缺氧预处理脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：糖尿病下肢血管病变发病率的升高，使如何通过改善下肢血管及增加新生血管生成成为关注的焦点，临床上已用人脐带间充质干细胞局部肌肉注射进行治疗，但是具体的治疗效果及机制尚不明确。
目的：探讨缺氧预处理及氯化钴培养液对脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞的影响。
方法：分离、培养脐带间充质干细胞，经不同浓度氯化钴模拟体内病理状态下的缺氧，通过ELISA检测细胞上清中碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子基因水平表达、MTT检测细胞增殖，选取最适氯化钴浓度，染色体进行氯化钴诱导前后安全性检测，用含10 µg/L血管内皮生长因子、10 µg/L的碱性成纤维细胞生长因子及体积分数10%胎牛血清的DMEM-LG/F12培养液向内皮样细胞方向诱导分化，鉴定诱导前及诱导后内皮样细胞表型CD31、假性血友病因子，通过三维血管形成模型的观察进行诱导前后脐带间充质干细血管形成能力检测。
结果与结论：分离的脐带间充质干细经流式鉴定高表达脐带间充质干细相关表面标志。经含不同浓度氯化钴的培养液处理后，细胞增殖与作用时间呈正相关。根据碱性成纤维生长因子和血管内皮生长因子基因水平的表达，验证得出氯化钴浓度为200 µmol/L为最适浓度。染色体检测显示氯化钴干预后的安全性可靠。诱导后CD31及假性血友病因子强阳性表达，三维血管成形观察显示脐带间充质干细诱导后可形成直径大小不等的管腔样结构，证实脐带间充质干细可诱导为内皮样细胞，且具有成血管的能力。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 糖尿病, 脐带间充质干细胞, 氯化钴, 缺氧, 下肢血管病变, 动脉粥样硬化, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Incidence of diabetic lower extremity vascular disease is increasing, so how to improve blood vessels of the lower limbs and increase angiogenesis becomes the research focus. Umbilical cord mesenchymal stem cells have been employed clinically via local intramuscular injection, but the specific therapeutic effect and mechanism are not clear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of hypoxic preconditioning and cobalt chloride medium on the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into vascular endothelial-like cells in vitro.
METHODS: Umbilical cord mesenchymal stem cells were isolated and cultured, and then treated with different concentrations of cobalt chloride. Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect levels of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor gene in cell supernatants, and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide to detect cell proliferation. The safety of umbilical cord mesenchymal stem cells before and after cobalt chloride induction was detected using chromosome. The umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 containing 10 μg/L vascular endothelial growth factor, 10 μg/L basic fibroblast growth factor and 10% fetal bovine serum, which were induced to differentiate into vascular endothelial-like cells. Endothelial-like cell phenotype CD31 and von Willebrand factor were identified before and after induction, through the observation of three-dimensional model of angiogenesis, the angiogenic capacity of umbilical cord mesenchymal stem cells was determined.
RESULTS AND CONCLUSION: Umbilical cord mesenchymal stem cells strongly expressed the surface marks. After the cobalt chloride induction, the proliferation of umbilical cord mesenchymal stem cells was positivelycorrelated with the time of induction. Based on the levels of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor, the optimal concentration of cobalt chloride was 200 µmol/L. Chromosome detection showed the stability of cells after cobalt chloride induction. After induction, CD31 and von Willebrand factor were strongly expressed. Three-dimensional observation showed umbilical cord mesenchymal stem cells could be induced to form the lumen-like structure with different diameter sizes, and umbilical cord mesenchymal stem cells could be induced to differentiate into endothelial-like cells, and have a angiogenic capacity.

Key words: stem cells, diabetes mellitus, anoxia, atherosclerosis

中图分类号:

R394.2

郝晓娟，朱旅云. 缺氧预处理脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.008.

Hao Xiao-juan, Zhu Lü-yun. Umbilical cord mesenchymal stem cells undergoing hypoxic preconditioning can differentiate into vascular endothelial-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.008.

