不同氧分压时人脂肪干细胞细胞因子的分泌

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.007

中国组织工程研究

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

不同氧分压时人脂肪干细胞细胞因子的分泌

姜亦瑶¹，刘晓程¹，裴宇²，朱德琳¹

1天津医科大学心血管病临床学院，泰达国际心血管病医院心外科，天津市 300457；2中国医学科学院北京协和医学院，泰达国际心血管病医院心外科，天津市 300457

修回日期:2013-08-02 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 刘晓程，教授，博士生导师，天津医科大学心血管病临床学院，泰达国际心血管病医院心外科，天津市 300457 TEDA_LXC@163.com
作者简介:姜亦瑶☆，男，1984年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，天津医科大学在读博士，医师，主要从事脂肪来源干细胞应用于心肌梗死疾病方面的研究。 Jiangyiyao0309@sina.com
基金资助:
天津市滨海新区卫生局科技项目(2012BWKZ009)*

Influence of different oxygen partial pressures on cytokines secreted from human adipose-derived stem cells

Jiang Yi-yao¹, Liu Xiao-cheng¹, Pei Yu², Zhu De-lin¹

1Department of Cardiovascular Surgery, TEDA International Cardiovascular Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300457, China; 2Department of Cardiovascular Surgery, TEDA International Cardiovascular Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300457, China

Revised:2013-08-02 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Liu Xiao-cheng, Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiovascular Surgery, TEDA International Cardiovascular Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300457, China TEDA_LXC@163.com
About author:Jiang Yi-yao☆, Studying for doctorate, Physician, Department of Cardiovascular Surgery, TEDA International Cardiovascular Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300457, China Jiangyiyao0309@sina.com
Supported by:
the Health Bureau of Tianjin Economic and Development Area Foundation, No. 2012BWKZ009*

摘要/Abstract

摘要：

背景：不同氧分压对人脂肪来源干细胞分泌细胞因子的影响目前尚未定论，这些差异可能由于研究者对于氧分压的选取不同而造成影响。
目的：检测不同氧分压对人脂肪来源干细胞分泌细胞因子的影响。
方法：体外分离培养人脂肪来源干细胞进行免疫表型进行鉴定。将人脂肪来源干细胞分别在1%，3%，5%，10%，21%氧分压的环境中培养24 h后，使用实时定量PCR和酶联免疫吸附法对人脂肪来源干细胞分泌的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、神经细胞生长因子、角质细胞生长因子，在基因水平以及蛋白水平上进行检测分析。
结果与结论：人脂肪来源的人脂肪来源干细胞阳性表达CD71，CD73，CD90，CD105，阴性表达CD34，CD45，CD54及HLA-DR。经单因素方差分析统计，在基因水平上，低氧环境(体积分数1%，3%氧)均可促进人脂肪来源干细胞显著性高表达血管内皮生长因子、神经生长因子(P均< 0.01)；对人脂肪来源干细胞表达肝细胞生长因子有显著影响(P < 0.05)；而对角质细胞生长因子的表达则无显著影响(P > 0.05)。在蛋白水平上，低氧促进人脂肪来源干细胞分泌肝细胞生长因子、血管内皮生长因子蛋白(P均<0.01)，对神经生长因子、角质细胞生长因子的分泌无显著影响。结果提示，人脂肪来源干细胞在低氧环境中培养后，其生物学特性受到一定的改变，可促进血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子基因的表达，提高肝细胞生长因子、血管内皮生长因子蛋白的分泌。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 低氧, 免疫表型, 细胞因子, 肝细胞生长因子, 神经生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Effects of different oxygen partial pressures on cytokine secretion of human adipose-derived stem cells have been differently reported. These differences may be caused by varying oxygen partial pressures.
OBJECTIVE: To investigate the influence of different oxygen partial pressures on cytokines secreted from human adipose-derived stem cells.
METHODS: Human adipose-derived stem cells were cultured in vitro and identified by its immunophenotype. Human adipose-derived stem cells were divided into five groups and cultured under different oxygen partial pressure conditions (1%, 3%, 5%, 10%, 21%) for 24 hours, respectively. With quantitative real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay, the secretion of cytokines, vascular endothelial growth factor, hepatocyte growth factor, nerve growth factor, keratinocyte growth factor, from human adipose-derived stem cells were analyzed on the gene and protein levels.
RESULTS AND CONCLUSION: Human adipose-derived stem cells were positive for CD71, CD73, CD90, CD105 and negative for CD34, CD45, CD54, HLA-DR. From the aspect of gene level, hypoxia (1%, 3% O2) promoted the expression of vascular endothelial growth factor and nerve growth factor from human adipose-derived stem cells (P < 0.01), and significantly elevated the expression of hepatocyte growth factor (P < 0.05); however, there was no significant influence on keratinocyte growth factor under hypoxia (P > 0.05). Based on the protein level, protein secretion of hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor from human adipose-derived stem cells was increased under hypoxia (P < 0.01), but no changes occurred in nerve growth factor and keratinocyte growth factor. After cultured under hypoxic environment, human adipose-derived stem cells were promoted to express gene vascular endothelial growth factor, hepatocyte growth factor and nerve growth factor, as well as to secrete protein keratinocyte growth factor and vascular endothelial growth factor.

