Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞

中国组织工程研究

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞

闫虎，苏友新，林学义，陈宝军，周必洪，张庆

福建中医药大学，福建省福州市 350122

修回日期:2013-09-15 出版日期:2013-12-10 发布日期:2013-12-10
通讯作者: 苏友新，博士，教授，博士生导师，福建中医药大学，福建省福州市 350122 suyouxin777@hotmail.com
作者简介:闫虎☆，男，1984年生，山东省淄博市人，汉族，福建中医药大学在读博士，主要从事骨与关节损伤与疾病防治研究。 abcdyh@hotmail.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(面上项目)(81072828)*

Culture of rabbit’s articular chondrocytes using type Ⅱ collagenase enzyme digestion method

Yan Hu, Su You-xin, Lin Xue-yi, Chen Bao-jun, Zhou Bi-hong, Zhang Qing

Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Revised:2013-09-15 Online:2013-12-10 Published:2013-12-10
Contact: Su You-Xin, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China suyouxin777@hotmail.com
About author:Yan Hu☆, Studying for doctorate, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China abcdyh@hotmail.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81072828*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前关节软骨细胞的分离培养技术已经比较成熟，但是研究中发现通过目前技术培养的软骨细胞生长周期慢，容易出现退变现象，不利于后续试验的进行。
目的：改进并探讨4周龄新西兰大白兔膝关节软骨细胞的分离与培养的方法。
方法：无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨，采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法，分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养；采用形态学观察，甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对关节软骨细胞进行鉴定；MTT法检测关节软骨细胞增殖情况。
结果与结论：倒置显微镜下见膝关节软骨分离的原代软骨细胞6 h后开始贴壁，72 h可形成单层，96 h即可传代；前3代软骨细胞表型稳定，增殖力良好；第4，5代软骨细胞增殖能力减弱，绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色；免疫组织化学显示软骨细胞Ⅱ型胶原呈黄褐色阳性表达；MTT法检测表明前3代软骨细胞增殖差异无显著性意义(P > 0.05)，且第1-3代与4代软骨细胞在培养第4-7天时，吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05)，与第5代软骨细胞在培养1-7天时，吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05)。提示采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法能够获得大量生长速度快且不宜退变的新西兰大白兔膝关节软骨细胞，且培养的前3代新西兰兔膝关节软骨细胞最为适宜。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 软骨细胞, 体外培养, Ⅱ型胶原酶, 骨关节炎, 退变, 表型, 软骨, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: At present, the separation and culture technique of chondrocytes has been mature, but the chondrocytes grow slowly which are prone to degenerate using the present technique. It is not conducive to the follow-up test.
OBJECTIVE: To investigate and improve the separation and culture method of articular chondrocytes of New Zealand rats at 4 weeks of age.
METHODS: New Zealand rats aged 4 weeks were selected to take cartilage tissues from the bilateral knees that were resected under aseptic condition. Chondrocytes were isolated by type Ⅱ collagenase enzyme digestion and mechanical isolation method. The cells were cultured and passaged, and then identified by morphologic observation, toluidine blue staining and type Ⅱ collagen enzyme immunohistochemical methods. Growth curve was pictured by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide method.
RESULTS AND CONCLUSION: Inverted microscope observation showed that the primary cultured chondrocytes adhered at 6 hours after cultivation. The monolayer formation occurred at 72 hours after cultivation, and the cells were ready to be passaged at 96 hours after cultivation. In the fourth generation, some cells represented a spindle-like appearance. In the fifth generation, most cells turned into irregular shape appearance, and cell proliferation capacity diminished. Toluidine blue staining showed that the nuclei of cultured chondrocytes were blue and cytoplasm was pale blue. Immunofluorescent staining showed that cultured chondrocytes had a positive expression of collagen type Ⅱ and the color was tawny. Proliferative rate of chondrocytes in the first to third generations had no differences (P < 0.05), while differences were found compared with the fourth generation in 4- 7 days (P < 0.05) and the fifth generation in 1-7 days (P < 0.05). The results indicate that type Ⅱ collagenase enzyme digestion and mechanical isolation method is successful for isolating, cultivating New Zealand rat articular chondrocytes in vitro, and the first to third generations can be the best choice for the experiments of knee osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: chondrocytes, cell culture techniques, collagenases, cartilage, articular

中图分类号:

R318

闫虎，苏友新，林学义，陈宝军，周必洪，张庆. Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞[J]. 中国组织工程研究.

