体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化：两种方法的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的方法较多，而采用不同诱导方法时间充质干细胞在体外分化成神经细胞的比例是不一样的。适宜的诱导条件是实现间充质干细胞定向诱导分化的必要条件。
目的：比较两种常见的化学诱导法与共培养法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的差异，以寻找一种诱导效果高、实用的骨髓间充质干细胞体外诱导方法。
方法：采用密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，分别用化学诱导法和共培养法诱导分化比较两种方法所获得的神经细胞数目、细胞形态和特异性抗体阳性率。
结果与结论：培养7 d后两组均可见大量贴壁细胞形成突起，呈放射状生长，神经元特异性烯醇化酶染色均为阳性。共培养法第5天可见典型神经细胞结构，突起数量较多，神经元特异性烯醇化酶染色阳性率(50.82±2.46)%，化学诱导法培养第7天可见神经样细胞形成，并有突起，神经元特异性烯醇化酶染色阳性率(43.56±1.74)%。说明骨髓间充质干细胞经共培养法诱导分化后的神经样突起数量多并较早互相形成连接，且共培养法神经元特异性烯醇化酶染色阳性率高于化学诱导法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 神经细胞, 诱导分化, 共培养, 化学诱导法, 神经元特异性烯醇化酶, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: A variety of methods have been used to induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into nerve cells. However, the percent of differentiated nerve cells is different using varied induction methods for different time periods. Appropriate induction condition is essential for induced differentiation of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To find a suitable and practical method of inducing bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells in vitro by comparing chemical induction and co-culture methods.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by density gradient method and cultured by chemical induction and co-culture methods, respectively. Cell number, cell morphology, and specific cell surface markers were compared.
RESULTS AND CONCLUSION: A large number of adherent cells with processes and radial growth, positive for neuron specific enolase staining were observed in both groups. Cells with typical nerve cell structure and a large number of processes were observed at 5 days in co-culture group, and the positive rate for neuron specific enolase staining was (50.82±2.46)%. Neural-like cells with processes were found at 7 days in chemical induction group, and the positive rate for neuron specific enolase staining was (43.56±1.74)%. Results showed that bone marrow mesenchymal stem cells were inducted into neural-like cells with more processes, which formed connection earlier cultured in co-culture compared with chemical induction. Moreover, the positive rate for neuron specific enolase staining was higher in co-culture group compared with chemical induction group.

Key words: stem cells, cell differentiation, neurons, mesenchymal stem cell transplantation

中图分类号:

R394.2

徐丽丽，匡弢，张佳. 体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化：两种方法的比较[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.45.001.

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图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞的培养利用淋巴细胞分离液分离骨髓血可得到明显的白膜层，接种到培养瓶中的白膜层细胞在第两三天时开始贴壁，两端有较长突起，胞核卵圆形，细胞呈克隆样生长，形成大小不一的集落，起初生长较慢，2周左右达到80%-90%汇合。传代后细胞呈均匀分布生长，形态为长梭形，见图1，倍增时间两三天。经分离液培养的骨髓间充质干细胞经反复传代，仍能保持多向分化潜能，且纯度可达到90%以上^[25-27]。

2.2 骨髓间充质干细胞的细胞表面标志物表达流式细胞仪检测显示，骨髓间充质干细胞强表达透明质酸受体CD44，阳性率均大于99%；不表达造血干细胞标志CD34 (<1%)，见图2，3。

2.3 神经细胞的分离培养培养2 d后，神经细胞大部分已贴壁，胞体饱满，多呈纺锤形，胞质透亮，细胞胞体伸出小的突起，生长状态良好。有些细胞胞体扁平，体积较大，伸出1个或多个棒状的大突起，此为胶质细胞。培养六七天后，神经细胞的胞体增大，呈圆形或椭圆形，胞体周围的突起充分伸展并延长，形成单极、双极或多极突起。
2.4 细胞共培养结果六孔板接种有神经细胞的共培养体系中，培养第3天可观察到骨髓间充质干细胞的形态学变化原来扁平的细胞收缩变小，胞体大多圆形，形成突起，细胞逐渐变成星状。第四五天后星状细胞数目逐渐增多，并可互相形成连接，具有神经样形态结构，见图4，网格计数神经样细胞占全部细胞比例为60.2%，免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶阳性，见图5，阳性率(50.82±2.46)%，表现神经元细胞的特性；而对照组的骨髓间充质干细胞培养8 d时，大部分细胞依然是骨髓间充质干细胞扁而宽的形态特点未形成神经样形态结构，免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶阴性。

