碱性成纤维细胞生长因子基因转染优化脐带间充质干细胞的培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前多采取重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染的方法，将外源性碱性成纤维细胞生长因子基因转入脐带间充质干细胞内并持续表达，调控细胞增殖及定向分化，取得高效持久的治疗作用。
目的：了解采用重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染对体外培养的脐带间充质干细胞增殖及细胞周期的影响。
方法：体外培养脐带间充质干细胞，经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染，分为对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。用RT-PCR，Western blot检测脐带间充质干细胞在转染前后碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、CCK-8观察细胞生长的优化作用，采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。
结果与结论：转染碱性成纤维细胞生长因子后，转染组与对照组、空载病毒组相比碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白水平均有表达，细胞的生长速度明显增快，细胞周期G0/G1期减少，S期细胞数增多，各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。说明，通过重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染能促进体外培养的脐带间充质干细胞增殖，对其培养有优化作用。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带, 间充质干细胞, 碱性成纤维细胞生长因子, 基因转染, 腺病毒, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: At present, exogenous basic fibroblast growth factor gene can be transfected into umbilical cord mesenchymal stem cells via a recombinant adeno-associated virus vector and exhibit sustained expression in transfected cells. This method can regulate cell proliferation and directed differentiation to obtain efficient long-lasting therapeutic effects.
OBJECTIVE: To investigate the effects of basic fibroblast growth factor gene transfection via a recombinant adeno-associated virus vector on the proliferation and cell cycle of human umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in vitro.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured by the suspension culture in vitro, and were transfected by recombinant adeno-associated virus-mediated basic fibroblast growth factor gene. Cultured cells were divided into three groups: control group, basic fibroblast growth factor group, and recombinant adeno-associated virus group. Reverse transcription-PCR and western blot were used to assess the knockdown efficiency. Cellular proliferation was determined by cell growth curve and Cell Counting Kit-8 assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the other two groups, the expression of basic fibroblast growth factor mRNA and protein increased significantly, the cell growth speed was also significantly increased, the cell cycle of G0/G1 phase was decreased and cell number in S phase was increased in the basic fibroblast growth factor group after transfection. These findings suggest that the recombinant adeno-associated virus-mediated basic fibroblast growth factor gene can promote the proliferation of umbilical cord mesenchymal stem cells proliferation cultured in vitro, and also can optimize the cell culture.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, umbilical cord, fibroblast growth factors, genes, adenoviruses, human, cell proliferation

中图分类号:

R394.2

郑颖娟，田建昌 . 碱性成纤维细胞生长因子基因转染优化脐带间充质干细胞的培养[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.010.

Zheng Ying-juan, Tian Jian-chang . Effects of basic fibroblast growth factor gene transfection on the proliferation of umbilical cord mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.010.

图/表（结果） 5

2.1 细胞形态观察培养四五天后，贴壁细胞明显增多，细胞为长梭形或多角形，并可见有丝分裂，部分细胞克隆呈集落状生长，形态呈单一的长梭形，胞体中央膨大，培养八九天，细胞铺满培养瓶底面，成漩涡状生长，漩涡中心的细胞为复层生长，周围大部分细胞胞体呈单层的漩涡状或辐射状，见图1，2。

流式细胞仪检测结果显示CD34(1.2%)、CD45 (4.9%)、CD29(99.4%)、CD90(98.7%)、CD105(92.2%)、及CD49(86.8%)阳性，人脐带间充质干细胞均一性好，纯度达98%以上。
2.2 RT-PCR检测结果见图3。

PCR产物电泳鉴定结果显示，经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染48 h后，碱性成纤维细胞生长因子转染组脐带间充质干细胞检测到到碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达，对照组、空载病毒组未检测到碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达，表明碱性成纤维细胞生长因子基因已稳定整合入转染脐带间充质干细胞的基因组中。
2.3 Western blot检测结果 Western blot 产物电转鉴定结果显示，经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染48 h后，碱性成纤维细胞生长因子转染组脐带间充质干细胞检测到到碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达，对照组、空载病毒组未检测到碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达，表明碱性成纤维细胞生长因子基因已稳定整合入转染脐带间充质干细胞的基因组中，并且能够稳定的表达目的蛋白，见图4。

2.4 细胞生长曲线经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染后，碱性成纤维细胞生长因子转染组脐带间充质干细胞的增殖能力较对照组、空载病毒组细胞增殖能力明显增强，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1，图5。说明碱性成纤维细胞生长因子基因已稳定整合入转染脐带间充质干细胞的基因组中。
2.5 CCK-8结果经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染48 h后，碱性成纤维细胞生长因子转染组脐带间充质干细胞A490值(0.29±0.08)较对照组A490值(0.17±0.03)、空载病毒组细胞A490值(0.18±0.02)明显升高，组间比较差异有显著性意义 (P < 0.05)。