图/表（结果） 10

2.1 脐带间充质干细胞形态学观察倒置显微镜下观察，脐带Wharton’s Jelly组织块培养至 5 d左右，组织块周围爬出贴壁生长的梭形样细胞，细胞两端伸出较长突起，胞体中央膨大，为圆形细胞核。培养至第12天左右，细胞形态逐渐变为均一的纺锤形，见图1。

2.2 流式细胞仪检测细胞表面标志从脐带Wharton’s Jelly中分离出的贴壁细胞高表达与脐带间充质干细胞相关的CD105、CD29、CD44，见图2；低表达与造血干细胞相关的CD14、CD34、CD45，且细胞传代培养至10代，细胞表面标志无改变，见图3。

2.3 MTT检测细胞增殖活力脐带间充质干细胞生长曲线近似呈“S”型，氯化钴干预后，对数期延迟，增殖速度及幅度均低于对照组，对细胞增殖程度随时间及浓度呈依赖性，各组差异随时间而不同，总体分析以时间为变量进行分析，浓度200 µmol/L和300 µmol/L比较适中，结果比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.4 染色体核型分析结果通过油镜下观察，进行G带分析，显示测定的染色体均为正常二倍体，说明氯化钴干预后并不会使染色体突变及致畸，提示氯化钴模拟体内病理状态下得缺氧是安全的，见图4。

2.5 血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子基因水平表达见表1，2。

不同浓度氯化钴处理后，碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子蛋白表达水平在各时点均明显高于未处理组(氯化钴浓度为0 µmol/L时)，各浓度之间两两比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。氯化钴浓度 200 µmol/L组碱性成纤维生长因子及血管内皮生长因子表达水平均比较适中。
2.6 免疫组化鉴定诱导后35 d强表达CD31及假性血友病因子，见图5。

2.7 诱导后的内皮样细胞形态诱导起初各组细胞增殖程度一致，1周后单纯脐带间充质干细胞组细胞明显增殖，细胞相互融合、重叠，细胞呈长梭形；脐带间充质干细胞+氯化钴诱导3 d组细胞增殖程度稍低于单纯脐带间充质干细胞组，细胞同样呈长梭形；脐带间充质干细胞+氯化钴组与单纯脐带间充质干细胞组细胞增殖明显减低，较诱导前无明显改变，见图6。
随着时间延长，单纯脐带间充质干细胞组和脐带间充质干细胞+氯化钴诱导3 d组增殖程度逐渐减低，细胞呈多角形及长梭形；脐带间充质干细胞+氯化钴组增殖程度大于单纯脐带间充质干细胞组和脐带间充质干细胞+氯化钴诱导3 d组，细胞形态近似圆形；对照组增殖减少最明显，细胞形态无明显改变；于第5周，前3组细胞形态均呈短缩、类圆形及形态不规则形，见图7。对照组形态较前无明显变化。

通过苏木精-伊红染色显示，脐带间充质干细胞经诱导后呈内皮样细胞形态的表达，细胞显示多样性，呈“长梭形、多角形、短梭形、圆形、铺路石样”改变。
2.9 三维血管形成模型观察倒置相差显微镜下观察诱导后脐带间充质干细胞形成类似内皮样细胞一样的管腔样结构，见图10。

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引言

材料方法

设计：分组样本对比观察。

时间及地点：2012年2至10月在白求恩国际和平医院输血科实验室及检验科实验室完成。

材料：

脐带来源：脐带取自白求恩国际和平医院妇产科健康足月剖宫产妇，产妇无传染性疾病病史，胎儿无先天性疾病，获得产妇知情同意，并签署知情同意书。

缺氧预处理脐带间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞实验的主要材料和仪器：

实验方法：

脐带间充质干细胞的分离培养与扩增：将无菌条件下新鲜取得的足月剖宫产胎儿脐带浸泡于生理盐水中，将脐带剪成3.0-4.0 cm长的小段，去除表皮及血管，取出其中的Wharton’s Jelly剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，以DMEM/F12培养基(含体积分数10%FBS)重悬，接种于25 cm²的培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞贴壁后弃掉组织块，并更换培养基，以后视细胞生长情况每3 d换液1次，细胞融合达80%左右传代培养。

