Accutase酶在精原干细胞原代分离中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.013

中国组织工程研究

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Accutase酶在精原干细胞原代分离中的应用

刘珊珊，徐丽萍，朱蔚云，马宁芳

广州医科大学基础学院组织学与胚胎学教研室，广东省广州市 510182

修回日期:2013-08-19 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 马宁芳，博士，教授，广州医科大学组织学与胚胎学教研室，广东省广州市 510182 maningfang@yahoo.com.cn
作者简介:刘珊珊★，女，1987年生，河南省平顶山市人，汉族，广州医科大学在读硕士，主要从事细胞分化研究。gyliushanshan@163.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81170623)*

Application of Accutase enzymes in the separation of spermatogonial stem cells

Liu Shan-shan, Xu Li-ping, Zhu Wei-yun, Ma Ning-fang

Department of Histology and Embryology, Basic School of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China

Revised:2013-08-19 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Ma Ning-fang, M.D., Professor, Department of Histology and Embryology, Basic School of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China maningfang@yahoo.com.cn
About author:Liu Shan-shan★, Studying for master’s degree, Department of Histology and Embryology, Basic School of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China gyliushanshan@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81170623*

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究报道胰酶消化在一定程度上会破坏精原干细胞表面抗原并影响细胞活性，对后续的细胞分选及下游实验有一定影响。Accutae酶具有蛋白酶和胶原酶的双重活性，在消化结束时无需终止和清洗，有保护细胞表面抗原的特殊作用，因而被应用于多种干细胞的培养及消化传代中。
目的：比较Accutase酶和胰酶在原代消化分离睾丸组织获取精原干细胞中的作用。
方法：新生5-7 d昆明雄鼠45只，取双侧睾丸胶原酶初步消化，混悬液定容后分为Accutase酶组、胰酶组、混合酶组(透明质酸酶+胰酶组)，不同组别小鼠睾丸组织分别于酶消化1，3，5 min后显微镜下观察并拍照，比较各组不同时间点的消化状态及形成单细胞所需的时间；获取单细胞悬液后分别计算单位体积内所得细胞总数及死亡率；通过差速贴壁方法去除间质细胞及支持细胞，经包被有干细胞标志分子CD90.2的免疫磁珠进行分选，将所得CD90+及CD90-细胞用精原干细胞表面标志分子——胶质细胞源性神经营养因子受体α1标记，流式细胞仪检测不同组别CD90+及CD90-细胞群中胶质细胞源性神经营养因子受体α1精原干细胞的阳性率。
结果与结论：不同类别的消化酶对小鼠睾丸的消化作用有明显差异，其中 Accutase酶能更快获取单细胞悬液，其细胞团及破膜细胞明显少于胰酶组和混合酶组，其所得细胞总数高于其余2组，而细胞死亡率则低于其余2组。差速贴壁后细胞免疫磁珠分选结果显示Accutase酶组CD90+精原干细胞得率高，流式分选结果显示胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90+细胞为72.24%，高于胰酶组及混合酶组(51.16%，71.27%)；而胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90-细胞比率(15.03%)则低于胰酶组及混合酶组(18.8%，24.23%)。结果表明Accutase酶在分离和获取精原干细胞实验中效果优于胰酶。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 新生鼠睾丸, 精原干细胞, Accutase酶, 胰酶, 透明质酸酶, 磁珠分选, 流式细胞分选, CD90.2, 胶质细胞源性神经营养因子受体α1, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: It is reported that the cell surface antigen may be damaged by the trypsin enzyme in some extent and the cell activity may also be influenced, as a result of which, the subsequent separation and follow-up-test will be affected. Accutase enzymes possess the activities of protease and collagen enzyme and need no special termination or cleaning at the end of digestion. Another special function of accutase enzyme is to protect cell surface antigen and thus it has been widely applied in the stem cell digestion and culture.
OBJECTIVE: To compare the digestive effect of accutase enzymes and trypsin enzyme in the separation and original culture of spermatogonial stem cells.
METHODS: The testes of 5-7 days male Kunming mice (n=45) were collected and primarily digested with collagenas. The suspension of digested tissue was divided into three parts with the same volume named accutases enzyme group, trypsin enzyme group and mixed enzyme group (trypsin enzyme and hyaluronidase). For the comparison of testis digestive status and the time required for the formation of single cells, the micrographs were taken at 1, 3 and 5 minutes respectively after enzyme digestion. The total number and the mortality of the single cells were estimated and compared. The leydig cells and sertoli cells were removed by differential adherent method and the remained spermatogenic cells were then treated with CD90.2 immune magnetic beads. The selected spermatogonial stem cells were subsequently labeled by glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha-1 and sorted with flow cytometry. The number of spermatogonial stem cells positive for glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha-1 in CD90.2+ and CD90.2- cells was compared within different groups.
RESULTS AND CONCLUSION: The digestive capacities of different enzyme were different. Accutases enzyme obtained the single cell suspension more quickly than trypsin enzyme and mixed enzyme, and had the least cell masses and broken cell membrane than the other two groups. After the differential attached treatment, the highest total number of CD90+ spermatogonial stem cells and lowest cell mortality could be found in the accutases group, when compared with the other groups. The results of cell sorting by flow cytometry showed a higher rate (72.24%) of GFRα1+/ CD90+ cells in the accutases group than the trypsin group (51.16%) and mixed enzyme group (71.27%). The GFRα1+/CD90- number in the accutases group was lower (15.03%) than that of the trypsin group (18.8%) and mixed enzyme group (24.23%), respectively. The results indicate a better effect of accutases enzyme on the primary separation of spermatogonial stem cells than that of trypsin or mixed enzyme.