Key words: stem cells, phenotype, cytokines, hepatocyte growth factor, nerve growth factor

中图分类号:

R394.2

姜亦瑶，刘晓程，裴宇，朱德琳 . 不同氧分压时人脂肪干细胞细胞因子的分泌[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.007.

Jiang Yi-yao, Liu Xiao-cheng, Pei Yu, Zhu De-lin. Influence of different oxygen partial pressures on cytokines secreted from human adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.007.

图/表（结果） 4

2.1 人脂肪来源干细胞免疫表型鉴定见图1。

人脂肪来源干细胞免疫表型抗原CD71、CD73、CD90、CD105阳性表达率较高，分别为(80.63±0.74)%，(99.82± 0.12)%，(99.61±0.37)%，(99.55±0.26)%，而CD34、CD45、CD54、HLA-DR为阴性表达，分别为(0.04± 0.01)%，(0.06±0.02)%，(11.5±0.13)%，(0.11± 0.03)%。
2.2 肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、角质细胞生长因子基因转录表达实时定量PCR检测各组细胞因子mRNA相对于对照组的倍数表达关系，见表2，图2。

结果示各实验组中肝细胞生长因子的表达量差异有显著性意义(F=3.62，P < 0.05)，肝细胞生长因子的表达在1%O2预处理组中显著多于10%O2预处理组、对照组，在3%O2预处理组中显著多于对照组(P < 0.05)。各实验组中血管内皮生长因子的表达量差异有非常显著性意义(F=8.19，P < 0.01)，血管内皮生长因子的表达在1%O2预处理组、3%O2预处理组、5%O2预处理组中均高度显著多于10%O2预处理组、对照组；神经生长因子的表达量差异有非常显著性意义(F=15.46，P < 0.01)，神经生长因子的表达在1%O2预处理组、3%O2预处理组、5%O2预处理组中均显著多于10%O2预处理组、对照组。角质细胞生长因子的表达无显著差异性意义(F=1.10，P > 0.05)。
2.3 肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、角质细胞生长因子蛋白分泌收集各实验组细胞上清液，ELISA试剂盒测定各组蛋白浓度，见表3。

各实验组肝细胞生长因子蛋白分泌差异有非常显著性意义(F =31.34，P < 0.01)，其中1%O2预处理组、3%O2预处理组肝细胞生长因子蛋白分泌量显著多于10%O2预处理组、对照组，5%O2预处理组、10%O2预处理组肝细胞生长因子蛋白分泌量显著多于对照组。各实验组血管内皮生长因子蛋白分泌量差异有显著性意义(F =34.25，P < 0.01)，其中1%O2预处理组、3%O2预处理组血管内皮生长因子蛋白分泌量显著高于其他组，5%O2预处理组血管内皮生长因子蛋白分泌量与10%O2预处理组、对照组差异无显著性意义。各实验组角质细胞生长因子蛋白分泌量差异有显著性意义 (F =47.12，P < 0.01)，1%O2预处理组、3%O2预处理组角质细胞生长因子蛋白分泌量显著低于5%O2预处理组和对照组，10%O2预处理组角质细胞生长因子蛋白分泌量显著低于5%O2预处理组和对照组，5%O2预处理组角质细胞生长因子蛋白分泌量显著低于对照组。10%O2预处理组神经生长因子蛋白的分泌量显著低于对照组(P < 0.05)，见图3，4。

