壳聚糖管状支架联合肌瓣修补颈段食管部分缺损*

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.024

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (51): 8934-8940.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.024

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壳聚糖管状支架联合肌瓣修补颈段食管部分缺损*

陈刚¹，刘汉云1，王斌²，张自正¹，王治平³

¹中山大学附属梅州市人民医院胸外科，广东省梅州市 514031；²温州医学院附属浙江省台州医院心血管内科，浙江省临海市 317000；3中山大学附属第一医院心胸外科，广东省广州市 510080

出版日期:2013-12-17 发布日期:2013-12-17
通讯作者: 王治平，教授，博士生导师，中山大学附属第一医院心胸外科，广东省广州市 510080
作者简介:陈刚☆，男，1971年生，辽宁省沈阳市人，汉族，副主任医师，博士，中山大学在站博士后，主要从事生物可吸收材料应用及组织重建研究。 xy7224@sina.com
基金资助:
广东省卫生厅医学科研基金资助(A2013799)*

Chitosan tubular stent combined with muscle flaps for repair of partial defects of the cervical esophagus

Chen Gang¹, Liu Han-yun¹, Wang Bin², Zhang Zi-zheng¹, Wang Zhi-ping³

¹ Department of Thoracic Surgery, Meizhou People’s Hospital of Sun Yat-sen University, Meizhou 514031, Guangdong Province, China; ²Department of C ardiology, Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Wenzhou Medical University, Linhai 317000, Zhejiang Province, China;³ Department of Cardiothoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Online:2013-12-17 Published:2013-12-17
Contact: Wang Zhi-ping, Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiothoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Chen Gang☆, M.D., Associate chief physician, Department of Thoracic Surgery, Meizhou People’s Hospital of Sun Yat-sen University, Meizhou 514031, Guangdong Province, China xy7224@sina.com
Supported by:
the Medical Science Research Fund of Guangdong Health Bureau, No. A2013799*

摘要/Abstract

摘要：

背景：多年来使用肌肉、皮肤、骨骼肌瓣及胃、肠等管腔组织等作为人工食管修补食管缺损，但效果都不甚理想。
目的：探讨壳聚糖管状支架联合肌瓣修补颈段食管部分缺损的可行性。
方法：取30只大耳白兔，制作颈段食管部分缺损动物模型，实验组20只破损处植入壳聚糖管状支架，外覆自体颈部肌瓣修补；对照组10只直接覆盖自体颈部肌瓣修补。于植入后第2，4，8周观察支架吸收及破损处组织学变化；植入后第10周行食管钡透，观察有无狭窄发生及食管蠕动。
结果与结论：植入后2周，实验组及对照组均见肌肉组织结构，细胞肿大，炎性细胞浸润，表现为急性炎症反应。植入后4周，实验组替代物肌瓣组织结构清晰，炎性反应减弱，无明显纤维组织增生；对照组缺损处肌组织结构可见，肌肉组织表面可见纤维组织细胞生长，伴有少许炎性细胞。植入后8周，实验组肌肉组织瓣表面大部分鳞状上皮化，可见食管黏膜组织，黏膜下伴有慢性炎性反应，较4周时明显减轻；对照组为慢性炎症反应，伴有明显纤维组织增生，表面无鳞状上皮化生及黏膜再生。钡餐透视显示实验组食管通畅无狭窄，蠕动减弱；对照组食管部分狭窄，无蠕动。表明壳聚糖管状支架联合肌瓣可较好修补颈段食管部分缺损。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 生物材料与药物控释, 壳聚糖, 支架, 肌瓣, 食管缺损, 食管重建, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Over the years, muscle, skin, skeletal muscle flaps and luminal tissues, such as stomach and intestines, are used as an artificial esophagus to repair esophagus defects, but the results are not good.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of chitosan tube stent combined with muscle flaps to repair partial defects of the cervical esophagus.
METHODS: Thirty white rabbits were used to make animal models of partial cervical esophageal defects, and randomly divided into experimental group (n=20) and control group (n=10). Esophagus defect in rabbits of experimental group was repaired using autologous muscle flap with a chitosan tube stent, and esophagus defect in the control group was repaired only with muscle flap. Gross and histological appearance was observed at weeks 2, 4 and 8 after operation, and barium sulphate X-ray screen was performed at week 10 after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: After 2 weeks, muscle tissue structure, cell swelling, and inflammatory cell infiltration could be seen in the experiment and control groups, exhibiting an acute inflammatory reaction. After 4 weeks, the experimental group showed clear muscle flaps, reduced inflammatory reaction, and no obvious fibrosis; while in the control group, muscle tissue could be seen at defect site, with growth of fibrous tissue cells and a few of inflammatory cells. After 8 weeks, in the experimental group, squamous metaplasia could be seen on the gross surface of the muscle flaps，esophageal mucosa could be seen, accompanied by chronic inflammatory reaction under the mucosas that had a clear abate than that at 4 weeks after implantation; in the control group, chronic inflammatory reaction could be found, accompanied by clear fibrosis but no squamous metaplasia and mucosal regeneration. Barium sulphate examination found that the esophagus was smooth with a slight motility in the experimental group, but there was a part of stricture in the esophagus without motility. These findings suggest that the chitosan tube stent combined with muscle flaps could better repair partial defects of the cervical esophagus.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, chitosan, esophagus, stents

