，而后局限表达于心房和左心室，在心内膜与心肌发育过程中，Tbx5与GATA-4，-6发挥了协同作用^[28]。Mef-2c可激活心脏结构基因参与早期心脏及血管的形成和心室肌的分化。

在这次实验中，单纯转染miR-1、miR-499及miR-499/miR-1联合转染条件下，转染后第7天，与对照组相比，单纯转染miR-1、miR-499组及miR-499/miR-1联合转染组GATA4、Tbx5、Mef-2c表达明显增高，在第14天时，其表达进一步增高，表明本实验备选miRNAs具有诱导心脏肌成纤维细胞表达心肌细胞特异性性标志物的能力。实验还发现，单纯miR-1、miR-499转染后第7天，心肌细胞发育晚期特异性标志物α-MHC表达明显增高，转染第14天时，α-MHC表达进一步增高。实验也显示，miR-1、miR-499转染后第14天，成熟心肌细胞特异性标志物cTnT表达呈上调趋势，表明转分化细胞尚处在幼稚心肌样细胞阶段。

Isl1是心脏祖细胞转录因子，Mesp1是心脏中胚层转录因子，Mesp1的表达可进一步诱导Nkx2.5等心脏祖细胞基因的表达。实验结果显示，在miRNA转染的各时间点，各实验组均未见Mesp1 和Isl1表达的变化，该结果表明，miR-1、miR-499诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞转分化并非经由心脏祖细胞阶段，而是心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞直接转分化而来。实验发现，单纯转染与联合转染miRNA，对于诱导心脏肌成纤维细胞向心肌细胞方向转分化并无显著差异，这可能由于miRNA 的调控关系复杂，后续研究还有待于进一步深入。

实验结果证实，在核酸水平，miR-1和miR-499转染心脏肌成纤维细胞可诱导其表达心脏发育不同阶段特异性细胞因子，miR-1和miR-499具备诱导心脏肌成纤维细胞向心肌细胞方向直接转分化的潜能。然而，在蛋白水平及细胞形态等方面，尚无miR-1/miR-499诱导心脏肌成纤维细胞向心肌细胞方向转分化的证据。因此，miRNAs诱导心脏肌成纤维细胞直接转分化为成熟的、具备完全功能性心肌细胞的作用和详细机制还有待于进一步深入研究阐明。

诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞转分化的miRNA

MicroRNA-1 and microRNA-499 directly reprogram cardiac myofibroblasts into cardiomyocyte-like cells

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