Yan Hu, Su You-xin, Lin Xue-yi, Chen Bao-jun, Zhou Bi-hong, Zhang Qing. Culture of rabbit’s articular chondrocytes using type Ⅱ collagenase enzyme digestion method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] 邱贵兴,荣国威.骨科学[M].北京:中国协和医科大学出版社,2012: 506.

[2] 余振华,朱顺叶,张珑娟. 大鼠胫骨生长板软骨细胞的分离与培养鉴定[J]. 中华实验外科杂志,2008,25(10):1309-1310.

[3] 胡志俊,胡波,唐德志,等.兔膝关节软骨细胞的分离培养及形态学特征[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(46): 8555-8558.

[4] 中华人民共和国科学技术部. 关于善待实验动物的指导性意见. 2006-09-30.

[5] Isogai N, Kusuhara H, Ikada Y, et al. Comparison of different chondrocytes for use in tissue engineering of cartilage model structures. Tissue Eng. 2006;12(4):691-703.

[6] Alsalameh S, Amin R, Gemba T, et al. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage. Arthritis Rheum. 2004;50(5): 1522-1532.

[7] Musumeci G, Loreto C, Carnazza ML, et al. OA cartilage derived chondrocytes encapsulated in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) for the evaluation of cartilage restoration and apoptosis in an in vitro model. Histol Histopathol. 2011; 26(10):1265-1278.

[8] Heckmann L, Fiedler J, Mattes T, et al. Mesenchymal progenitor cells communicate via alpha and beta integrins with a three-dimensional collagen type I matrix. Cells Tissues Organs. 2006;182(3-4):143-154.

[9] 张洪,江捍平,王大平,等.关节制动制作骨性关节炎动物模型的探讨[J].中国现代医学杂志,2006,16(12):1843-1844.

[10] 韦宋谱,张晓钢,丁道芳,等.一种获取具有旺盛增殖力的大鼠软骨细胞培养方法[J].上海中医药杂志,2012,46(7):8-12.

[11] 苏晓川,王义生,郭艳幸,等.成人关节软骨细胞增殖与人参皂甙Rg1的促进作用[J].中国组织工程研究,2012,16(33):6116-6120.

[12] 刘伯龄,邹吉林,梁珪清,等.透骨消痛颗粒对关节软骨细胞wnt/β-连环蛋白信号通路的调控[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(46):8574-8578.

[13] 张世华,张学祥.补肾壮骨胶囊对兔膝骨关节炎软骨ADAMTS-4表达的影响[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(2);7-8.

[14] 王良兵,何成山,周吕云,等.关节注射结合中药辩证治疗膝骨性关节炎[J].中华全科医学,2011,9(3);418-419.

[15] 辛晓东,戴七一,覃学流,等.逍遥散对兔膝关节软骨细胞凋亡影响的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志,2011,19(1);4-5.

[16] Claus S, Aubert-Foucher E, Demoor M, et al. Chronic exposure of bone morphogenetic protein-2 favors chondrogenic expression in human articular chondrocytes amplified in monolayer cultures. J Cell Biochem. 2010;111 (6):1642-1651.

[17] 李文辉,侯筱魁.软骨组织工程种子细胞及其培养方法[J].中华创伤骨科杂志,2003,5(3):244-246.

[18] 颉玉欣,张进贵,郭晓华,等.大鼠剑突软骨细胞的体外分离与培养[J].河北医科大学学报,2007,28(1):24-27.

[19] Ye K, Felimban R, Moulton SE, et al. Bioengineering of articular cartilage: past, present and future. Regen Med. 2013; 8(3):333-349.

[20] Surrao DC, Khan AA, McGregor AJ, et al. Can microcarrier-expanded chondrocytes synthesize cartilaginous tissue in vitro? Tissue Eng Part A. 2011;17(15-16):1959-1967.

[21] Hoenig E, Leicht U, Winkler T, et al. Mechanical properties of native and tissue-engineered cartilage depend on carrier permeability: a bioreactor study. Tissue Eng Part A. 2013; 19(13-14):1534-1542.

[22] 范学敏,李鹏翠,丁娟,等.玻璃化冻存对兔关节软骨细胞存活率及生物学活性的影响[J].中国骨科临床与基础研究杂志,2012, 4(4): 275-280.

[23] 陈北北.体外培养软骨细胞与生长因子的加入[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,46(16):8568-8571.

[24] Allen JL, Cooke ME, Alliston T. ECM stiffness primes the TGFβ pathway to promote chondrocyte differentiation. Mol Biol Cell. 2012;23(18):3731-3742.