参考文献

[1] Yamada Y, Wang XD, Yokoyama S, et al. Cardiac progentior cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006; 342(2):662-667.
[2] Saltzman DJ, Toth A, Tsai AG, et al. Oxygen tension distribution in postcapillary venules in resting skeletal muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;285(5):H1980-1985.
[3] Mckinley BA, Butler BD.Comparison of skeletal muscle PO2, PCO2 and pH with gastric tonometric PCO2 and pH in hemorrhagic shock. Crit Care Med 1999; 27(9):1869-1877
[4] Kim JH, Park SH, Park SG, et al. The pivotal role of reactive oxygen species generation in the hypoxia-induced stimulation of adipose-derived stem cells. Stem Cells Dev, 2011; 20(10): 1753-1761
[5] Zhang XL, Wang HB, Ma X, et al. Preservation of the cardiac function in infarcted rat hearts by the transplantation of adipose-derived stem cells with injectable fibrin scaffolds. Experimental Biology and Medicine.2010; 235(12): 1505- 1515.
[6] Chung HM, Won CH, Sung JH.Responses of adipose-derived stem cells during hypoxia:enhanced skin-regenerative potential. Expert Opin Biol Ther. 2009; 9(12): 1499-1508.
[7] 袁小刚,吕农华.骨髓间充质干细胞的诱导分化及其恶性转化[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(14):2615-2618.
[8] Røsland GV, Svendsen A, Torsvik A, et al. Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation. Cancer Res.2009; 69(13):5331-5339.
[9] Golfinopoulos V, Pentheroudakis G, Kamakari S,et al. Donor- derived breast cancer in a bone marrow transplantation recipient. Breast Cancer Res Treat. 2009; 113(2):211-213.
[10] Stummann TC, Bremer S. Embryonic stem cells in safety pharmacology and toxicology. Advances in Experimental Medicine and Biology.2012;745:14-25.
[11] Andrew D, Leavitt MD, Isla H D. Homologous recombination in human embryonic stem cells: a tool for advancing cell therapy and understanding and treating human disease. CTS. 2011;(4):298-305.
[12] Pineda ET, Nerem RM, Ahsan T. Differentiation Patterns of Embryonic Stem Cells in Two- versus Three-Dimensional Culture. Cells Tissues Organs. 2013 Feb 9.
[13] Swijnenburg RJ, Schrepfer S, Cao F, et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells Dev. 2008; 17(6):1023-1029.
[14] 王延光.论干细胞研究中胚胎的道德地位[J].中国医学伦理学, 2006,19(2):6-10.
[15] 朱希山,赵春华.胚胎干细胞研究的伦理之争[J].中国医学伦理学, 2006,19(6):57-59.
[16] Gimble JM. Adipose tissue-derived therapeutics. Expert Opin Biol Ther. 2003; 3(5):705-713.
[17] Hsu VM, Stransky CA, Bucky LP,et al. Fat grafting's past, present, and future: why adipose tissue is emerging as a critical link to the advancement of regenerative medicine. Aesthet Surg J. 2012; 32(7):892-899.
[18] Choi J,Minn KW,Chang H.The efficacy and safety of platelet-rich plasma and adipose-derived stem cells: an update. Arch Plast Surg.2012; 39(6):585-592.
[19] Ren ML,Peng W,Yang ZL,et al.Allogeneic adipose-derived stem cells with low immunogenicity constructing tissue-engineered bone for repairing bone defects in pigs. Cell Transplant. 2012; 21(12):2711-2721.
[20] Strauß S, Dudziak S, Hagemann R,et al.Induction of osteogenic differentiation of adipose derived stem cells by microstructured nitinol actuator-mediated mechanical stress. PLoS One. 2012; 7(12):e51264.
[21] Lee JH, Lee KH, Kim MH,et al.Possibility of undifferentiated human thigh adipose stem cells differentiating into functional hepatocytes. Arch Plast Surg.2012; 39(6):593-599.
[22] Razavi S,Ahmadi N,Kazemi M,et al. Efficient transdifferentiation of human adipose-derived stem cells into Schwann-like cells: A promise for treatment of demyelinating diseases. Adv Biomed Res.2012; 1:12
[23] 胡丽,刘加荣,陈莉莉.组织工程化口腔黏膜构建的研究现状[J].中国组织工程研究与临床康,2011,15(42):7902-7906.
[24] 陈阳,高建华,察鹏飞,等. 5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子促脂肪来源干细胞的增殖[J].中国组织工程研究,2012,16(45): 8481-8485.
[25] Uysal CA, Tobita M, Hyakusoku H,et al. Adipose-derived stem cells enhance primary tendon repair: biomechanical and immunohistochemical evaluation. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2012; 65(12):1712-1719.
[26] Locke M,Feisst V,Dunbar PR.Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 2011; 29(3):404-411.
[27] Wilson A,Butler PE,Seifalian AM. Adipose-derived stem cells for clinical applications: a review. Cell Prolif. 2011; 44(1):86-98.
