应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.002

中国组织工程研究

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体

何保丽^1，2，马丽花³，陈丽玲^1，2，刘汝文²，杨仁华²

1扬州大学兽医学院，江苏省扬州市 225009；2昆明医科大学实验动物学部，云南省昆明市 650500；3解放军成都军区昆明总医院临床实验科，云南省昆明市 650032

修回日期:2013-08-01 出版日期:2013-11-05 发布日期:2013-11-05
通讯作者: 杨仁华，硕士，昆明医科大学实验动物学部，云南省昆明市 650500 Yangrhua@hotmail.com
作者简介:何保丽☆，女，1978年生，云南省昆明市人，扬州大学兽医学院在读博士，主要从事疾病模型及致病机理研究。 hbl117@sina.com 并列第一作者：马丽花，解放军成都军区昆明总医院临床实验科，云南省昆明市 650032
基金资助:
云南省科技计划项目(2013FZ071)*

Establishment of human-rhesus chimeric liver using adult bone marrow mesenchymal stem cells

He Bao-li^{1, 2}, Ma Li-hua³, Chen Li-ling^{1, 2}, Liu Ru-wen², Yang Ren-hua²

1School of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China; 2Department of Experimental Animals, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 3Department of Clinical Laboratory, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Revised:2013-08-01 Online:2013-11-05 Published:2013-11-05
Contact: Yang Ren-hua, Master, Department of Experimental Animals, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China Yangrhua@hotmail.com
About author:He Bao-li☆, Studying for doctorate, School of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China; Department of Experimental Animals, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China hbl117@sina.com Ma Li-hua, Department of Clinical Laboratory, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Kunming 650032, Yunnan Province, China He Bao-li and Ma Li-hua contributed equally to this work.
Supported by:
the Scientific and Technological Plan of Yunnan Province, No. 2013FZ071*

摘要/Abstract

摘要：

背景：建立人骨髓间充质干细胞与猴的嵌合体肝脏对研究干细胞体内增殖与分化具有重要意义。
目的：应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体动物模型。
方法：分离成人骨髓间充质干细胞，纯化并培养至6代，使细胞量大于5×108。转染绿色荧光蛋白基因标记后在B超引导下移植到妊娠10周的胎猴肝脏中，幼猴出生后1个月和3个月，穿刺取肝脏组织活检，切片后荧光显微镜观察带绿色荧光的人源细胞数量及分布，免疫组织化学染色法检测人白蛋白的表达。
结果与结论：荧光显微镜观察发现，幼猴出生后1个月及3个月均发现有人源骨髓间充质干细胞在肝脏内存活，并发生迁移，分布趋向于集中。免疫组织化学检测发现，幼猴出生后1个月及3个月肝脏内有表达人白蛋白的细胞存在，分布与带有绿色荧光的细胞较为一致。提示应用成人骨髓间充质干细胞在猴胚胎早期能够建立人-猴肝脏嵌合体，人源性骨髓间充质干细胞可在猴肝中分化成具有合成白蛋白功能的细胞。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 人-猴肝脏嵌合体, 白蛋白, 绿色荧光蛋白, B超, 动物模型, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Human-mammal chimeric liver chimera has been a vital significance for the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To establish an animal model of human-rhesus chimeric liver using adult bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Adult bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, purified and cultured for the sixth generation. The number of bone marrow mesenchymal stem cells was no less than 5×108. Bone marrow mesenchymal stem cells labeled with green fluorescent protein were transplanted into the liver of the embryo rhesus with pregnancy of 10 weeks under guided by type-B ultrasound. At the 1st and 3rd months of birth, the liver tissue of the infant rhesus was taken for biopsy. After routine pathological section, histological specimens were observed under fluorescence microscope to confirm if there were adult bone marrow mesenchymal stem cells positive for green fluorescent protein and their distribution, and detected by immunohistochemical staining to identify if human albumin expressed in the liver of infant rhesus.
RESULTS AND CONCLUSION: Fluorescence microscope observation indicated that at the 1st and 3rd months after birth, there were surviving bone marrow mesenchymal stem cells derived from human with green fluorescence in the liver of infant rhesus, and these cells migrated to form more concentrated distribution. The immunohistochemical results demonstrated that functional liver cells expressing human albumin were observed in the liver of infant rhesus at the 1st and 3rd months after birth, and their distribution was in accordance with bone marrow mesenchymal stem cells with green fluorescence. Human-rhesus chimeric liver can be established using adult bone marrow mesenchymal stem cells, which can generate functional liver cells in the liver of infant rhesus.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cell transplantation, chimera, green fluorescent proteins

中图分类号:

R394.2

何保丽，马丽花，陈丽玲，刘汝文，杨仁华. 应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.002.