[25] Responte DJ, Natoli RM, Athanasiou KA. Collagens of articular cartilage: structure, function, and importance in tissue engineering. Crit Rev Biomed Eng. 2007;35(5): 363-411.

[26] Albrecht C, Schlegel W, Eckl P, et al. Alterations in CD44 isoforms and HAS expression in human articular chondrocytes during the de- and re-differentiation processes. Int J Mol Med. 2009;23(2):253-259.

[27] 刘军,戴刚,杨柳.骨关节炎软骨细胞的体外分离培养[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(46):9045-9048.

[28] Chockalingam PS, Varadarajan U, Sheldon R, et al. Involvement of protein kinase Czeta in interleukin-1beta induction of ADAMTS-4 and type 2 nitric oxide synthase via NF-kappaB signaling in primary human osteoarthritic chondrocytes. Arthritis Rheum. 2007;56(12):4074-4083.

[29] Ho LJ, Lin LC, Hung LF, et al. Retinoic acid blocks pro-inflammatory cytokine-induced matrix metalloproteinase production by down-regulating JNK-AP-1 signaling in human chondrocytes. Biochem Pharmacol. 2005;70(2):200-208.

[30] Prasadam I, van Gennip S, Friis T, et al. ERK-1/2 and p38 in the regulation of hypertrophic changes of normal articular cartilage chondrocytes induced by osteoarthritic subchondral osteoblasts. Arthritis Rheum. 2010;62(5):1349-1360.

[31] 赵强,王一洲.兔膝关节骨性关节炎模型的建立及软骨细胞的分离、培养[J].天津中医药,2013,30(3):168-170.

[32] 周强,李起鸿,戴刚,等.原代骺板软骨细胞的高效分离和体外培养观察[J].中华创伤杂志,2003,19(5):293-296.

[33] 周强,李起鸿,戴刚,等.三步酶消化法高效分离兔原代关节软骨细胞及体外培养观察[J].中华外科杂志,2005,43(8):522-526.

[34] 丁万军,刘世清,贺斌,等.大鼠膝关节软骨细胞体外培养去分化时间的实验研究[J]. 武汉大学学报:医学版,2012,33(1):47-49.

[35] 田峰,崔学生,张帅,等.改良分步消化法培养原代软骨细胞[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(20):3633-3635.

[36] 刘振峰,方锐,孟庆才.Ⅱ型胶原酶消化法可短时间获得大量纯化大鼠关节软骨细胞[J].中国组织工程研究与临床康复,2011, 15(50):9323-9326.

[37] 刘小荣,张笠,高武,等.新西兰兔关节软骨分离培养与鉴定的实验研究[J].国际检验医学杂志,2012,33(19):2307-2312.

[38] 张艳,柴岗,刘伟,等.体外培养过程中去分化的人软骨细胞基因表达谱的变化[J].中华整形外科杂志,2007,23(4):331-334.

[39] Ryu JH, Chun JS. Opposing roles of WNT-5A and WNT-11 in interleukin-1beta regulation of type II collagen expression in articular chondrocytes. J Biol Chem. 2006;281(31): 22039- 22047.

[40] 张莉,郭全义,眭翔,等.羊软骨细胞在生物反应器中的培养和扩增[J].中国矫形外科杂志,2006,14(6):446-448.

[41] Fosang AJ, Beier F. Emerging Frontiers in cartilage and chondrocyte biology. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2011; 25(6):751-766.

[42] Dressler MR, Butler DL, Boivin GP. Effects of age on the repair ability of mesenchymal stem cells in rabbit tendon. J Orthop Res. 2005;23(2):287-293.

[43] Dorotka R, Bindreiter U, Vavken P, et al. Behavior of human articular chondrocytes derived from nonarthritic and osteoarthritic cartilage in a collagen matrix. Tissue Eng. 2005;11(5-6):877-886.

[44] Hsieh YS, Yang SF, Lue KH, et al. Upregulation of urokinase-type plasminogen activator and inhibitor and gelatinase expression via 3 mitogen-activated protein kinases and PI3K pathways during the early development of osteoarthritis. J Rheumatol. 2007;34(4):785-793.

[45] Kuhne M, John T, El-Sayed K, et al. Characterization of auricular chondrocytes and auricular/articular chondrocyte co-cultures in terms of an application in articular cartilage repair. Int J Mol Med. 2010;25(5):701-708.

[46] Schuh E, Hofmann S, Stok K, et al. Chondrocyte redifferentiation in 3D: the effect of adhesion site density and substrate elasticity. J Biomed Mater Res A. 2012;100(1): 38-47.