[28] Locke M, Windsor J, Dunbar PR.Human adipose-derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery.ANZ J Surg.2009; 79: 235-244.
[29] Gronthos S, Franklin DM, Leddy HA,et al. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol. 2001;189: 54-63.
[30] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P,et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell.2002; 13: 4279-4295.
[31] Abraham MR,Gerstenblith G. Preconditioning stem cells for cardiovascular disease：an important step forword. Circ Res.2007;100(4): 447-449.
[32] 高景红,孙传波,张竞文,等.血管紧张素II预处理提高间充质干细胞耐缺氧能力[J].南京医科大学学报:自然科学版,2011,31(8): 1092-1096.
[33] 郭军,李自成.IGF-1预处理对骨髓间充质干细胞心肌再生及抗炎效果的影响[J].临床心血管病杂志, 2011,27(12):948-951.
[34] Mckinley BA, Butler BD. Comparison of skeletal muscle PO2, PCO2, and pH with gastric tonometric PCO2 and pH in hemorrhagic shock. Crit Care Med.1999; 27(9):1869-1877.
[35] Saltzman DJ,Toth A,Tsai AG,et al.Oxygen tension distribution in postcapillary venules in resting skeletal muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol.2003;285(5): H1980-1985.
[36] Simon MC, Keith B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat Rev Mol Cell Biol.2008;9(4):285-296.
[37] Wild JM, Fichele S, Woodhouse N,et al. 3D volume-localized PO2 measurement in the human lung with 3He MRI. Magn Reson Med.2005;53(5):1055-1064.
[38] Buravkova LB,Anokhina EB.Mesenchymal stromal progenitor cells: general characteristics and functional state in low oxygen tension. Ross Fiziol Zh Im IM Sechenova.2008;94(7): 737-757.
[39] He MC, Li J, Zhao CH. Effect of hypoxia on mesenchyma stem cells- review. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2007;15(2):433-436.
[40] Ma T Grayson WL,Frohlich M,Vunjak-Novakovic G. Hypoxia and stem cell-based engineering of mesenchymal tissues. Biotechnol Prog.2009;25(1):32-42.
[41] 陈亭,周燕,张治萍,等.间充质干细胞在低氧环境下的增殖、代谢与成骨分化:胎盘羊膜及骨髓来源间充质千细胞的对比[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(6):957-961.
[42] 王立维,黄文,赵渝.低氧培养对间充质干细胞生物学的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(23):4329-4334.
[43] Wagegg M, Gaber T, Lohanatha FL,et al. Hypoxia Promotes Osteogenesis but Suppresses Adipogenesis of Human Mesenchymal Stromal Cells in a Hypoxia-Inducible Factor-1 Dependent Manner. PLoS ONE.2012; 7(9): e46483.
[44] Stubbs SL, Hsiao ST, Peshavariya HM, et al. Hypoxic preconditioning enhances survival of human adipose-derived stem cells and conditions endothelial cells in vitro. Stem Cells Dev, 2012.
[45] Lavrentieva A, Majore I, Kasper C, et al.Effects of hypoxic culture conditions on umbilical cord-derived human mesenchymal stem cells. Cell Commun Signal. 2010;8:18.
[46] Stubbs SL, Hsiao ST, Peshavariya HM, et al. Hypoxic preconditioning enhances survival of human adipose-derived stem cells and conditions endothelial cells in vitro. Stem Cells Dev. 2012;21(11):1887-1896.
[47] 宋华培,黄跃生,党永明,等.PI3K/ Akt 信号途径抑制烧伤后大鼠缺血缺氧心肌细胞凋亡[J].第三军医大学学报,2009,31(1): 52-55
[48] Kim JH, Park SH, Park SG, et al. The pivotal role of reactive oxygen species generation in the hypoxia-induced stimulation of adipose-derived stem cells. Stem Cells Dev. 2011; 20(10): 1753-1761.
[49] Park SG, Kim JH, Xia Y,et al. Generation of reactive oxygen species in adipose-derived stem cells: friend or foe? Epert Opin Ther Targets.2011; 15(11): 1297-1306.
[50] Planat-Benard V, Menard C, Andre M et al. Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Cir Res.2004; 94(2):223-229.
[51] Hsiao ST, Lokmic Z, Peshavariya H,et al. Hypoxic conditioning enhances the angiogenic paracrine activity of human adipose-derived stem cells. Stem Cells Dev. 2013 Jan 2.
[52] Huang F, Zhu X, Hu XQ,et al. Mesenchymal stem cells modified with miR-126 release angiogenic factors and activate Notch ligand Delta-like-4, enhancing ischemic angiogenesis and cell survival. Int J Mol Med. 2013; 31(2): 484-492.
[53] Sanz-Rosa D, García-Prieto J, Ibanez B. The future: therapy of myocardial protection. Ann N Y Acad Sci. 2012; 1254: 90-98.
[54] Song SY, Chung HM, Sung JH.The pivotal role of VEGF in adipose-derived-stem-cell-mediated regeneration. Expert Opin Biol Ther.2010;10(11):1529-1537.
[55] Przybyt E, Krenning G, Brinker MG,et al. Adipose stromal cells primed with hypoxia and inflammation enhance cardiomyocyte proliferation rate in vitro through STAT3 and Erk1/2. J Transl Med. 2013;11(1):39.