Key words: stem cells, spermatogonia, trypsin, hyaluronoglucosaminidase, flow cytometry

中图分类号:

R394.2

刘珊珊，徐丽萍，朱蔚云，马宁芳. Accutase酶在精原干细胞原代分离中的应用[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.013.

Liu Shan-shan, Xu Li-ping, Zhu Wei-yun, Ma Ning-fang. Application of Accutase enzymes in the separation of spermatogonial stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.013.

图/表（结果） 5

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年9月至2013年2月在广州医学院组织胚胎学实验室完成。

材料：

实验动物：取健康新生5-7 d龄昆明雄鼠45只，清洁级，由广东省实验动物中心提供，许可证号：SCXK粤2008- 0002。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

Accutase酶在精原干细胞原代分离中应用实验的主要试剂及仪器：

方法：

新生鼠睾丸组织的获取及初步消化：取新生5-7 d龄昆明雄鼠45只，随机分为3组，用乙醚吸入麻醉后放入体积分数75%乙醇浸泡消毒15 min，无菌取出双侧睾丸放入含1%双抗的PBS中，眼科显微剪分离睾丸周围组织去除白膜，睾丸组织加入9 mL的1.5 g/L胶原酶溶液，置于37 ℃恒温水浴摇床5 min，轻柔吹打混匀消化松散的曲细精管组织，加入等体积的PBS重悬，800×g 3 min离心，去除上清后再用PBS洗涤离心2次后待用^[9-10]。

获取获取单细胞悬液的二次消化的消化：随机将上述胶原酶初步消化后的组织混悬液分为3组，第1组离心管内加入胰酶(0.25%)，第2组加入混合酶(0.25%胰酶+ 1.5 g/L透明质酸酶)，第3组为Accutase酶(1×)，各组消化酶溶液总量均为5 mL，置于37 ℃恒温摇床，分别于消化后1，3，5 min在镜下拍照，各组酶消化5 min后胰酶组及混合酶组分别加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM终止消化反应，Accutase酶组仅加入相同体积DMEM(此酶无需血清终止消化)。将上述消化好的细胞悬液过400目筛网后离心，各加入5 mL的完全培养基重悬后待用。