[47] Wilson R, Diseberg AF, Gordon L, et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 2010;9(6): 1296-1313.

[48] Wilson R, Norris EL, Brachvogel B, et al. Changes in the chondrocyte and extracellular matrix proteome during post-natal mouse cartilage development. Mol Cell Proteomics. 2012;11(1):M111.014159.

[49] 郭雄明,薛霞,谢忠忱.兔血清制备及兔来源细胞培养实验[J].实验动物科学与管理,2005,22(4):10-12.

[50] 曾令员,王世东,贺冬冬,等.同种异体血清体外培养兔膝关节软骨细胞的增殖[J].中国组织工程研究,2012,16(15):2661-2664.

[51] 何莉芳,刘静.一种简易的小牛血清制备方法[J].生物学杂志, 2002, 19(4):39-40.

[52] Chua KH, Aminuddin BS, Fuzina NH, et al. Insulin-transferrin-selenium prevent human chondrocyte dedifferentiation and promote the formation of high quality tissue engineered human hyaline cartilage. Eur Cell Mater. 2005;9:58-67.

[53] 黄爱兵,邱勇,孙光权,等.人髂骨生长板软骨细胞的体外培养及鉴定[J].中国矫形外科杂志,2008,16(11):856-859.

[54] Hoshiba T, Lu H, Yamada T, et al. Effects of extracellular matrices derived from different cell sources on chondrocyte functions. Biotechnol Prog. 2011;27(3):788-795.

[55] Lin Z, Fitzgerald JB, Xu J, et al. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J Orthop Res. 2008;26(9):1230-1237.

[56] Park K, Min BH, Han DK, et al. Quantitative analysis of temporal and spatial variations of chondrocyte behavior in engineered cartilage during long-term culture. Ann Biomed Eng. 2007;35(3):419-428.

[57] Saris DB, Vanlauwe J, Victor J, et al. Characterized chondrocyte implantation results in better structural repair when treating symptomatic cartilage defects of the knee in a randomized controlled trial versus microfracture. Am J Sports Med. 2008;36(2):235-246.

[58] Weinstein T, Evron Z, Trebicz-Geffen M, et al. β-D-xylosides stimulate GAG synthesis in chondrocyte cultures due to elevation of the extracellular GAG domains, accompanied by the depletion of the intra-pericellular GAG pools, with alterations in the GAG profiles. Connect Tissue Res. 2012; 53(2):169-179.

[59] Kenzaki K, Tsuchikawa K, Kuwahara T. An immunohistochemical study on the localization of type II collagen in the developing mouse mandibular condyle. Okajimas Folia Anat Jpn. 2011;88(2):49-55.

[60] Fukui N, Ikeda Y, Tanaka N, et al. αvβ5 integrin promotes dedifferentiation of monolayer-cultured articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 2011;63(7):1938-1949.

引言

骨关节炎是全球范围内最常见的疾病之一，其病变部位产生的肿胀、疼痛、肌肉萎缩及肌无力等功能障碍严重影响着患者的生存与生活质量。随着社会老龄化进程，该病的防治变得越来越重要。目前防治该病的重点之一即保护退变的关节软骨^[1]。由于临床病例标本获得困难，因此众多关于该病的发病机制、药物预防及治疗的研究多建立在动物模型中进行，从动物关节中获取关节软骨细胞并进行体外培养后进行干预就变得尤为重要^[2-3]。

软骨细胞是软骨组织中惟一的细胞成分，软骨组织内无血管及所需营养由软骨基质向内渗入的特点为软骨细胞体外培养提供了可能性。但是软骨细胞存在于软骨基质内的陷窝中，周围包裹着大量的胶原纤维蛋白和蛋白聚糖等大分子结构，因此软骨细胞的获得与体外培养存在一定的难度。

随着研究的深入，众多软骨细胞的消化方法随之出现，Ⅱ型胶原酶消化法即是软骨细胞体外分离技术中的常用方法之一。单纯采用Ⅱ型胶原蛋白酶消化软骨组织以分离软骨细胞，并证明分离获得的软骨细胞活性良好。但是作者所在课题组在既往通过传统Ⅱ型胶原酶消化法获得软骨细胞进行培养中发现：①传统及改良后的Ⅱ型胶原酶消化法消化时间较长，一般需过夜，在一定程度上不利于细胞的生长。②步骤复杂，所得到的的软骨细胞要进行多次冲洗，冲洗后还需过滤，进一步对细胞造成了损伤。③Ⅱ型胶原酶开始使用后的储存时间不明确，在消化软骨细胞的过程中消化时间无法掌握。④培养的软骨细胞生长周期慢，一般原代要6-8 d，延误实验的进行并容易被污染。⑤软骨细胞容易出现退变现象，造成实验结果不准确等，因此传统及改良后的Ⅱ型胶原酶消化获取软骨细胞并体外培养的方法依然存在挑战。