引言

材料方法

设计：细胞学对比观察实验。

时间及地点：于2012年5至11月在和泽生物科技有限公司完成。

材料：

人脂肪：来源于3例20-25岁女性，无其他疾病，经吸脂术获取脂肪组织，术前征得患者同意并签署同意书。

不同氧分压对人脂肪来源干细胞分泌细胞因子的影响实验主要试剂及仪器：

实验方法：

人脂肪来源干细胞的分离与培养：患者知情并同意后，经吸脂术获取脂肪组织。剪除脂肪组织中明显的血管，用含有2 mL双抗(100 U/mL 青霉素，1 g/mL链霉素)的200 mL PBS清洗脂肪组织两三次后剪碎。通过150目尼龙筛网过滤，将获取的液体以1 500 r/min离心(离心半径8 cm)5 min，将上清转移至离心管中，加入含有5 g/L胶原酶Ⅰ的等体积D-Hank’s液，在37 ℃恒温振荡器上振荡约75 min后，以1 800r/min(离心半径8 cm)离心5 min。弃上清，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，调整每个T75培养瓶中的细胞数约为2×10⁶，置入37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱中培养。约24 h后，将未贴壁的细胞移除。7-10 d细胞达到80%融合后，细胞传代培养。所有实验组使用第6代脂肪干细胞。

实验分组及低氧预处理：培养第6代脂肪干细胞24 h，使细胞融合达50%，更换培养基，按以下分组调整氧体积分数，1%O₂预处理组：体积分数1%O₂+5%CO₂+ 94%N₂；3%O₂预处理组：体积分数3%O₂+5%CO₂+ 92%N₂+5%O₂预处理组：体积分数5%O₂+5%CO₂+ 90%N₂+10%O₂预处理组：体积分数10%O₂+5%CO₂+ 85%N₂；对照组：体积分数5%CO₂+95%空气。

细胞免疫表型鉴定：使用流式细胞仪分析人脂肪来源干细胞免疫表型，抗体包括CD34，CD45，CD54，CD71， CD73，CD90，CD105和HLA-DR。鼠同型对照抗体作为参照。

RNA的提取与反转录反应：按照RNA提取试剂盒说明配制试剂并进行RNA提取，应用Nano分光光度计测A值后，取1 μg RNA建立反转录体系，反转录条件为42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，3 ℃ 10 min，16 ℃ 5 min，使RNA反转录为cDNA。

实时定量PCR法：在GenBank上查找核苷酸序列，并应用blast软件设计引物并比对证实其特异性，引物序列见表1。

实时定量PCR的体系包括RNase-free水6μL，2× Mix 10 μL，cDNA 2 μL，引物2 μL。反应条件：反应阶段95 ℃ 10 min，循环阶段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45个循环，60 ℃时采集荧光信号，熔解曲线阶段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60℃ 15 s。