2.5 骨髓间充质干细胞化学诱导培养结果化学诱导组第两天后细胞球贴壁，第三四天可见细胞胞体进一步收缩，形成圆形、三角形，向周围生长，第五六天有的细胞形成较长突起，而且发出分支，相互延伸，终末端有类似神经元细胞的终结，长轴突出现，呈现神经细胞样形态，见图6。网格计数神经样细胞占全部细胞比例为52.6%，免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶阳性，阳性率(43.56±1.74)%。

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引言

骨髓间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞，存在于骨髓腔内的多潜能干细胞，同时具有独特的免疫学特征，是理想的组织工程种子细胞^[1]。其具有高度自我更新和多向分化能力被广泛应用于再生医学行列^[2]。骨髓间充质干细胞可在体内外分化为神经细胞、成骨细胞和脂肪细胞。神经细胞移植已为多种中枢神经系统疾病的治疗带来希望。骨髓间充质干细胞在来源广泛，取材方便，增殖能力强等方面显示其优越性。近年来发现骨髓间充质干细胞可以经不同因素诱导，分化为具体的神经元如胆碱能神经元、胺能神经元、氨基酸能神经元、肽能神经元^[3-4]。最新研究表明骨髓间充质干细胞可以在受损的脑组织及脊髓中生存、增殖、迁移以及分化成神经样细胞，从而有效提高脊髓损伤、脑卒中等神经系统疾病的神经学功能，从而改善患者生存状态^[5-6]。目前向神经细胞诱导方法较多，而采用不同诱导方法，间充质干细胞在体外分化成神经细胞的比例是不一样的。适宜的诱导条件是实现间充质干细胞定向诱导分化的必要条件。目前已有Woodbury等^[7]在体外用BME、3-叔丁基-4、羟基茴香醚(BHA)和DMSO成功地诱导人间充质干细胞转变为神经元样细胞。Sanchez-Ramos等^[8]研究骨髓间充质干细胞分化为神经元的方法是通过建立以神经营养因子Ⅴ为基础的体外化学诱导剂的培养体系。还有Kopen等^[9]将骨髓间充质干细胞注入新生大鼠侧脑室后发现其可分化为神经细胞，并具有一定的迁移能力，骨髓间充质干细胞可以在一定微环境中定向分化为神经细胞。与分泌神经营养因子的神经细胞共培养也是重要的诱导方式。Buzanska等^[10]将脐血来源的巢蛋白阳性细胞与大鼠脑原代皮质共培养4 d后约40%细胞分化为神经元，约30%细胞分化星形胶质细胞，11%细胞分化为少突胶质细胞。这种条件更接近神经细胞生长发育过程的生理状态。综合目前比较常见的诱导分化方法一种是化学诱导法，目前常用的抗氧化剂诱导、生长因子诱导及增加细胞内cAMP的方式诱导^[11-13]；另外一种方法是共培养法即利用间充质干细胞所处微环境定向诱导分化^[14-22]。实验通过两种诱导方法的比较，找出一种更简便，经济实用的方法，为临床神经再生应用提供可借鉴的实验参考数据。
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材料方法

设计：细胞形态学观察。

时间及地点：于2011年9月至2012年10月在青岛大学医学院实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级成年雄性SD大鼠12只，鼠龄6-8周，体质量280-320 g，用于取股骨骨髓血和脑组织，山东实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(鲁) 20050016。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化实验的主要试剂：

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养：参照Azizi等^[23]方法，在无菌条件下取大鼠股骨骨髓血2 mL，肝素抗凝后与 2 mL PBS混匀，然后按1∶1的比例缓慢加入2 mL的Percoll淋巴细胞分层液中，离心半径10.0 cm， 2 000 r/min离心10 min，吸取其云雾状白膜层，PBS冲洗稀释后1 000 r/min离心10 min，共2次。离心后的沉淀细胞加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM (LG-DMEM)培养液制成单细胞悬液后接种于培养瓶中，37 ℃，体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养，72 h后弃取未贴壁细胞，以后每3 d换液1次。当细胞汇合85%单层贴壁细胞后，0.25%胰蛋白酶室温消化传代，离心 (1 000 r/min，10 min)，弃上清，沉淀按1∶1比例接种传代。