为了克服以上不足，实验对Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞技术进行细节上的优化，在获取软骨细胞的体外培养体系的同时对其进行鉴定，以期通过优化建立新的软骨细胞体外分离、培养及鉴定技术，在研究其生物学特性的同时，旨在为从软骨细胞层面开展骨关节炎的相关研究奠定实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间与地点：于2012年9至10月在福建中医药大学动物实验中心及中西医结合研究院实验室完成。

材料：清洁级4周龄新西兰大白兔10只，雌雄各半，体质量0.40-0.44 kg，由福建中医药大学动物实验中心提供，室温培养，实验动物许可证号码：SCXK(沪) 2011-0011，实验动物质量合格证编号：0056427。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[4]。

实验方法：

软骨细胞的分离、培养与传代：新西兰大白兔耳缘静脉空气栓塞处死后，乙醇浸泡5 min，截取膝关节(封闭)浸泡于含双抗(1%青霉素和链霉素)PBS中转入超净工作台，在超净台中无菌条件下用PBS冲洗截取的膝关节3遍，切除关节周围部分组织后，打开膝关节关节腔，手术刀削取膝关节关节面软骨组织，将收集到的软骨小块置于10 cm²无菌培养皿中，用解剖剪及刀片将软骨锐性切碎成1 mm³(甚至更小)，用含双抗的(1%青霉素和链霉素)PBS充分漂洗软骨小块3次，将软骨小块收集入 50 mL培养管中，加0.2%Ⅱ型胶原酶6 mL，37 ℃恒温水浴摇床中震荡，共4 h，期间每隔0.5 h用移液枪轻轻吹打含有软骨小块的Ⅱ型胶原酶1.0-2.0 min，分别于120，180及240 min时收集消化液上清并加入新的0.2%Ⅱ型胶原酶6 mL(如果末次还有未消化的碎片，可加入5 mL 0.2%Ⅱ型胶原酶后置于4 ℃冰箱过夜)。将每次收集的上清液置于15 mL离心管中，1 000 r/min离心 5 min使细胞沉淀，弃上清，将消化后悬浮的软骨细胞连同软骨碎片加入低糖DMEM 5 mL(含体积分数10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素)，轻轻吹打使细胞重新悬浮后，进行细胞计数，以每个培养瓶中的细胞数量为(1.0-2.0)×10⁸ L^-1浓度接种于底面积为25 cm²的培养瓶中，补充体积分数10%胎牛血清培养液至5 mL，混匀后，将培养瓶置于37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱培养，每24-48 h换一次培养液。

每24 h，倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况，当软骨细胞增殖长满到单层的80%-90%后，进行细胞传代。细胞传代时，弃掉旧培养液，用PBS清洗两三次后，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化，放到37 ℃培养箱(1.0-2.0 min，消化时间为3.0-4.0 min)，然后倒置显微镜观察细胞悬浮情况，见到大部分软骨细胞开始回缩成球形并可见细胞间出现缝隙时，加入4 mL体积分数10%胎牛血清培养基终止消化，轻柔吹打后，将细胞悬液置于15 mL离心管中1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入5 mL新鲜体积分数10%胎牛血清培养基，振荡吹打使细胞分散均匀，细胞计数后，按(1.0-2.0)×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于培养瓶中，将每个培养瓶中体积分数10%胎牛血清培养基添加至5 mL，培养的细胞根据生长状态每隔一两天换液1次。当软骨细胞增殖长满到单层的80%-90%后，进行传代并进行后续试验。

形态学观察：新西兰大白兔关节软骨细胞原代与传代培养后，每24 h用倒置显微镜下观察并拍照。

甲苯胺蓝染色：将软骨细胞接种于6孔板中(不放无菌盖玻片)，每孔约5×10³个细胞，待细胞长到50%-60%时，弃培养基，PBS冲洗2次，置于40 g/L多聚甲醛中固定30 min，PBS缓慢清洗2次，加入体积分数1%甲苯胺蓝室温放置10-30 min或4 ℃冰箱过夜，然后用无水乙醇冲洗至无色，爬片自然干燥，封固后，显微镜下观察。