中图分类号:

R318

陈刚，刘汉云，王斌，张自正，王治平. 壳聚糖管状支架联合肌瓣修补颈段食管部分缺损*[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(51): 8934-8940.

Chen Gang, Liu Han-yun, Wang Bin, Zhang Zi-zheng, Wang Zhi-ping. Chitosan tubular stent combined with muscle flaps for repair of partial defects of the cervical esophagus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(51): 8934-8940.

图/表（结果） 4

2.1 术后动物一般情况 术后存活21只，其中实验组12只，对照组9只；术中死亡5只，其中麻醉过深2只，输液过多1只，手术意外2只；术后死亡4只，其中吻合口瘘1只，术后5 d及7 d感染2只，术后2周食管重度狭窄营养不良1只。死亡动物不再补充。

两组动物术后2周内进食良好，体质量较术前减轻0.5 kg以内；对照组于3周后饮食差，进食量明显减少，体质量下降超过1 kg，实验组进食正常，体质量逐渐增加至术前。

2.2 大体观察结果

术后2周：见食管缺损处食管断端与肌组织瓣结合紧固，伴有轻度水肿，肌组织瓣下可见壳聚糖管，质地软，管腔表面有一层污秽膜状物，实验组及对照组基本相同，见图2。

术后4周：缺损处完全修复，缝线可见，尚未吸收，实验组食管替代物部分的管腔内表面光滑，血运丰富，壳聚糖管部分分解，触及有颗粒感；对照组缺损处修复完整，肌组织瓣红润，有组织增生物覆着，伴有水肿，见图3。

术后8周：实验组食管缺损处完全修复，肌瓣内表面被白色厚膜状物覆盖，管壁无水肿，无明显狭窄，无坏死和溃疡，未见壳聚糖管状物；对照组破损处愈合良好，肌组织瓣内表面有增生物存在，管腔有狭窄变化，见图4。

2.3 光镜下观察结果

病理检查：术后2周，两组均见肌肉组织结构，细胞肿大，炎性细胞浸润，均表现为炎症反应改变，见图5。

术后4周，实验组替代物肌瓣组织结构清晰，炎性反应减弱，未见明显纤维组织增生，伴有少许中性粒细胞和淋巴细胞；对照组缺损处肌组织结构可见，肌肉组织表面可见纤维组织细胞生长，伴有少许炎性细胞，见图6。

术后8周，实验组肌肉组织瓣表面大部分鳞状上皮化，并可见食管黏膜组织，黏膜下伴有慢性炎性反应，较前周明显减轻；对照组为慢性炎症反应，伴有明显纤维组织增生，表面无鳞状上皮化生及黏膜再生，见图7。