锥虫蓝染色及细胞计数：将10 μL细胞悬液中加入 10 μL 0.2%锥虫蓝溶液混匀，计数细胞数及染成淡蓝色的死细胞数，分别算出不同组别细胞死亡率。

细胞死亡率=死细胞总数/总细胞数×100%

差速贴壁分离法^[11-12]：睾丸中的支持细胞较精原干细胞贴壁早，使用多次差速贴壁法可有效去除支持细胞。将计数后的细胞悬液接种于10 mm培养皿中，4 h后将未贴壁的细胞轻轻吸出接种至新培养皿中孵育12 h后再次收集未贴壁细胞过400目滤网，所获细胞即为精原细胞。

磁珠孵育、分选及流式检测：计数收集的细胞，每1×10⁷个细胞加包被有CD90.2的磁珠15 μL和PBS 90 μL， 4 ℃冰箱孵育15 min，加PBS洗涤后过分选柱，分别收集CD90⁺细胞和CD90^-细胞。用精原干细胞表面标志分子——胶质细胞源性神经营养因子受体α1单克隆抗体分别标记这2种细胞，4 ℃冰箱孵育过夜后加FITC标记的二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS重悬后流式细胞仪检测。

主要观察指标：各组细胞在不同时间点的消化状态、分选所得细胞总数及细胞死亡率。

统计学分析：由刘珊珊采用SPSS 13.0软件进行统计分析，各组细胞数比较采用独立样本单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验，3组死亡率比较采用独立样本的卡方检验，检测水准α=0.05。

讨论

随着精原干细胞诱导形成的类胚胎干细胞的出现，使得精原干细胞潜在多能性得到了更深刻的认识，故精原干细胞自我更新及分化调控机制逐步成为再生医学的研究热点^[13-14]。精原干细胞的体外获取与培养体系的建立则成为后续实验的关键一步。精原干细胞在睾丸中数量极少，在成年小鼠睾丸细胞中仅占0.03%^[15]，而新生小鼠睾丸细胞种类单一，因而常被用于获取精原干细胞的原代培养中^[1]。此期的精原干细胞未分化为精原细胞，曲细精管中仅由精原干细胞和支持细胞组成，故使用此阶段的小鼠能明显简化分选步骤，从而提高分选后精原干细胞的纯度。据文献报道，睾丸中的支持细胞较精原干细胞贴壁早，使用多次差速贴壁法能有效去除大多数的支持细胞^[16-17]。

实验首先采用2次差速贴壁法纯化精原干细胞，再使用包被有精原干细胞表面抗原的免疫磁珠分选，进一步提高精原干细胞的纯度，为后续研究其相关基因的调控提供更为可靠的细胞来源。

根据文献报道原代精原干细胞培养中多用胶原酶及胰酶进行组织消化，然而，因温度控制、消化时间的把握度和实验者的操作手法差异等因素使各研究报道中的细胞得率及活率有较大差别。研究发现胚胎干细胞经胰酶消化、传数代后其染色组的完整性破坏，多能性基因表达出现差异，细胞表面某些抗原遭破坏致使其与特定生长因子的结合受到影响，由此可造成基因表达及信号传递的不确定性、实验的不稳定性。在对间充质细胞的研究中发现胰酶由于所致的细胞表面抗原的破坏使得流式细胞仪检测结果出现误差^[6,18-21]。

Accutase酶是分离神经干细胞常用的一种消化酶，兼备胶原酶和蛋白酶的活性，Bajpai等^[22-23]研究发现，在消化胚胎干细胞克隆团时，和胰酶相比Accutase酶更能使克隆团成为单细胞状态并保留其多能性，且不会影响传代后细胞的增殖率。Humason等^[24-25]则在研究骨髓间充质干细胞的过程中用Accutase及其他各类消化酶对克隆团进行分离效果比较，优化适宜的实验方法为其后续成脂分化及多能性研究打下基础。

实验将Accutase酶用于睾丸组织消化及细胞分离中，旨在改良及尝试最佳的精原干细胞分离方法。在各组酶的消化过程中作者采用显微镜实时拍摄，及时跟踪细胞团块消化状态，结果显示Accutase酶比胰酶消化获得单细胞的时间短，Accutase酶组无明显成团现象及破膜现象，消化结束后所得细胞的状态及折光性的差异提示Accutase酶在细胞消化过程中有良好效果，其总细胞得率及细胞死亡率与其他2组相比均呈现出优势。