酶联免疫吸附试验(ELISA)：选取第6代人脂肪来源干细胞，吸弃各实验组含有血清的培养基，以D-Hank’s液洗涤3次，再换以等体积无血清培养基，经低氧环境培养24 h后，收集各实验组细胞上清液，使用ELISA试剂盒测定上清中肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子及角质细胞生长因子含量。方法参照试剂盒说明。100 μL标准品及样品加入已包被抗人肝细胞生长因子，血管内皮生长因子、神经生长因子、角质细胞生长因子单抗的96孔酶标板上，充分混匀置37 ℃ 2 h，常规洗板，加入生物素化的一抗置37 ℃ 1 h，洗板后加入酶标二抗37 ℃ 1 h，然后加入酶底物反应10 min终止，在450 nm处测吸光度。根据标准曲线计算相应肝细胞生长因子，血管内皮生长因子，神经生长因子，角质细胞生长因子表达量。

统计学分析：应用SPSS 17.0统计软件进行统计处理。计量数据以x(_)±s表示，组间比较用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD法。

P < 0.05表示差异有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义。

PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数定义为该样本的循环阈值(Ct)，每个样本的Ct值与该样本的起始拷贝数的对数存在线性反比关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。目的基因的扩增倍数表示为r=2^-??Ct，其中?Ct值=靶基因的Ct值-β-actin的Ct值，??Ct=实验组?Ct-对照组?Ct。

讨论

实验通过对比体积分数1%，3%，5%，10%，21%氧分压环境中人脂肪来源干细胞的细胞因子基因表达及蛋白分泌情况，认为低氧环境可以提高血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子mRNA的转录，促进血管内皮生长因子、肝细胞生长因子蛋白的分泌，其中以1%低氧分压最为显著，为低氧条件下培养人脂肪来源干细胞的选择提供了辅助信息。

随着组织工程学与再生医学的发展，干细胞在心血管疾病中的治疗作用日益受到关注。骨髓间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞，具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能，可能成为将来组织工程治疗及细胞治疗的一种理想选择。然而，传统的取骨髓方法会给患者带来痛苦，而且研究表明骨髓间充质干细胞存在恶性转化的安全隐患^[7]。Rosland等^[8]研究发现人骨髓间充质干细胞体外长期培养发生恶性转化率为45.8%，发生转化的细胞形态及表型均发生了改变，失去了分化能力，具有很强的致瘤性，接种到裸鼠体内形成肿块。Golfinopouloss等^[9]报道了1例14岁时确诊为急性髓细胞性白血病女患者，在接受了HLA 匹配的异基因骨髓移植后，于2006年该患者确诊患右乳腺癌，术后经遗传学分析证实乳腺癌细胞起源于患者的骨髓移植供者，而供者经检查完全健康。因此，骨髓间充质干细胞临床应用的安全性问题值得进一步深入的研究。

胚胎干细胞是来源于早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞的一种多能细胞，具有无限自我增殖的能力，在特定条件下可向3个胚层的组织和细胞分化。在新药开发、细胞组织器官的移植治疗和替代治疗、转基因动物与克隆上有着广阔的应用前景^[10-11]。然而，应用胚胎干细胞存在如何控制其定向分化，如何解决移植带来的免疫排斥反应等问题^[12-13]。除上述技术性问题外，影响胚胎干细胞应用的最大挑战是伦理问题^[14-15]，所以，将胚胎干细胞有效应用于临床研究还有许多需要克服的障碍。

与骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞相比，脂肪干细胞数量丰富、易于获取、具有良好安全性且不存在伦理争议，是理想的组织工程学种子细胞^[16-19]。脂肪干细胞不仅能够向成骨细胞、肝细胞、神经细胞、心肌细胞分化^[1^，^20-22]，并分泌多种细胞因子^[23-25]。基于上述原因，脂肪干细胞已成当前研究的热点。

依据已有文献报道，获取的脂肪干细胞源于脂肪组织中血管基质部，而该部分细胞成分复杂，使得一些关于脂肪干细胞的研究对象可能是混合的细胞群^[26-27]。目前，关于脂肪干细胞的细胞免疫表型缺乏统一标准，而这一标准的确立不仅使脂肪干细胞拥有特定的身份，并且将从血管基质部获取纯化的脂肪干细胞成为可能^[28]。本实验中，除检测公认的干细胞免疫表型标记物CD34，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA-DR外，针对有争议的CD54、CD71进行鉴定，这为核实脂肪干细胞免疫表型提供了参考依据^[29-30]。