钡餐透视：术后10周食管钡餐检查，实验组见食管钡剂通过顺利，无明显狭窄及返流，吻合部上下无扩张，无钡剂漏出，食管蠕动减弱；对照组出现破损处狭窄，吻合口上部伴有扩张，钡剂通过减少，未见食管蠕动，见图8。

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引言

食管替代一直是食管外科领域的难题和研究热点^[1-2] ，目前食管替代组织有自体组织和人工替代物(人工食管)两大类，多年来一直使用自胃、肠等管腔组织^[3-4] 。食管组织的重建多要在开胸及开腹手术下完成，手术术式复杂，时间长，术后并发症多，尽管目前采用的管型胃在食管替代中防止了胃反流，更接近于食管生理性，并发症少，取得了良好效果，但还是改变了胃的自然状况和生理状况。而对于特殊病例，如胃组织缺失，或胃部病变不能作为替代物时多采用空场、结肠代替食管，已成为一种固定的术式，但手术风险进一步加大，一旦失败将造成严重感染甚至威胁生命，目前主要的研究是改进技术，如何减少并发症的发生和降低死亡率；也有人提出利用自体组织局部修补食管的设想，有报道使用一些肌肉、皮肤、骨骼肌瓣等^[5-7] ，完成食管破损的修复和重建，如应用颈阔肌皮瓣重建颈部食管部分缺损获得成功，并进行了相关病例报道，如使用肋骨肌瓣修复食管破裂缺损处获得成功，2007 年巴西学者Paulo在动物实验中成功利用带蒂膈肌瓣修补胸段食管人工缺损，国内也有临床实践和动物实验表明带蒂膈肌瓣是修补食管的理想自体组织，目前应用局限于食管破裂的修补。
此外，人工食管也是食管替代修复的一个研究方向，人工食管的研究已有60年历史，从Berman开辟了人工食管先河，随后出现了硅胶、塑料、聚丙烯、涤纶等一系列人工食管，直到今天的组织工程人工食管，可谓种类繁多并成为研究热点。但迄今为止，尚未发现理想的人工食管，人工食管只是目前人们对食管缺损重建的一种理想化模式和希望。准确的人工食管定义：即采用生物医学工程学、组织工程学及生物材料学等技术制造的一种短暂替代食管功能，同时能诱导新生食管再生重塑和功能重建的管状装置，包括完整上皮、血管，腺体神经等。人工食管已从单纯管子转向具有生物活性，完整组织及一定生理功能特点发展。
理想的人工食管材料应符合以下条件：①柔软而不漏水，因为质硬的代用品会因食管的蠕动推移而脱落，漏水者则因食管内的消化道分泌物外渗而感染。②内壁必须光滑，食物才不易黏附于管壁上，容易被水冲掉而保持清洁。③不亲水而又和组织液易融合，使人工食管和正常组织之间不留间隙，即表面相容性好。④外壁粗糙有孔，使组织能够长入而得以被固定在体内，孔应细而小，与管腔不相通。⑤有一定的伸缩弹性，以适应食管的蠕动功能。⑥内壁能够上皮化，从而达到一定的抗腐蚀功能。近期的研究重点分为两个方向，一是诱导食管组织重生，多采用生物材料或复合材料，研究较多的是镍钛合金及其复合材料；二是组织工程人工食管，采用组织工程方法，利用种子细胞，在一定的基质上培养出食管的各层细胞，构建出结构与正常食管相似的人工食管，移植到病变部位，难度都相对较高。大多数动物实验表明：食管可以“再生”，并不是长出新的食管，而是新生食管主要由纤维结缔组织构成食管的完整性，其内表面覆盖着不同层次的食管鳞状上皮细胞，结缔组织内可见散在的血管、平滑肌、腺体、神经纤维等高级结构，这是目前发现食管再生的特点，需要进一步深入研究组织再生的条件与缺损重建的关系。
近年研究应用较多的各种人工食管，有硅胶的、塑料的、复合材料的、异体生物组织材料的，都可以临时替代食管作用，但都面临着脱管及排斥问题，远期效果都不甚理想，目前为止，还没有一种真正意义上的人工食管代替现有食管，所以课题组转变思路，利用组织瓣及组织再生来完成食管原位重建，如能成功可以显著简化手术方式，而且不改变消化道生理特点，值得在这一方向深入研究。
课题组在肺组织瓣原位修补胸内食管部分缺损实验获得成功^[8-10] ，其中在组织瓣内衬一种自行研制的壳聚糖可吸收管作为支架，防止缺损处再生食管组织的再狭窄并具有良好的生物相容性和自行降解性，比前期使用的金属盒硅胶支架管更科学，解决了排斥反应。壳聚糖是自然界内广泛存在于海洋贝壳类组织的一种生物成分，已被提纯制成99%的壳聚糖粉，该成分无毒，在体内及自然界可自行降解，具有生物活性，对组织无排斥反应，已被广泛应用于生物、医学、制药的多个领域，可被制作成胶囊、微球颗粒、膜状载体及可制成防粘连膜。壳聚糖具有抑制炎症的作用，有利于创面愈合，减少瘢痕的形成，在体内数月可自行降解。在食管原位修复重建中防止修复食管组织塌陷及粘连，需要一种支架临时支撑，该支架要求为管型，无毒，生物相容性，可自行降解，抑制炎症反应，作者自行研制的壳聚糖管型支架恰恰具备上述特点，并且前期实验已成功应用。为了寻找一种简单方法的同时使术式简单化，对生理改变影响不大，所以提出利用自行研制的壳聚糖可吸收管型支架，外覆颈部肌瓣，原位修补重建颈段食管部分缺损的设想，探讨该新方法的可行性。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013-05-01/09-01在中国医科大学盛京医院实验中心完成。