2004年Kubota等^[26-28]成功建立大鼠和小鼠精原干细胞培养体系，并以Thy-1(CD90)为标记通过免疫磁珠法富集得到纯度较高的精原干细胞，该实验验证了CD90作为精原干细胞特异性表面标记分子用于分选精原干细胞的可行性^[29-31]。CD90作为一种细胞表面糖蛋白黏附分子，能够参与细胞内部的活化及信号转导，干细胞的增殖与分化也与其有一定的相关性^[32]。常作为胸腺细胞，B细胞，神经元细胞，造血干细胞的表面标记。而精原干细胞和造血干细胞表面CD90表达模式较为相似，均表达在未分化的干细胞表面，和其他信号分子共同来维持细胞的未分化状态^[33-34]。5-7 d龄新生小鼠睾丸曲精小管内主要为精原细胞和支持细胞，故作者选取该时间段新生小鼠进行实验，从而简化了分离及分选步骤。

实验将不同组别差速贴壁法分选后的单细胞悬液用包被了CD90抗体的免疫磁珠来标记，分选后的CD90⁺细胞群即特异性的精原干细胞群。为了比较和验证各组酶作用后免疫磁珠分选所得精原干细胞的比率，作者用胶质细胞源性神经营养因子受体α1抗体进一步标记各组CD90⁺细胞群和CD90^-细胞群，流式细胞仪检测，以胶质细胞源性神经营养因子受体α1阳性率作为磁珠分选后的判断指标来检测精原干细胞的纯度。胶质细胞源性神经营养因子是一种多功能神经营养因子，调节精原干细胞增殖与分化的关键因子。研究显示，高剂量的胶质细胞源性神经营养因子能促进精原干细胞自我更新，同时抑制其分化，与该调控网络相关的基因达 1 100多种^[35-36]。胶质细胞源性神经营养因子受体α1是胶质细胞源性神经营养因子的受体，主要表达在未分化的精原细胞上，尤其是对精原干细胞的自我更新与分化起到至关重要的调控作用^{[17, 37-39]}，是目前公认的生殖干细胞的表面标记分子。胶质细胞源性神经营养因子在胶质细胞源性神经营养因子受体α1存在的情况下通过激活酪氨酸激酶来发挥作用^[40]，故与调控机制密切相关的一些细胞表面抗原的完整性对干细胞的生长及增殖起着至关重要的作用。流式细胞检测结果显示Accutase酶组胶质细胞源性神经营养因子受体α1⁺细胞得率高于胰酶组及混合酶组，CD90^-细胞群中胶质细胞源性神经营养因子受体α1⁺细胞得率也明显低于此2组，表明Accutase酶作用更为温和，能够保证细胞表面抗原的完整性，从而能提高消化后细胞的存活率和得率，通过后续的分选能够使得到的阳性细胞群中胶质细胞源性神经营养因子受体α1⁺细胞更为丰富，在培养体系中外源添加胶质细胞源性神经营养因子的情况下，而不同组别间形成精原干细胞克隆的能力及移植后的精子生成过程恢复的情况的差异则是下一步研究的内容。

实验使用精原干细胞表面标记CD90、胶质细胞源性神经营养因子受体α1来评价Accutase酶和胰酶对细胞表面抗原的影响，从而直接反映精原干细胞的分选效率，在原代获取精原干细胞时该方法能够减少对细胞的不利影响，从而为后续的基因调控研究提供了保障。经研究证实，精原干细胞在一定条件下能够去分化形成多功能干细胞，而Accutase酶作用下的精原干细胞再进一步诱导为多功能干细胞及其多次传代消化过程中细胞表型与其基因型的变化之间的联系，以及后续在动物体内移植实验中的效果和胰酶的差异有待进一步的实验验证。

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