免疫细胞化学染色观察培养的软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达：将原代及传代的新西兰大白兔软骨细胞接种到无菌的盖玻片上，每孔约5×10³个细胞，待细胞长到50%-60%时，培养后取出制备好的细胞爬片，PBS 清洗5 min×3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗 2 min×3次，加0.1% Triton-PBS，室温放置20 min，然后用体积分数30%的H₂O₂室温孵育10 min，PBS清洗 2 min×3次，滴加封闭血清，37 ℃孵育0.5 h后甩掉多余液体，不洗，滴加适当比例的一抗工作液(1∶100-500)，4 ℃冰箱过夜。第二天用PBS漂洗盖玻片5 min×3次，加第二抗体，室温孵育30 min，加SABC工作液，室温孵育20 min，PBS 清洗5 min×3次，加2滴新鲜配置的DAB工作液，室温下静置5 min后，镜下观察，待细胞出现黄褐色改变后，水洗，晾干、封固并拍照。

MTT比色法测细胞增殖：将传代细胞消化并行细胞计数后，调整细胞数量，接种于96孔培养板中，空白调零孔加入0.1 mL DMEM，其余各孔加入0.1 mL体积分数10%胎牛血清的DMEM，每孔接种细胞数量为2×10³个，每代接种一板，每板接种8列，共接种5板，各培养板均置37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中培养，隔天换液。分别于培养24，48，72，96，120，144，168 h时取出进行检测，检测前4 h时每孔加入20 μL MTT溶液，继续置37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中孵育4 h，然后用移液枪吸掉上清，最后加入150 μL DMSO，振摇10 min，置酶标仪570 nm波长测定吸光度值，待吸光度值≥1时，停止检测。

主要观察指标：分离培养的软骨细胞的生长情况及相关的染色鉴定情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

讨论

骨关节炎是由于机械性和生物性因素相互作用，使关节软骨和软骨下骨合成与降解失去平衡的结果。骨关节炎可累及膝关节的全部组织，其最终表现是：关节软骨的软化、纤维化、溃疡、减少，软骨下骨的硬化与象牙化、骨赘形成、软骨下骨囊肿，关节滑膜不同程度的炎症改变。因其发病呈世界性分布，是全球范围内最常见的疾病之一，严重影响人类的生存与生活质量，目前防治骨关节炎的重点放在了保护退变的关节软骨上^[5-6]，但是很多药物治疗骨关节炎软骨退变的机制仍然不清^[7-8]。由于临床获得骨关节炎患者关节软骨细胞困难，而且多数患者年龄偏高，体外培养关节软骨细胞退变严重，增殖能力弱，不利于骨关节炎发病机制、药物预防及治疗的研究。目前国内外关于骨关节炎的研究侧重于在骨关节炎动物模型中进行^[9-15]，研究表明，体外培养关节软骨细胞容易向肥大化及纤维化方向分化，因此体外培养关节软骨细胞不仅需要数量足够的软骨细胞，而且还要求细胞具有良好的功能状态和增殖能力。软骨细胞成功的体外培养成为研究药物防治软骨退变的重要基础，但体外分离存在一定的难度。在体外培养时，随传代次数增加，会出现软骨细胞的退变^[16]、增殖能力降低及细胞表型的改变^[17]。众多学者采用不同方法来克服以上问题，如采用聚2-羟乙基甲基丙烯酸脂包被、机械搅拌式生物反应器、微载体生物反应器、灌注式生物反应器、液氮冷冻保存、生长因子保存及生长分化因子干预^[18-24]。但以上方法虽然有有一定优势，但耗费众多精力和经费。因此，通过获得大量纯化、增殖能力强、细胞表型不易改变的的关节软骨细胞及其鉴定变得越来越重要。