材料：

实验动物：健康大耳白兔30只，雌雄不拘，体质量 2 kg左右，由中国医大盛京医院实验中心提供，许可证号：SCXK-(吉)2008-0001，随机分为2组，其中对照组10只，实验组20只。

壳聚糖管状支架：为课题组前期自行制作^[11]，经过环氧乙烷消毒封存备用，长1 cm左右，内径0.4 cm(环氧乙烷灭菌)。

实验方法：

麻醉：所有实验动物术前当日禁食水，配置10%水合氯醛(5 mL/kg)，行腹腔麻醉，分3次注射，第1次注入总量的1/2，余下分2次注射，将胃管慢慢送入咽喉部，轻轻送入，没有气体溢出，确认送入食管，置入10 cm。

手术方法：将兔右侧卧位，四肢绑定，头偏于右侧，左颈部剪毛皮肤消毒，小剪刀剪开左颈部皮肤，分离皮下组织，暴露颈部肌层，将颈部肌肉游离，可见气管后颈部深肌层下食管被顶起，分离食管前覆盖的颈部深肌群，暴露食管，并将其游离部分，用弯镊子将其勾起，避免损伤血管及周围神经。环形切除颈部大于1/2周径，小于2/3周径，0.3 cm长度的食管壁组织，造成食管部分缺损动物模型。实验组将壳聚糖管状支架置入破损处食管腔内，将支架上下缝线固定于食管壁，外覆自体食管气管前颈部肌肉肌瓣组织；对照组直接行自体食管气管前颈部肌肉肌瓣修补，见图1。将肌瓣用3-0丝线修补缺损处，连续缝合，注射器打入无菌盐水，肌瓣修补处无渗漏，拔出胃管，放回食管，逐层缝合。术后禁食水，每日静脉输注糖盐水100 mL，庆大霉素4×10⁴ U抗炎治疗，共计5 d，5 d后给与饮用糖盐水及庆大霉素2 d，1周后给予兔粮。