He Bao-li, Ma Li-hua, Chen Li-ling, Liu Ru-wen, Yang Ren-hua. Establishment of human-rhesus chimeric liver using adult bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.002.

图/表（结果） 6

2.1 成人骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定结果见图1，2。

骨髓细胞经1.073 g/mL的人淋巴细胞分离液分离后，细胞大多呈圆球形，大小差异很大。培养48 h后，可以看到有细胞呈梭形贴壁生长，见图1A。4 d后，细胞逐渐增多，呈克隆样生长，见图1B；10 d左右，细胞生长连成片，见图1C，覆盖瓶底超过80%，用胰蛋白酶消化后传代。细胞传至6代，细胞呈典型的梭形状态，生长极性较为一致。
小鼠抗人CD34及抗人CD105对第3代骨髓间充质干细胞经免疫细胞化学染色，细胞表达CD105而不表达CD34，见图2。
2.2 绿色荧光蛋白标记成人骨髓间充质干细胞成人骨髓间充质干细胞用包含绿色荧光蛋白慢病毒载体的培养液培养48 h后，在荧光显微镜下绿色荧光清晰可见，主要集中于细胞核周围的细胞质内，远离细胞核，荧光逐渐减弱，见图3。

2.3 B超引导下胎猴肝脏穿刺结果在B超引导下，穿刺针准确进入胎猴的肝脏内，见图4，图中箭头示穿刺针进入胎猴肝脏的位置。

2.4 成人骨髓间充质干细胞在嵌合体肝脏中的分布
对照组未移植成人骨髓间充质干细胞，在荧光显微镜下未发现具有绿色荧光的细胞，见图5A。
绿色荧光蛋白标记的细胞进入胎猴肝脏形成人-猴嵌合体肝脏，荧光显微镜下可以看到幼猴出生1个月后标记绿色荧光的成人骨髓间充质干细胞细胞在猴肝脏内散在分布较为均匀，见图5B；出生后3个月，标有绿色荧光的骨髓间充质干细胞分布较为集中，亮度明显增强，见图5C。

2.5 人-猴嵌合体肝脏中白蛋白的表达成人骨髓间充质干细胞在人-猴嵌合体肝脏中的分布较为一致，对照组未移植人骨髓间充质干细胞，在猴肝脏内没有发现人源白蛋白表达，见图6A。
而在移植了成人骨髓间充质干细胞的实验组人-猴嵌合体肝脏内，幼猴出生1个月就发现有人的白蛋白表达。从免疫组织化学染色结果来看，表达人白蛋白阳性细胞在出生后1个月的幼猴嵌合体肝脏内散在分布，大部分呈弱阳性表达，小部分表达阳性较强，见图6B。
3个月后，表达人白蛋白的阳性细胞分布集中，而且表达量有所增加，见图6C；从放大的显微照片上可以看出白蛋白表达集中于细胞质内，特异性很好，见图6D。

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引言

骨髓间充质干细胞是一种来源丰富、易于分离和体外培养的多能干细胞^[1]。从生物胚胎发育来看，骨髓间充质干细胞来自于中胚层的胚细胞。近年的研究表明，骨髓间充质干细胞可以分化为中胚层来源的细胞及组织，诸如肝细胞、脂肪细胞、神经细胞以及成骨细胞等^[2-3]。