骨髓间充质干细胞的细胞表面标志物鉴定：取第3代细胞胰酶消化后调整细胞浓度为1.0×10⁹ L^-¹，每管分装为0.2 mL后分别加入鼠抗人抗体CD44 抗体、CD34抗体免疫荧光鉴定。对照组加入Fitc、PE各0.04 mL、0.02 mL，4 ℃避光反应30 min，1 500 r/min离心后加入多聚甲醛0.2 mL避光保存，流式细胞仪检测。

共培养法诱导分化：无菌条件下取大鼠脑组织迅速称质量，加入低糖DMEM，置冰上10 min，于完全培养液中剪切、吹打，4 ℃，过40 μm 滤网，收集上清液，调整细胞浓度为(5-10)×10⁵ L^-¹，悬液培养24 h即有细胞贴壁，半量换液后去除非贴壁细胞，体积分数10%FBS的高糖DMEM培养液中继续培养，可见贴壁细胞呈网状生长；每两三天半量换液1次，第7天可见典型神经细胞结构^[24]。

将神经细胞按1×10⁶的密度接种于Transwell双层培养皿的底层，同时将Transwell培养皿的insert中接种上骨髓间充质干细胞，insert内的培养液与六孔板中的培养液可互通流动，共同培养基为LG-DMEM；而对照组中Transwell双层培养皿内接种的都为骨髓间充质干细胞，单纯的LG-DMEM培养。观察细胞形态变化及免疫荧光观测神经特异性烯醇化酶的表达。

化学诱导分化：取体外扩增第3代后的间充质干细胞，按1×10⁸ L^-¹浓度接种于放置有消毒盖玻片的6孔板内，制备细胞爬片，每孔分别加含体积分数为10%的无血清培养基血清替代物、低糖DMEM 2 mL，达到60%-70%融合时，换成含3 mmol/L β-巯基乙醇的培养基预诱导24 h，PBS(pH 7.4)洗涤，然后换成含20 g/L二甲基亚砜、200 mmol/L丁化羟基苯甲醚的无血清培养基进行诱导。对照组间充质干细胞单纯LG-DMEM培养。

神经元特异性烯醇化酶免疫组化鉴定：分别取共培养法和化学方法诱导后的细胞经40 g/L多聚甲醛室温下固定1 h，PBS冲洗3次，体积分数0.3%过氧化氢室温下封闭10 min，PBS冲洗3次，37 ℃山羊血清封闭15 min，神经元特异性烯醇化酶一抗(1∶100稀释)孵育37 ℃ 1.5 h，PBS冲洗3次，加入生物素标记的二抗37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，加入辣根过氧化物酶37 ℃孵育45 min，PBS冲洗3次，DAB显色4 min，PBS中止显色，苏木精复染，倒置显微镜下观察，胞质棕黄色为阳性细胞，随机计数10个非重叠视野(×100)，计算神经元特异性烯醇化酶阳性细胞分别占视野中计数细胞总数的比例(阳性百分率=阳性细胞数÷细胞总数，复片5次)，结果用x(_)±s表示。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞形态观察。②骨髓间充质干细胞表面标志物的鉴定。③骨髓间充质干细胞向神经细胞分化能力。④化学诱导法和共培养法的阳性细胞数目形态的比较。