流式细胞学检测细胞表面标志及鉴定：脐带间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞，加入100 µL PBS稀释细胞，制成细胞悬液，加入小鼠抗人单抗和同型阴性对照抗体：CD29-FITC，CD44-FITC，CD105-PE，CD14-FITC，CD14-/CD29/CD44- FITC-ISO，CD105- PE-ISO，CD34/CD45-PE-ISO，CD34/CD45-FITC，室温孵育30 min，PBS离心洗涤2次，重新制成细胞悬液，流式细胞仪分析，每次标本重复实验3次。

实验分组及MTT检测：将脐带间充质干细胞以1×10⁶ L^-¹细胞浓度接种至96孔板中，加入含不同浓度氯化钴0，50，100，200，300，400，500 µmol/L的培养基过夜，每孔加入0.5% MTT 20 µL，37 ℃、体积分数5%CO₂孵育箱内培养4 h，吸取孔内培养液，每孔加入150 µL DMSO(二甲基亚砜)，振荡10 min，用分光光度仪 490 nm测定吸光值，用Excel绘制生长曲线。

ELISA试剂盒测血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子基因水平：将冰冻保存的细胞上清，每组设3复孔，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

染色体分型及其安全性检测：取生长状态良好的P3代脐带间充质干细胞，进行氯化钴200 µmol/L诱导持续性缺氧，选取干预P7代后的细胞及相应P7代正常的脐带间充质干细胞进行染色体分型，于对数生长期加秋水仙素，终浓度为0.3 mg/L，作用时间为3.5 h，加入0.25%胰酶消化，收集细胞，1 200 r/min，离心3 min，弃上清，加入0.075 mol/L的KCL溶液5 mL，37 ℃水浴低渗处理35 min，滴片，56 ℃烤片15 min， 0.025%胰酶37 ℃消化显带处理15 s，Giemsa染色10 min，晾干，镜下观察并拍照。

不同方法处理后的脐带间充质干细胞诱导内皮样细胞：经上述实验及文献参考选取氯化钴模拟人体病理状态下的缺血缺氧的最佳浓度为200 µmol/L^[9-10]，进行下一步实验。实验分4组进行观察：单纯脐带间充质干细胞组、脐带间充质干细胞+氯化钴组、脐带间充质干细胞+氯化钴诱导3 d组、不添加诱导剂的对照组。选取生长状态良好的P4代脐带间充质干细胞，将脐带间充质干细胞以10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6瓶25 cm²培养瓶中，24 h后换液，除对照组外，其他3组均加入内皮细胞诱导液(体积分数2%FBS、10 µg/L血管内皮生长因子、10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基)，各组诱导剂总量为10 mL，包含不同组中的干预成分。对照组不进行诱导，加入相应处理因素于瓶中。倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，每4 d半量换液。

苏木精-伊红染色：苏木精-伊红染色进行脐带间充质干细胞及内皮样细胞形态学比较，将脐带间充质干细胞及诱导后的内皮样细胞以10⁹ L^-¹细胞浓度接种于已放有盖玻片的六孔板中，待细胞融合达70%左右，取出玻片，用PBS洗涤3次，用40 g/L多聚甲醛固定，放入配好的苏木精染液中3 min，取出用自来水冲洗，放入1%盐酸乙醇溶液30 s，自来水冲洗，洗涤5 min，移入伊红液3 min，移入水中冲洗，再依次放入体积分数80%乙醇、体积分数90%乙醇、无水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，于二甲苯Ⅱ 5 min后，吹干，中性树脂胶封固，镜下观察细胞形态。

免疫组化鉴定：选取干预后的脐带间充质干细胞以10⁹ L^-¹细胞浓度接种于盖玻片上，待细胞融合70%- 80%，收集细胞上清冰冻保存，40 g/L多聚甲醛固定2 h，中性树脂粘于载玻片过夜，体积分数3%过氧化氢+甲醇浸泡冲洗15 min，3%小牛血清白蛋白作用20 min后，加入鼠抗人CD31单克隆抗体和兔抗人八因子相关抗原多克隆抗体，室温2 h后4 ℃过夜，加入二抗，二氨基联苯胺显色剂显色4 min，苏木精复染，中性树脂胶封固，镜下观察阳性细胞。