人类疾病的动物模型是基础医学研究的重要平台，利用可以分化为多种功能细胞的多能干细胞-骨髓间充质干细胞建立嵌合体器官的动物模型，可以直接研究干细胞在嵌合体内的增殖和分化，克服体外实验研究骨髓间充质干细胞的分化与组织重建缺乏体内微环境的各种因素的相互作用，得到的研究数据无法直接应用于体内对骨髓间充质干细胞增殖与分化的调控，在干细胞分化与应用研究中具有不可替代的重要作用^[4]。同时，在人源细胞嵌合体动物模型中研究影响人类健康的重大传染且自然宿主狭窄性疾病，如艾滋病和乙型肝炎等，可解决由于病毒不能在常规实验实物体内感染复制并引起病变的研究瓶颈^[5-6]，具有重大意义。随着人源细胞嵌合体研究的深入，如能培育出高纯度的人源细胞的嵌合体器官有望应用于人体的器官移植，解决器官移植中供体器官严重短缺的难题^[7]。人源干细胞只有在受体动物没有建立有效的免疫屏障或者免疫缺陷时，植入的干细胞才能不被受体免疫系统清除而得以生长、增殖、迁移及分化，最终形成嵌合体^[8]。目前干细胞植入受体动物形成嵌合体的研究主要集中于两方面：免疫缺陷的小鼠和大型动物的早期胚胎。目前利用大型动物建立嵌合体动物研究最多的动物是羊^[9]，Almeida-Porada等^[10]利用早期羊胚胎移植人源后肾间充质干细胞研究其体内分化，证实人源干细胞可在羊体内长期存活。Liechty等^[11]研究了间充质干细胞在绵羊体内的分化，发现进入绵羊体内的间充质干细胞可以分化为软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等。

恒河猴(rhesus)是一种代谢与生理特征与人类比较接近的非人灵长目动物，利用其建立人源骨髓间充质干细胞器官嵌合体，研究骨髓间充质干细胞活体内器官微环境下作用的定向分化具有重要意义^[12]。实验分离成人骨髓间充质干细胞后纯化培养，利用绿色荧光蛋白转染后，移植进入恒河猴中早期胎猴肝组织内，观察移植后骨髓间充质干细胞进入宿主肝脏后的增殖和迁移情况，并利用免疫组织化学染色法鉴定骨髓间充质干细胞是否分化为有功能的肝细胞。

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2012年5月至2013年3月在昆明医科大学实验动物学部及解放军成都军区昆明总医院影像科完成。

材料：经昆明医科大学医学与动物伦理委员会批准，详细告知骨髓捐献者骨髓的用途及该研究的意义，在其充分知情同意后，采集骨髓2例，男女各1例，年龄：男25岁，女22岁。2名捐献者身体健康，无既往病史。

健康怀孕恒河猴4只，怀孕(10±1)周，由昆明医科大学实验动物学部提供，实验动物使用许可证号：SYXK(滇)2011-0004。

应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体所用的试剂及仪器：

实验方法：

人骨髓间充质干细胞的采集分离、培养及鉴定^[13-14]：骨髓捐献志愿者侧卧于床上，背对采集者并蜷屈上方的一条腿。采集者找准髂后上瘠并常规消毒后，用16^#骨髓穿刺针进行骨髓穿刺，抽取骨髓约5 mL。以下工作在层流细胞工程实验室内严格按无菌操作完成，骨髓移入15 mL离心管，加pH 7.4 PBS至15 mL，混匀后1 800 r/min离心5 min，以除去骨髓中的血浆及脂肪；骨髓细胞移至另一只装有10 mL密度为1.073 g/mL的人淋巴细胞分离液的离心管中，以pH 7.4 PBS补足15 mL，2 500 r/min离心15 min，除去上清液，小心吸取分离液层上面的白色细胞层到另一只15 mL离心管内，吸取时尽量避免吸入分离液；加入pH 7.4 PBS补足15 mL后混匀，1 800 r/min离心5 min后弃上清；加入pH 7.4 PBS至15 mL洗涤细胞后离心，重复3次。将细胞移到含体积分数10%胎牛血清的MEM/F12培养基10 mL的75 cm²培养瓶中，37 ℃体积分数5% CO₂培养48 h，弃未贴壁的细胞，并加入37 ℃预热的pH 7.4 PBS到细胞面上，摇晃培养瓶洗涤细胞后，加入新鲜的含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基10 mL继续培养；每3 d换1次培养液，至细胞长满瓶底的80%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后1∶2传代^[15-16]。取3代的骨髓间充质干细胞，参照马丽花等^[17]骨髓间充质干细胞免疫细胞化学鉴定方法，以大鼠成纤维细胞作为空白对照，使用抗人CD34和CD105抗体进行免疫细胞化学染色鉴定，以细胞胞浆内或胞膜出现棕褐色颗粒为阳性。