统计学分析：骨髓间充质干细胞经过定向诱导、细胞固定后进行Nestin免疫荧光染色，利用Image Pro Plus6.0图像分析软件分析每个观察视野nestin阳性细胞所占比率，添加诱导因子者作为实验组，阴性对照组未添加任何因子，每组各分析3个培养孔，每孔10个视野。结果以x(_)±s表示，两组间的比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在中枢神经系统，神经胶质细胞可再生，往往在神经系统损伤后形成胶质斑痕，而神经元再生能力差，一旦受损则很难恢复。近年大量研究应用干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤及缺血性脑卒中，其神经系统的功能恢复均优于对照组，这就为骨髓间充质干细胞自体移植治疗神经系统疾病提供了可靠的实验依据^[28-30]。目前研究重点是如何将骨髓间充质干细胞转化为神经元所占比例高而又能够稳定存在的神经细胞。骨髓间充质干细胞在体外培养条件下具有低免疫原性的特点。在特定的微环境下，能分化为神经元和胶质细胞，为神经系统疾病的治疗奠定了非常重要的理论和实际意义。实验将目前最常见的两种诱导方法进行比较，分析哪一种方法体外诱导效果更好，能更适合应用到临床神经功能修复工作中。

神经元特异性烯醇化酶是从脑组织中分离出的一种酸性可溶性蛋白，是烯醇酶的同工酶之一，作为神经元和神经内分泌细胞的特异性识别抗体，参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，常用来检测干细胞诱导分化后是否存在神经元细胞，用来研究神经元的发育过程。越理想的诱导状态下神经元特异性烯醇化酶阳性表达率就越高。神经元特异性烯醇化酶的活性改变同神经损伤所致的许多神经性疾病关系密切^[31]。在临床上主要用于判断疾病是否累及神经系统，判断神经元损伤的严重程度，还可以评价治疗效果。本实验针对神经细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性率进行观察。

化学诱导法主要利用了细胞的增殖和分化可受多种细胞因子的调控的机制。诱导方法为添加化学试剂和神经营养因子^[32-35]，但是体外骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化模式和分子调控机制还不甚清楚，有学者认为化学诱导剂诱导神经元样细胞形成可能是化学物质产生的毒性使细胞收缩或细胞骨架变化的结果，并不能代表复杂的细胞分化进程。化学诱导法中的大多诱导剂为常见的抗氧化剂，所以也有研究者认为可能是它们的抗氧化作用提高了体外神经细胞的生存水平。

共培养诱导方案的机制可能为细胞与神经细胞之间的相互接触、相互支持的特异空间结构促进骨髓间充质干细胞分化为神经细胞；同时与使用细胞因子诱导类似共培养神经细胞分泌的各种细胞因子、神经递质等可能参与了骨髓间充质干细胞信息处理过程，调控促进骨髓间充质干细胞分化为神经细胞。共培养法的机制使骨髓间充质干细胞置于一种更接近人体的微环境中，诱导其向神经细胞分化，进而改善神经细胞的营养和代谢状况，使神经系统损伤得到修复。实验中对神经细胞的分离培养对传统方法进行了改进，轻轻的吹打细胞克隆，使其部分分散，尽可能的减少机械损伤，以保持细胞间的原有的联系，结果发现细胞死亡明显减少，而克隆球形成更快，创造出更贴近体内神经系统的微环境。最终实验结果显示共培养组神经样突起数量多并较早互相形成连接，神经元特异性烯醇化酶染色阳性率高于化学诱导法，为临床神经系统疾病及损伤的细胞替代治疗提供了丰富实验支持。

间充质干细胞体外定向分化为神经细胞的研究，运用不同的诱导剂组合，还是选取合适的微环境诱导，亦或是二者结合能更有效的提高诱导分化程度和生理学功能，这仍需要进一步研究。化学诱导法和共培养诱导法同时面临一系列问题：分化后的神经细胞是否具有致瘤性，分化细胞质量控制，分化后的细胞是否能够产生神经电化学功能^[36]，移植后细胞能否恢复受损神经功能及病毒检测等。骨髓间充质干细胞分化的基础理论上还不完善，骨髓间充质干细胞能否实现跨胚层分化等方面一直存在争议^[37-38]。所以选择合适方法进行诱导分化将有助于临床神经再生研究，将诱导方案的改进，以期在不久的将来能将细胞移植治疗，以一种安全有效的方式引入到临床治疗方案中，为受损神经系统的修复、再生工程提供基础。下一步的研究将着重解决骨髓间充质干细胞的分离纯化、诱导后的细胞是否成为真正意义上的神经细胞，能否合成分泌神经递质，与其他细胞、组织建立突触联系，传递和接受神经冲动，从而调控机体生理活动等问题。
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