2.6 细胞周期分布经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染48 h后，碱性成纤维细胞生长因子转染组S期细胞明显多于对照组、空载病毒组，差异有显著性意义(P < 0.05)；碱性成纤维细胞生长因子转染组G1期细胞明显较对照组、空载病毒组减少，差异有显著性意义(P < 0.05)；M期细胞无明显变化，见表2。

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引言

材料方法

设计：细胞形态学观察。

时间及地点：2012年2至11月在新乡医学院完成。

材料：

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对脐带间充质干细胞培养实验的主要试剂及仪器：

脐带标本：经过伦理委员会批准取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，经产妇及家属同意用于实验。

实验方法：

细胞培养：健康胎儿的脐带用PBS充分冲洗，剔除血管后，剩余的组织切割成直径约1 mm³大小的组织块，0.1% Ⅱ型胶原酶，0.25%胰酶37 ℃消化30 min，离心，去上清，将组织块与细胞接种于培养皿，置于含体积分数5%胎牛血清的DMEM培养基中培养。第1次传代后每3 d按1∶3比例传代，进行扩增培养。取P3代细胞，消化后加人PE FITC标记的CD73、CD105、HLA-DR、CD31、VWF、KDR、CD34、CD45、CD235a流式抗体及相应对照标记，流式细胞仪检测。

重组腺相关病毒载体介导碱性成纤维细胞生长因子转染：取生长良好的第3代脐带间充质干细胞，接种于24孔板，细胞接种浓度为6×10⁴个/孔，加入完全培养基(DMEM，90%；体积分数10%胎牛血清)，培养条件：37 ℃ carbon dioxide(CO₂)，体积分数5%进行培养。3 d后进行rAAV-碱性成纤维细胞生长因子转染：弃去培养液，PBS洗细胞2次，吸取瓶内的残余培养液，按感染倍数(multiple infection，MOI)=10⁵加入无血清的L-DMEM培养基稀释的rAAV-碱性成纤维细胞生长因子，使其完全覆盖细胞培养面积，37 ℃孵育2 h，分别加入适量L-DMEM培养基和胎牛血清，继续按常规贴壁细胞培养1周后进行下列实验。检测前3 d不更换细胞培养液。同样条件下进行空载病毒转染，作正常细胞同等培养条件下为对照组。即分为3组：对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。

RT-PCR：采用Trizol试剂说明书介绍的方法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量，按照反转录试剂盒说明进行反转录，引物设计如下。碱性成纤维细胞生长因子上游引物为5-CCG CCG AAC GGG ACA GAT T-3，下游引物为5-CGG GAA GCG AAG TGA TGC-3，产物大小347 bp；β-actin上游引物为5-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3，下游引物为5-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3，产物大小151 bp。PCR反应条件：94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32个循环，最后72 ℃延伸7 min。每一PCR反应重复3次。PCR产物进行电泳以β-actin作为内参照，电泳后用凝胶成像系统提取图像，计算碱性成纤维细胞生长因子条带与β-actin条带的灰度相对比值，进行mRNA半定量分析。

Western blot：将3组细胞悬液分别经离心半径 16 cm，800 r/min，离心5 min，收集细胞，弃上清，加400 μL蛋白裂解液，提取蛋白后，Bradford 法测定蛋白浓度。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V，3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，兔抗人成纤维细胞因子多克隆抗体1∶800，37 ℃摇床孵育 2 h，TBST 洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗体1∶700， 37 ℃摇床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4次，二甲基联苯胺显色。实验重复3次。进行Quantity one 图像分析，应用目的条带与β-actin条带吸光面积积分比值评定蛋白的表达水平。

生长曲线测定：在24孔板上按1.6×10⁴/孔接种脐带间充质干细胞，分为对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组，每组设3个复孔。第2天起，每天同一时间消化每组细胞3个孔，精确计数，连续5 d，绘制各组细胞的生长曲线图。

CCK-8检测：在96孔板上按1×10⁴/孔接种脐带间充质干细胞，分为对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组，每组设3个平行孔，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中培养48 h后，弃去培养液，生理盐水漂洗1遍。每孔加入10 μL的CCK-8试剂，培养箱内培养2 h。在酶标仪上测定波长450 nm时的吸光度值，参比波长为630 nm，计算每个时间点吸光度的平均值。实验重复3次。

流式检测：收集对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组细胞，调整每组的细胞浓度为 1×10⁶ L^-¹，经冷PBS洗涤2次，加入体积分数70%的冷乙醇(4 ℃)固定24 h。洗涤细胞，与含10 mg/L RNA 酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)共同孵育30 min。5 010 mg/L碘化丙啶(PI)进行细胞DNA 染色，1 h内流式细胞仪分析细胞DNA含量分布，计算出每个周期细胞的百分率。