干细胞移植后细胞存活率较低，有研究显示移植后24 h内，约有超过90%的干细胞坏死或凋亡，严重制约了干细胞的应用效果^[31]。因此，如何提高脂肪干细胞在缺氧环境中的存活能力成为当前研究的热点。目前，提高干细胞移植后存活率的方法有药物预处理^[32]，细胞因子预处理等^[33]。低氧预处理的脂肪干细胞在提高迁移能力、抗凋亡、分泌促血管新生细胞因子等方面有显著提高，而且体内各组织器官氧体积分数变化范围为4%-14%，脂肪组织中氧气浓度一般小于3%，因此脂肪干细胞处于低氧环境中^[34-36]。然而，干细胞培养通常是在正常氧分压条件下完成，这并不符合体内干细胞所在的低氧微环境。以往关于干细胞对低氧反应的研究，主要集中在胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞^[37-40]，关于低氧环境中培养脂肪干细胞的研究较少，因此，这也成为当前关于脂肪干细胞研究方向之一。

在低氧孵箱中培养脂肪干细胞，不仅可以观察到近似生理环境中的生存状态，并且研究显示低氧环境对干细胞的生物学特性有调控作用^[41-42]。Wagegg等^[43]通过对比20%和2%氧分压的培养环境发现低氧可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。Stubbs等^[44]在氧体积分数分别为20%、0.1%的环境中培养脂肪干细胞，发现低氧条件下培养的脂肪干细胞迁移能力及抗凋亡能力增强，低氧诱导因子1α基因表达增多，其下游的血管内皮生长因子A 和 SDF-1α的mRNA 表达增高，血管内皮生长因子A蛋白分泌合成增加。Lavrentieva等^[45]应用Western Blot技术对比1.5%、2.5%、5%氧分压条件下脐带间充质干细胞分泌低氧诱导因子1α蛋白的差异，培养72 h后发现1.5%低氧环境中低氧诱导因子1α分泌量明显增高，且与其他氧分压成明显的梯度变化，这与作者这次研究的实验结果一致。但考虑到细胞来源不同，培养时间不一致，且低氧分压的选取存在细微差别，故可能存在一定的差异。

在研究不同低氧分压对脂肪干细胞分泌促血管新生相关细胞因子中，作者发现经体积分数1%O₂培养的干细胞可高表达肝细胞生长因子、血管内皮生长因子，分析原因为肝细胞生长因子、血管内皮生长因子作为低氧诱导因子1α下游调控因子，当低氧信号作用于低氧诱导因子1α时，促使肝细胞生长因子、血管内皮生长因子的mRNA表达增多，相应蛋白分泌增多。此外，本实验首次将10%氧分压列为观察指标，实验结果提示低氧分压对干细胞生物学特性的影响可能存在某一阈值，即高于该阈值的氧分压不会引起干细胞扩增、迁移、分泌细胞因子能力的改变。

低氧促进脂肪干细胞分泌细胞因子、提高迁移及抗凋亡能力机制的研究是当前研究的热点方向。Stubbs等^[46]在氧体积分数分别为20%、0.1%的条件下培养脂肪源干细胞，两者在形态上均成纺锤状，把两者移入缺血缺氧环境后发现，缺氧条件培养的脂肪源干细胞无细胞质萎缩，迁移能力，抗凋亡能力增强。经低氧预处理的脂肪干细胞低氧诱导因子1α蛋白表达增加，其下游的靶向基因血管内皮生长因子A 和 SDF-1α的mRNA 增高，血管内皮生长因子A蛋白合成增加。血管内皮生长因子可激活磷脂酰肌3-激酶蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路^[47]，进一步调控凋亡基因p53、Bcl-2、Bax 等的表达, 以减轻细胞内钙超载和线粒体损伤等细胞凋亡启动因素, 发挥抗凋亡的内源性保护作用，使得脂肪源干细胞存活率提高。

Kim等^[48]发现活性氧，还原型辅酶Ⅱ氧化酶，磷酸化的血小板衍生生长因子β受到抑制后，脂肪干细胞的扩增与分化能力下降。然后进一步研究发现，中、低量活性氧可提高脂肪干细胞扩增、迁移以及再生能力^[49]。低氧条件下，NADPH氧化酶活化使脂肪源干细胞产生活性氧，定位于细胞核周围的Nox4优先表达，将其沉默后，脂肪干细胞的扩增与迁移能力降低，磷酰化的血小板衍生生长因子受体β，Akt活化等反应也消失。说明还原型辅酶Ⅱ氧化酶4在脂肪干细胞扩增迁移过程中发挥重要的作用^[50]。