主要观察指标： ①兔存活率、术后进食情况、手术前后体质量变化，以及并发症发生及其原因。②分别于术后第2，4，8周，实验组及对照组各处死动物2只，解剖分离颈段食管组织，纵行剖开食管组织，观察食管缺损修复情况及支架变化情况，并在食管缺损修复处进行多点取材，包埋后制作组织石蜡组织切片，切片厚度为5 µm，常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察替代物肌瓣组织的组织学变化情况。③剩余动物继续饲养，于术后第10周行胃肠透视，观察重建食管的蠕动及通畅情况。

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讨论

食管外科的核心问题是食管重建及修复，替代物的选择一直困扰着研究人员^[12-13]。早些年，研究人员主要致力于人工食管的合成，如金属、塑料、涤纶、硅胶及复合管等材料。近年人工食管的研究热点集中于生物组织工程方面的研究，如智发朝等^[14]应用猪主动脉自制生物型人工食管，对30只实验犬进行食管替代，围手术期有效率为93.3%，观察发现人工食管组织相溶性好，质地柔软、有弹性，可引导原食管的再生，但存在脱落问题。张兰军等^[15]研究的生物型人工食管虽然获得了成功植入，但面临脱管问题，也就是说人工食管不能永久替代缺损食管，吻合口狭窄及吻合口瘘也是主要并发症，植入长度的限制及血运建立也是难题，组织相容性仍需进一步深入研究^[16] 。非降解和生物可降解材料制成的复合人工食管^[17] ，可诱导食管组织再生，生物材料降解速度要大于食管组织再生时间，复合支架支撑时间要长于单一生物可吸收材料，最终食管完全再生，人工食管不可吸收部分被排出，人工食管只是较长时间作为再生食管的支架。近几年来组织工程化食管成为热点^[18] ，人们利用组织工程技术，将上皮细胞与肌细胞同时种植培养，生成组织工程食管进行食管重建，但腺体和食管神经组织的再生是目前面临的难题，如何避免瘢痕狭窄的发生，进一步加快修复与重塑食管全层组织结构等^[19-21] 。
课题组最初应用自体肺组织瓣来修补气管缺损获得成功^[22-23] ，继而将肺组织瓣包裹胸段食管部分缺损，形成人工食管的管道；使用硅胶管支架及金属支架也取得了成功，但随着时间的推移总是发生排斥反应，由于金属支架被肺组织瓣包裹，炎性刺激导致肉芽肿产生，形成类似食管炎的改变，有出现脱管现象。最终发现利用可降解壳聚糖管型支架有效预防了狭窄的发生，避免了肉芽组织的再生，可保持食管通道畅通，关键问题在于壳聚糖支架管可以自行吸收，无排斥反应，无脱管发生，有效完成了食管部分缺损重建及结构功能的恢复。壳聚糖由甲壳素提取获得^[24]，广泛存在于海洋贝壳类中，带有阳离子，可自行降解吸收，对其理化生物特性在前期实验中已经报道^[11] 。
对于较大的食管破损，有报道通过肌肉瓣或肌皮瓣修复^[25-27] ，例如有研究探讨游离股前外侧皮瓣修复下咽及颈段食管肿瘤切除后组织缺损的方法和疗效。试验对2例以游离股前外侧皮瓣修复肿瘤切除后下咽及颈段食管组织缺损患者的临床资料进行回顾性分析。结果显示2例患者均进行了下咽及颈段食管切除和重建，无围手术期死亡及皮瓣坏死；无术后咽瘘及食管狭窄发生；术后患者吞咽功能满意，均能进普食，并有较好的食管发声；分别随诊16及41个月均无瘤生存。提示游离股前外侧皮瓣修复下咽及颈段食管肿瘤切除后缺损成功率高，并发症少，功能恢复理想。但并未提及支架的应用；对于整段缺损目前解决的办法还是传统管状胃或者肠的替代^[28-30] 。实验应用自身肌肉组织瓣内置壳聚糖管型支架完成颈段食管部分缺损的原位修复重建，恢复了食管的完整性，不存在外来植入食管的排斥与脱管，同时使得手术方法简便，并且未改变消化管道原生理路线，避免了开胸、开腹手术的双重打击。