主要观察指标：应用RT-PCR，Western blot检测脐带间充质干细胞在转染前后碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、CCK-8观察细胞生长的优化作用，采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，由第一作者采用SPSS 15.0统计软件进行完全随机设计的方差分析。两组之间的两样本比较用q 检验(即Newman-kueuls法)，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

人脐带间充质干细胞是一种具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，在体内环境和各种因子的作用下，干细胞产生大量的生长因子，参与了体内损伤组织和器官的修复过程，不会影响细胞的增殖和分化，是基因治疗的理想的靶细胞，其具有来源比较广泛、易于采集、保存、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。有研究显示人脐带间充质干细胞能够顺利分离和体外扩增，其在间充质干细胞专用培养基中长势良好，通过传代可以获得丰富的干细胞来^[4]。高效安全地将目的基因导入靶细胞是成功进行基因治疗的关键^[5]，重组腺相关病毒载体具有安全性好、免疫原性低、能感染分裂细胞和非分裂细胞、致病性低、潜伏感染、安全可靠、定向插入、能介导基因长期稳定表达、简单易行等优点^[6]，所以作为一种基因导入载体，重组腺相关病毒载体在基因治疗的研究及开发中受到越来越多的关注，是目前基因工程研究的热点之一^[7]。

碱性成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子蛋白家族的基本成员之一，具有多重生物学效应和重要的临床价值，能促进多种源于中胚层和外胚层的细胞生长、增殖和分化的生物学活性^[8]，在体内广泛分布，如在垂体、下丘脑、视网膜、肾上腺、胸腺、黄体、肾、心、肝、胎盘及多种肿瘤组织中均有分布，在多种细胞，如成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞等增殖、迁移、分化及生存中起到重要的支持作用^[9]，不仅是调控增殖及定向分化的首选生长因子之一，并且是一种重要的营养因子，能刺激新生血管形成及多种神经细胞的存活并抑制凋亡，参与创伤愈合及组织再生、骨骼形成、促进胚胎组织发育、分化及神经营养等^[10]。但是由于其半衰期短、组织含量较低等原因，使得通过局部或全身给予外源性碱性成纤维细胞生长因子均难以达到理想的治疗目的^[11]；转基因技术应用合适的载体将外源性碱性成纤维细胞生长因子基因转入体内，持续表达碱性成纤维细胞生长因子，使其发挥长期、高效的作用以达到理想的治疗效果^[12-20]。

这次实验通过RT-PCR法检测发现转染碱性成纤维细胞生长因子基因的体外培养脐带间充质干细胞有外源性碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达，应用Western blot检测发现转染碱性成纤维细胞生长因子基因的脐带间充质干细胞可以稳定表达外源性碱性成纤维细胞生长因子蛋白，而对照组、空载病毒组细胞均未见外源性碱性成纤维细胞生长因子mRNA和碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达。

本研究结果表明，碱性成纤维细胞生长因子基因能够成功地转入体外培养的脐带间充质干细胞中，使其稳定持续地表达释放碱性成纤维细胞生长因子基因，其产物的相对分子质量正确，极大的提高了碱性成纤维细胞生长因子的正确而高效的分泌表达水平，增强其增殖能力^[21]。

采用MTT改良法(CCK法)来检测转染碱性成纤维细胞生长因子基因对脐带间充质干细胞增殖及细胞周期的影响，测定细胞能量代谢水平可以间接反映细胞增殖的情况，该方法具有简便、敏感、准确、重复性好等的优点^[21-27]。经统计学分析发现转染碱性成纤维细胞生长因子组曲线始终高于对照组、空载病毒组，并且差异有显著性意义(P < 0.05)，而对照组、空载病毒组之间差异则无显著性意义(P > 0.05)，结果表明经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染脐带间充质干细胞的生长速度明显增快。DNA的合成是细胞增殖必要的过程，经DNA复制的S期和G₂期细胞增多表明细胞有丝分裂增加，增殖能力增强。流式细胞仪细胞周期检测法是通过测定细胞DNA各时期所占比例来判断细胞增殖状况。这次实验结果表明碱性成纤维细胞生长因子转染组中细胞周期G₀/G₁期减少，S期细胞数增多，各组间差异有显著性意义(P < 0.05)，说明碱性成纤维细胞生长因子转染组中，目的基因具有生物学活性，有较多的脐带间充质干细胞处于增殖期，缩短细胞周期，增强增殖能力^[28-31]。

综上所述，重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的脐带间充质干细胞，目的基因在靶细胞得到持续高效表达，和外源性生长因子相比生物活性更高，能促进脐带间充质干细胞自身高效增殖，对脐带间充质干细胞培养有优化作用。本次实验仅说明体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因的脐带间充质干细胞通过表达的内源性碱性成纤维细胞生长因子而促进自身的增殖，植入体内对细胞生长产生影响如何，仍需进一步探索。

文章快阅

延伸阅读

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