软骨细胞包埋于致密的细胞外基质中，软骨细胞外基质由胶原和蛋白聚糖组成，其中胶原占软骨总质量的50%-70%，胶原成分主要为Ⅱ型胶原^[25]，占到胶原蛋白的90%以上，蛋白聚糖占20%-40%。自从胰蛋白酶和胶原酶联合消化法获得了大量软骨细胞以来，软骨细胞的分离培养方法也多次加以改进^[26]。目前软骨细胞的获得多采用链霉蛋白酶和胶原酶序贯消化法或胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法^[27-29]，如Prasadam 等^[30]用胰蛋白酶和胶原酶结合使用来消化关节软骨。赵强等^[31]报道软骨细胞分离方法的效果，可以收获数量可观的软骨细胞。在软骨消化过程中，胰蛋白酶主要用于消化蛋白聚糖和结构蛋白成分，但是研究发现其量和作用时间都很难掌握^[32-33]，而且胰蛋白酶与胶原酶消化法反复循环消化和离心来获得软骨细胞步骤复杂，细胞易受损伤，活力差，而且容易引起污染^[34-35]，经过探索改良后，形成了单纯Ⅱ型胶原酶消化法获得软骨细胞^[36-42]。但是以上报道的Ⅱ型胶原酶消化法获得软骨细胞后发现存在以下以及问题：①消化时间太长。②步骤复杂。③Ⅱ型胶原酶开始使用后的储存时间不明确。④培养的软骨细胞生长周期慢。⑤软骨细胞容易出现退变现象。为了克服以上的不足，实验采用单纯Ⅱ型胶原酶配合机械吹打法提取软骨细胞，获得了大量软骨细胞。在消化过程中，Ⅱ型胶原酶必须先配先用，每次加入 6 mL，机械吹打时间为每次2 min，消化过程中伴间断吹打的目的是防止Ⅱ型胶原酶因时间过长失去活性并促进了胶原酶的合理分布，加速细胞完全脱落和缩短了消化时间^[43-44]，将消化后的细胞连同软骨碎片一起收集移入培养瓶时，不用滤网过滤，因为实验过程中发现一定的软骨碎片有利于软骨细胞的生长，符合有关文献记载^[45-48]。培养瓶中如果产生气泡，将气泡驱赶至培养瓶上壁，实验证明原代软骨细胞72 h可以传代，前3代软骨细胞48 h可以进行传代。

为了维持关节软骨细胞在体外培养过程中的生物活性与增殖能力，血清是必不可少的成分^[49]。由于兔血清需求量少且价格昂贵，极少有售^[50]，目前市场上多为胎牛血清，研究发现兔血清培养的软骨细胞的贴壁速度及增殖率均不如胎牛血清培养的^[51]。因此实验使用胎牛血清，由于胎牛血清的批号不同，在实验的过程中为了保证软骨细胞的生长，应使用同一批号的胎牛血清。

正常软骨细胞的表型表达，是关节软骨基质保持稳定和保证其正常生理生化及生物力学特性的基本条件，如Chua等^[52]研究认为软骨细胞在培养三四代后发生表型的改变。黄爱兵等^[53]研究认为人髂骨软骨细胞2代之前能维持正常表型。但由于软骨细胞体外培养随传代的增多容易发生退变并伴随增殖能力减弱，因此对软骨细胞的鉴定及第几代软骨细胞的采用在实验的过程中非常重要。软骨细胞的鉴定主要在形态学和功能上进行^[54-57]，在形态上，细胞表型改变的表现为逐渐从多角形和圆形变为类似成纤维细胞样的扁平长梭形^[58]；在功能上，细胞表型改变的主要表现为软骨细胞特异性标志物Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖表达减少或丧失^[59-60]，Ⅱ型胶原的合成和分泌是软骨细胞维持其分化表型的特征性指标，关节软骨细胞可通过Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行鉴定，Ⅱ型胶原免疫组化染色可见软骨细胞胞浆被染成棕黄色，胞核不着色，胞外基质中也有棕黄色颗粒出现；甲苯胺蓝染色可见软骨细胞呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，软骨细胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒，证明培养软骨细胞分泌和合成蛋白聚糖。因此通过形态学观察结合对其分泌的基质成分氨基多糖进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原的免疫组化染色对软骨细胞进行鉴定；软骨细胞的增殖能力通过MTT法对软骨细胞的吸光度值检测确定。实验证明Ⅱ型胶原免疫组化染色可见软骨细胞胞浆被染成棕黄色；甲苯胺蓝染色可见软骨细胞呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，随着传代次数的增加，Ⅱ型胶原免疫组化染色与甲苯胺蓝染色后颜色均逐渐变浅。实验过程中进行Ⅱ型胶原免疫组化与甲苯胺蓝染色时，封固后镜下观察出现图像不清晰，拍照不理想，因此通过摸索，Ⅱ型胶原免疫组化染色在96孔培养板中进行，甲苯胺蓝染色在6孔板中进行，直接镜下观察效果良好。

实验通过单纯Ⅱ型胶原酶消化结合机械吹打获得了大量的软骨细胞，对新西兰兔软骨细胞进行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原的免疫组化染色结合生长曲线证明第1代至第3代关节软骨细胞为研究骨关节炎合适的靶细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