绿色荧光蛋白标记成人骨髓间充质干细胞^[17]：含有绿色荧光蛋白的慢病毒载体HEK-293包装细胞用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基扩增培养，使培养液中病毒滴度达到1×10⁸TU/mL以上，收集培养液^[7-8]。当骨髓间充质干细胞培养至6代，细胞总数达到5×10⁸以上，满足移植所需的细胞量，用上述含10%慢病毒的培养液和体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，对骨髓间充质干细胞进行绿色荧光蛋白标记。经48 h培养后，荧光显微镜观察确定绿色荧光蛋白的标记情况。

骨髓间充质干细胞移植进入胎猴肝脏组织：实验由解放军成都军区昆明总医院特诊科B超室医生帮助完成。在B超引导下，将穿刺针刺破孕猴的皮肤、腹壁及子宫，刺入胎猴的肝脏，2只孕猴分別用注射器缓慢推入含经绿色荧光蛋白标记，经血球计数板计数细胞量5×10⁸以上的骨髓间充质干细胞的生理盐水1 mL，推完后再推入不含细胞的生理盐水1 mL，以确保所有细胞均进入胎猴肝脏；另外2只孕猴在同样条件下分别推入2 mL生理盐水作为正常对照。

骨髓间充质干细胞在幼猴肝内分布观察：实验由解放军成都军区昆明总医院特诊科B超室医生帮助完成。待孕猴分娩后，幼猴在B超引导下分别于出生后1个月和3个月分别进行肝脏穿刺活检。肝脏穿刺取出的肝脏组织立即用40 g/L多聚甲醛溶液进行固定至少30 min，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明石蜡包埋切片后，脱蜡、复水并用5 g/L的chicago sky blue 6B溶液浸泡10 min以去除自发荧光^[18]，以等体积的甘油和pH 7.4 PBS混合液为封固液封固后，置于荧光显微镜下观察。

成人骨髓间充质干细胞在猴肝脏内分化为有功能的肝细胞鉴定：前述猴肝脏组织切片复水后，根据免疫组织化学染色试剂盒提供的说明书进行猴肝脏组织抗人白蛋白的鉴定^[19]。切片经pH 7.4 PBS浸洗3次，加入过氧化氢室温孵育15 min；pH 7.4 PBS浸洗2遍；加入“Ultra V block”试剂室温孵育5 min；pH 7.4 PBS浸洗3次，加入1∶500稀释的小鼠抗人albumin抗体，空白对照加入不含抗体的稀释液，4 ℃孵育过夜；pH 7.4 PBS浸洗3次，加入“Biotinylated goat anti-polyvlent”试剂室温孵育20 min；pH 7.4 PBS浸洗4次，加入“Streptavidin peroxidase”室温孵育20 min；pH 7.4 PBS浸洗4次，DAB显色。免疫组织化学染色片经脱水、透明后制成永久封固用显微镜观察并拍照，以细胞胞浆内或胞膜出现棕褐色颗粒为阳性。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞分离及培养中细胞形态。②经绿色荧光蛋白标记后是否有绿色荧光及其分布。③肝组织切片是否有绿色荧光蛋白、Albumin阳性细胞及其分布。

讨论

嵌合体(Chimera)一词来源于希腊语，是指一个个体由2种或2种以上不同遗传性状细胞或组织组成^[20-21]。自1961年Tarkowski用8细胞胚聚合法成功培育出第一只嵌合体小鼠以来，嵌合体动物模型日益在医学生物学的研究中发挥重要的作用^[9]。

利用胚胎早期尚未建立有效免疫屏障移植异源细胞，诱导受体动物的免疫耐受是建立大型动物嵌合体的主要方法^[22-23]，早期胚胎对供体细胞不能有效免疫排斥，可以形成免疫耐受，使植入的异源细胞在嵌合体中争得必要的存活空间。理论上越早移植，异源细胞的存活概率越大^[24]，但受到胚胎大小的影响，太早移植胚胎太小，特别是本文中对胚胎肝脏移植更要求胚胎应发育到一定程度才能准确定位进行间充质干细胞胚胎肝内注射。经过作者对不同怀孕期胎猴及其肝脏大小的观察及评估，认为怀孕期(10±1)周为移植比较理想的时期。