低氧对调控干细胞生物学特性有着极为重要的作用，特别是在促血管新生方面意义重大^[51-52]。由于心肌梗死造成的缺血微环境使得大量心肌细胞死亡，将经低氧条件下培养的脂肪干细胞植入该环境中，脂肪干细胞通过产生大量的促血管新生细胞因子进而发挥旁分泌效应，逐渐形成微血管，对改善梗死区域的缺血状况，恢复心功能产生积极的影响^[5^，^53-55]。

受实验条件的制约，本研究也存在一定的局限性，如细胞孵育箱能够达到的最低氧分压为1%，无法观察到低于1%氧分压的细胞生存状态，在比较更低氧分压条件人脂肪来源干细胞的生物学特性上存在不足。此外，实验仅研究了血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子、角质细胞生长因子4个细胞因子的分泌及表达，对于全面分析评价低氧条件下人脂肪来源干细胞的生物学特性还有很大的差距。

依据现有实验条件及结果，作者认为低氧环境，特别是在1%氧分压环境中，人脂肪来源干细胞可大量转录肝细胞生长因子、血管内皮生长因子mRNA并分泌相应的蛋白，可以为临床应用细胞因子治疗疾病提供快捷途径。然而，利用低氧条件下培养的人脂肪来源干细胞治疗急性心肌梗死，人脂肪来源干细胞能否在急性心肌梗死的恶劣微环境中存活下来，即低氧环境培养能否提高人脂肪来源干细胞的抗凋亡能力，何种低氧环境下培养的人脂肪来源干细胞具有最为明显的抗凋亡能力，需要进一步研究与探讨。

不同氧分压时人脂肪干细胞细胞因子的分泌

Influence of different oxygen partial pressures on cytokines secreted from human adipose-derived stem cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta 分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(在线): 3-.
[2]	毛振立, 宋振全, 张海松, 刘恩智. 8-羟基-2-(二丙基氨基)四氢萘干预弥漫性轴索损伤模型大鼠低氧诱导因子1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1238-1242.
[3]	陈劲松, 王中汉, 常非, 刘贺. 多种特殊状态下关节软骨缺损修复的组织工程技术[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1272-1279.
[4]	乔雪松, 陈霓, 杨风英, 牛燕媚. 运动调控间充质干细胞来源骨髓脂肪细胞的作用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1293-1298.
[5]	张圣敏, 刘超. 生物支架材料诱导脂肪来源干细胞成骨分化的最新热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1107-1116.
[6]	王田田, 王建忠. 骨髓间充质干细胞治疗早期股骨头坏死的应用与前景 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1117-1122.
[7]	王张玲, 余丽梅, 赵春华. 间充质干细胞线粒体转移治疗修复组织损伤的作用 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1123-1129.
[8]	邓俊豪, 李苗, 张里程, 唐佩福. 三维悬滴法培养间充质干细胞在组织损伤修复中的应用及优势[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1101-1106.
[9]	任春梅, 刘玉芳, 许诺, 邵苗苗, 何建亚, 李晓杰. 非编码RNAs在人牙髓干细胞中的调控作用及机制 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1130-1137.
[10]	黄文文, 李硕, 侯宗柳, 王文举. 炎症性肠病发病机制及间充质干细胞治疗的作用与问题 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1138-1143.
[11]	何林, 白晋伟, 苏伟. 基于Scopus数据分析多能干细胞研究领域的文章、作者及高影响力机构[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1144-1148.
[12]	刘春栋, 申晓青, 张艳丽, 张小根, 吴补领. 钛表面锶改性后骨髓基质干细胞黏附、迁移、增殖及成骨相关基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1009-1015.
[13]	林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.
[14]	陈钢泓, 曾超明, 陈梓铭, 廖俊星, 马元琛, 郑秋坚. 骨髓间充质干细胞关节腔注射治疗兔软骨缺损的最适浓度[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 996-1001.
[15]	张文, 雷堃, 高磊, 李宽新. 慢病毒介导骨形态发生蛋白7基因转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 985-990.