文章快阅

延伸阅读

1实验设计构思介绍：

课题组在科研过程中发现传统Ⅱ型胶原酶消化法获得软骨细胞进行培养后存在以下以及问题：①传统及改良后的Ⅱ型胶原酶消化法消化时间较长，一般需过夜，从一定程度上损伤了细胞结构。②步骤复杂，所得到的的软骨细胞要进行多次冲洗，冲洗后还需过滤，进一步对细胞结构造成了损伤。③Ⅱ型胶原酶开始使用后的储存时间不明确，在消化软骨细胞的过程中消化时间无法掌握。④培养的软骨细胞生长周期慢，一般原代要6-8d，延误实验的进行并容易被污染。⑤软骨细胞容易出现退变现象，造成实验结果不准确等。

2国内外同类研究水平的介绍：

目前国内外软骨细胞的获得多采用链霉蛋白酶和胶原酶序贯消化法或胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法，经过探索改良后，形成了单纯Ⅱ型胶原酶消化法获得软骨细胞，后来单纯Ⅱ型胶原酶消化法又进行优化。

3与其他同类研究的比较：

与其他同类研究比较后的优势：①Ⅱ型胶原酶消化法消化时间较短，不需过夜，从第一次消化至最后一次共4h，从一定程度上保护了细胞结构。②步骤简单，不对软骨细胞要进行多次冲洗，不需过滤。③Ⅱ型胶原酶开始使用后的储存时间明确，从第一次使用，有效期为1个月。④培养的软骨细胞生长周期慢，一般原代要3d可以传代，不易被污染。⑤软骨细胞不容易出现退变现象。

4文章先进性：

检索时间：2013-03-20

检索时间范围：1994年至今

检索关键词：关节软骨articular chondrocytes；兔 rabbit；细胞培养 culturing

检索结果：CNKI共检索文献35篇，PUBMED共检索23篇

5文章要点：

①针对传统Ⅱ型胶原酶消化法获得软骨细胞进行培养后发现存在Ⅱ型胶原酶消化时间长、步骤复杂、培养的软骨细胞生长周期慢等特点，为弥补以上不足，对传统Ⅱ型胶原酶消化法进行优化。②采用形态学观察，甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对关节软骨细胞进行鉴定。

6文章关键信息：

①改良后的Ⅱ型胶原酶消化法获得软骨细胞消化时间短、生长周期快。②软骨细胞的鉴定可以通过形态学观察，甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法完成。

7研究的创新之处与不足：

在原代软骨细胞的培养中混合软骨碎片，得到的软骨细胞成活率高、生长周期快及不容易产生软骨退变现象，但是实验血清未用兔血清培养软骨细胞进行对比。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞

Culture of rabbit’s articular chondrocytes using type Ⅱ collagenase enzyme digestion method

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[2]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[3]	彭旭, 杨继滨, 尤奇, 金瑛, 张骏, 葛振, 邹刚, 江孔军, 刘毅. 金骨莲灌胃对兔骨关节炎模型软骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1188-1194.
[4]	占龙, 孟农钦, 农桔安, 李小峰, 杨渊, 余雪. 原儿茶酸可减轻退变软骨细胞的损伤[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1149-1154.
[5]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.
[6]	陈铁柱, 王宁科, 李晓声. 腰痹舒干预腰椎间盘退变模型兔髓核组织水通道蛋白1、水通道蛋白3的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1168-1173.
[7]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[8]	陈江, 肖辉灯, 孙旗, 张帆, 祝永刚, 刘志超, 郭菲宇, 柳根哲. 人椎间盘髓核细胞增殖活性与益肾活血通络方的干预调控[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1200-1206.
[9]	陈劲松, 王中汉, 常非, 刘贺. 多种特殊状态下关节软骨缺损修复的组织工程技术[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1272-1279.
[10]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[11]	林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.
[12]	陈钢泓, 曾超明, 陈梓铭, 廖俊星, 马元琛, 郑秋坚. 骨髓间充质干细胞关节腔注射治疗兔软骨缺损的最适浓度[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 996-1001.
[13]	黄永明, 黄启明, 刘焱杰, 王竣, 曹振武, 田振江, 陈博鉴, 麦秀钧, 冯恩辉. TDP43慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞与软骨细胞共培养后的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1016-1022.
[14]	岑妍慧, 夏猛, 贾微, 罗伟生, 林江, 陈松林, 陈炜, 刘鹏, 黎明星, 李景云, 李曼莉, 艾丁丁, 蒋云霞. 黄芩素能下调诱捕受体3表达抑制肝癌干细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1023-1029.
[15]	刘群, 孙东东, 高丽兰, 何志江, 孙明林. 经皮椎体后凸成形后再发骨折相关因素的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(6): 976-984.