三维血管形成模型观察：鼠尾胶原制备，截取大鼠尾巴5根，体积分数75%乙醇浸泡30 min，去掉皮毛，抽出银白色的尾键，剪碎置于150 mL，0.1%无菌冰醋酸中，4 ℃放置，并不时振荡，1周后取上清，4 000 r/min离心30 min，取上清，即鼠胶原制备成功，取制备好的胶原200 µL测pH值为6，用0.1 mmol/L NaOH 50 µL中和，调整pH为7，吸入6孔板中，室温放置3 h，待胶原凝固，收集诱导前后脐带间充质干细胞以5×10⁵个细胞铺入还胶原的六孔板中，补加培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，倒置相差显微镜观察细胞变化。

主要观察指标：脐带间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化；流式细胞仪检测鉴定脐带间充质干细胞；绘制生长曲线观察氯化钴对脐带间充质干细胞的影响；证实氯化钴诱导缺氧的最适浓度；染色体检测安全性；免疫组化鉴定诱导后的脐带间充质干细胞是否为内皮样细胞；三维血管形成了解成血管性。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软件分析对各组数据进行t检验和单因素方差分析，各组数据均以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病足，WHO定义为糖尿病患者发生的与下肢远端神经异常和不同程度的周围血管病变相关的足部感染、溃疡和(或)深层组织破坏^[11]。糖尿病下肢血管病变为糖尿病足的前期阶段，是下肢血管病变、神经病变及感染，“三主因”共同作用的结果，促使糖尿病下肢血管再生是其核心。下肢血管病变归根结底是由于全身动脉粥样硬化在下肢血管病变的局部表现，动脉粥样硬化与下肢慢性缺血息息相关，而糖尿病患者更容易导致动脉粥样硬化^[12-14]。目前国内外已采用各种手段进行挽救，大体分为内科，扩血管药物、抗血小板聚集及改善血循环等和外科治疗，介入、血管重建术等，随着人们对干细胞的功能的逐渐而深入的认识，干细胞移植成了近年治疗或预防糖尿病下肢血管病变及糖尿病足的新方法，成为全球热点，相关研究证明其安全性及有效性^[15-16]，但临床尚未全面开展，一些鲜为人知的机制及体内的变化尚在研究中。

脐带间充质干细胞已被人们誉为最佳的诱导分化的种子细胞，实验选用脐带间充质干细胞，并选用化学试剂氯化钴进行体外模拟糖尿病下肢血管病变缺氧环境^[17]，通过相关检测指标体外探讨脐带间充质干细胞治疗糖尿病足的机制的实验研究。

氯化钴已被证明模拟体外实验与体内缺氧状态下的研究成果具有很强的可比性，其机制是通过钴离子替代铁螯合于血红蛋白中，阻断氧感受器与氧的结合，细胞对氯化钴刺激和缺氧刺激具有相同的缺氧感受，信号转导和转录调节机制^[18-20]。缺氧状态下碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮生长因子蛋白的表达增强^[21-22]，本实验通过ELISA方法检测这两个因子表达已得到证实，并通过细胞增殖曲线结合不同浓度缺氧状态下碱性成纤维生长因子及血管内皮生长因子蛋白的表达，得出氯化钴浓度在200 µmol/L时更符合体内缺氧状态^[17]。

已有大量实验证明脐带间充质干细胞通过加入含有血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的培养基可使其向内皮样细胞诱导分化^[23-25]，目前公认的内皮细胞特异性标志是假性血友病因子、CD31^[26-28]，可用来鉴定内皮细胞，经免疫组化鉴定诱导前后脐带间充质干细胞强表达假性血友病因子、CD31。大量研究表明脐带间充质干细胞及内皮样细胞有成血管特性^[29-31]，本研究根据国外进行构建三维血管模型的方法中^[32]，进一步证实诱导后内皮样细胞有成血管性，且经氯化钴干预后或在氯化钴长期作用下(模拟缺氧环境)诱导出的内皮样细胞同样有这个特性，其机制可能为旁分泌血管内皮生长因子或自分泌而促进血管形成^[31]。

综上所述，氯化钴可以模拟体内缺氧状态，并且可以诱导成具有内皮细胞生理活性、成血管性的内皮样细胞，进一步体外证实脐带间充质干细胞治疗糖尿病下肢血管病变的可行性。