实验所用的可吸收管状支架是作者采用壳聚糖凝胶成膜技术自行研制的，材料表面具有三维空间微孔结构，有利于细胞在其表面爬行；该材料不透水，在前期研制中进行了动物体内实验和体外降解实验及毒理实验，证明其具有良好的生物相容性、可降解性和生物活性，将其应用于肺组织修补胸段食管部分缺损，有效防止了再生食管的狭窄，有利于食管上皮细胞沿其表面爬行。之所以将其应用到实验中，考虑到其同样会对颈段食管部分缺损肌瓣修复起到支架作用，可以在实验中来减少瘢痕组织的形成，减少组织炎症反应，防止食管狭窄的发生。
任何组织受到损伤及植入其他组织后，组织局部都将表现为应急反应，即对创伤的炎性反应和对异体及异物组织的排斥反应。实验在自体肌瓣修补后2周之内，组织反应表现为急性炎症过程，最初两组表现相似，但随着时间的推移，炎症反应减弱，尤其是在实验组表现明显，表明壳聚糖支架材料有抑制炎症的作用，这在壳聚糖的其他研究中有类似报道。术后4-8周肌瓣完成了食管部分缺损修补，使得食管恢复了管型的完整性，即看到的肌性管道修复，表面上皮细胞修复是组织再生的结果，也是后期观察到的结果。因为部分缺损修复不涉及神经、腺体的完全再生，如果进一步进行整段乃至长段食管的肌瓣修复重建，将不光局限于肌性管道的重建，更为重要的是观察肌性管道是否能够完成神经的修复，从而恢复肌性管道神经支配的蠕动功能，再有就是肌性管道腺体组织的再生，完成肌性管道的分泌功能，从而能达到真正意义的食管重建，这是一个难点，也是未来研究的方向和重点。
实验中关键要确保植入支架不移动，保证肌瓣修补严密、无遗漏，通过注水法检查有无渗漏，术后禁食水5 d，给予静滴葡萄糖盐水并加入抗生素，术后第6天开始给予兔粮及饮水，加强围手术期护理。实验兔的死亡率为30%，主要由于术中及术后管理经验不够丰富，加之兔的抵抗力差，有1只出现食管瘘而死亡。其次对于术中的局部解剖一定做到细致，防止较大血管破裂及迷走神经损伤。另外在术中分离组织动作要轻柔，减少对兔的刺激，从而减少麻醉药用量。实验中对麻醉剂量掌握不够精确也是导致动物死亡的原因，但这不影响对新方法可行性的探索。手术结束后在实验兔尚未完全清醒时，给予保温，可以采取灯照射和加盖棉被的方法，同时给予静滴5%葡萄糖50 mL，有助于兔的复苏，降低死亡率。今后的实验将进一步加大样本量，延长观察时间，并且在实验技术和条件完全成熟后，将在犬、猪大型动物身上进行大样本实验。实验通过成膜法研制并使用的壳聚糖管状支架，维持了食管管道畅通，同时也起到了支撑作用，在一定时间内防止食管替代物部分的塌陷，其生物相容性显著减少了组织增生和瘢痕形成，在完成食管组织修复后逐步降解和吸收，最终效果理想。对于整段食管重建，需要延长管型支架的降解时间，这就要求改进壳聚糖管的制作，改进溶液的配比及辅助材料的添加，保证延长其降解时间，完成长段食管的修复重建。利用颈部肌肉瓣原位修补部分食管缺损，对于食管破裂、部分损伤有着一定的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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壳聚糖管状支架联合肌瓣修补颈段食管部分缺损*

Chitosan tubular stent combined with muscle flaps for repair of partial defects of the cervical esophagus

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