骨髓间充质干细胞是中胚层来源的多种功能干细胞，目前研究表明其细胞表面表达CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC和UEA-Ⅰ，而不表达CD34、CD45和HLA-DR^[25-27]，这与作者实验中的免疫细胞化学染色鉴定结果一致。由于骨髓间充质干细胞具有易于分离和培养且体外培养增殖速度快的优势，而成为组织工程与再生医学研究中重要的种子细胞^[28-29]。但是，目前对骨髓间充质干细胞的分化能力与定向诱导分化的研究大多采用体外实验方法，缺乏体内环境中细胞与分子间的相互作用，结果不能够直接反映骨髓间充质干细胞体内的分化能力及其机制^[30-32]。

本实验采用成人骨髓间充质干细胞在尚未建立有效的免疫屏障前移植进入胎猴肝脏内，研究其在幼猴体内存活、迁移及在肝脏微环境作用下向功能性肝细胞分化的能力。

绿色荧光蛋白是一种由238个氨基酸残基组成的能够在紫外光激发下发出绿色荧光的蛋白质，利用携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体转骨髓间充质干细胞方法进行绿色荧光蛋白标记操作简单且转染效率高表达较为稳定，而且该方法转染的病毒DNA不整合到骨髓间充质干细胞基因组中，对骨髓间充质干细胞的生物学特征没有明显影响。

因此使用绿色荧光蛋白标记对植猴肝脏的骨髓间充干细胞进行示踪可以长期跟踪其在嵌合体肝脏中的分布和迁移情况是一种较为理想的方法^[33-36]。以5 g/L的chicago sky blue 6B溶液浸泡处理可有效去除组织的自发荧光^[18]，避免其对绿色荧光蛋白标记细胞观察的干扰，使转染绿色荧光蛋白进行细胞标记示踪的应用范围更加扩大，观察结果更加准确。白蛋白主要由功能性的肝实质细胞分泌，其他组织和细胞分泌极少，是检测肝功能细胞最常用及最可靠的指标^[37-38]。实验中使用的鼠抗人白蛋白抗体无强烈的人-猴交叉反应，这为检测成人骨髓间充质干细胞进入嵌合体肝脏后是否分化成有功能的肝细胞提供了便利。

文章通过细胞量超过5×10⁸的成人骨髓间充质干细胞移入10周胎龄的胎猴肝脏，在其出生1个月肝穿刺活检中发现无论是绿色荧光蛋白标记显示的人源骨髓间充质干细胞还是应用免疫组织化学染色法检测能够表达人白蛋白的细胞都呈现散在分布；但是到第3个月二者的检测结果呈现成人源骨髓间充质干细胞及表达人源白蛋白的细胞呈集中分布，白蛋白的表达较第1个月有所增强。原因可能有二：其一，某些部位的人源骨髓间充质干细胞在进入嵌合体肝脏后，不具有生长优势，随着幼猴出生后建立了免疫功能，最终被猴的免疫系统清除，而生长优势部位的骨髓间充质干细胞则增殖并分化为更多的人源肝细胞；其二，人源骨髓间充质干细胞在某些趋化因子作用下发生迁移^[39-40]，到达特定的部位集中分布，增殖、分化成人源肝细胞^[41]。具体的机制还有待进一步的研究阐明。

文章结果表明，成人骨髓间充质干细胞移植进入孕期10周的胎猴肝脏后，由于胎猴此时尚未建立有效免疫屏障，人源骨髓间充质干细胞在其肝内能够存活。同时肝脏微环境为骨髓间充质干细胞的分化提供了有利条件，骨髓间充质干细胞能够定向分化形成能够表达白蛋白的肝细胞，形成人-猴肝脏嵌合体。

但是这次实验的嵌合体肝脏中，人源的肝细胞数量远小于猴的肝细胞且分化机制尚不清楚，在进一步研究中应解决如何提高进入胎猴肝脏的人骨髓间充质干细胞细胞存活率及其向功能性肝细胞分化的机制和效率。

实验证实应用成人骨髓间充质干细胞移植进入猴胚胎肝脏内，骨髓间充质干细胞在肝脏微环境作用下定向分化为肝细胞建立人-猴肝脏嵌合体的可行性，随着后续研究的深入在提高进入胎猴肝脏的人源骨髓间充质干细胞的存活率及其向肝细胞定向分化机制和效率，使人源肝细胞在嵌合体的比例大幅提高，超过猴源肝细胞，人-猴肝嵌合体有望成为一个肝炎病毒以及肝毒性药物理想的研究平台，并可能成为人体肝脏在移植供体的潜在来源。

应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体

Establishment of human-rhesus chimeric liver using adult bone marrow mesenchymal stem cells

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