钛表面微弧氧化涂层的细胞生物活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.47.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (47): 8169-8174.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.47.005

• 组织工程口腔材料 tissue-engineered oral materials • 上一篇下一篇

钛表面微弧氧化涂层的细胞生物活性

吴穗丹¹，王焱¹，张辉¹，滕伟¹，宁成云²，郑华德²

¹中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院•广东省口腔医学重点实验室，广东省广州市 510055；²华南理工大学材料科学与工程学院，广东省广州市 510641

修回日期:2013-08-14 出版日期:2013-11-19 发布日期:2013-11-19
通讯作者: 王焱，副教授，中山大学光华口腔医学院?附属口腔医院?广东省口腔医学重点实验室，广东省广州市 510055 wyan65@163.com
作者简介:吴穗丹★，女，1986年生，广东省广州市人，汉族，2013年中山大学光华口腔医学院毕业，硕士，主要从事钛种植体表面改性研究。 wsdswd927@163.com
基金资助:
广东省科技计划项目(2011B031300017)*；国家自然科学基金专项基金项目(81141064)*；中央高校基本科研业务费专项资金(中山大学09ykpy61)*

Cell bioactivity of micro-arc oxidation coating on the surface of pure titanium

Wu Sui-dan¹, Wang Yan¹, Zhang Hui¹, Teng Wei¹, Ning Cheng-yun², Zheng Hua-de²

¹Guanghua School of Stomatology﹒Hospital of Stomatology﹒Guangdong Key Laboratory of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510055, Guangdong Province, China; ²College of Material Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, Guangdong Province, China

Revised:2013-08-14 Online:2013-11-19 Published:2013-11-19
Contact: Wang Yan, Associate professor, Guanghua School of Stomatology﹒Hospital of Stomatology﹒Guangdong Key Laboratory of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510055, Guangdong Province, China wyan65@163.com
About author:Wu Sui-dan★, Master, Guanghua School of Stomatology﹒Hospital of Stomatology﹒Guangdong Key Laboratory of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510055, Guangdong Province, China wsdswd927@163.com
Supported by:
the Scientific and Technological Plan of Guangdong Province, No. 2011B031300017*; the National Natural Science Foundation of China (Special Fund), No. 81141064*; the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 09ykpy61*

摘要/Abstract

摘要：

背景：微弧氧化技术可改善钛或钛合金的表面特征。
目的：研究纯钛表面微弧氧化涂层的表面性能及其对MC3T3-E1细胞早期黏附、增殖及成骨能力的影响。
方法：将46个直径10 mm、厚度2 mm圆盘状纯钛试件分为实验组和对照组。实验组置于含0.02 mol/Lβ-甘油磷酸二钠盐及0.2 mol/L乙酸钙的电解液中进行微弧氧化处理，对照组对试件进行机械抛光。扫描电子显微镜观察试件表面形貌，X射线能谱分析检测涂层表面钙磷比，X射线衍射分析检测涂层晶相构成。将MC3T3-E1细胞接种在两组试件表面，1，2，4 h电镜下观察细胞形态，在2，4，7 d通过CCK-8方法检测细胞增殖，并于7，14 d检测碱性磷酸酶活性。
结果与结论：经微弧氧化处理后，钛表面形成粗糙多孔的钙磷涂层，微弧氧化涂层主要元素为Ca、P、O及Ti，微弧氧化膜层主要由氧化钛、钛酸钙、磷酸钙及偏磷酸钙构成。电镜观察显示1 h 微弧氧化涂层表面细胞已伸出伪足，4 h呈现较典型的细胞形态。细胞在微弧氧化处理钛表面4，7 d的细胞增殖和7，14 d的碱性磷酸酶活性高于对照组。表明微弧氧化技术生成的粗糙多孔钙磷涂层能显著促进MC3T3-E1细胞的早期黏附、增殖及成骨活性。

关键词: 生物材料, 组织工程口腔材料, 微弧氧化, 钛, 钙磷涂层, 表面改性, 生物相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Micro-arc oxidation technique is used to modify the surface properties of titanium and titanium alloy.
OBJECTIVE: To explore the surface properties of micro-arc oxidation film and its effect on the attachment, proliferation and alkaline phosphatase activity of MC3T3-E1.
METHODS: Forty-six pure titanium discs, 10 mm in diameter and 2 mm in thickness, were randomly divided into two groups. The discs of the experimental groups were treated by micro-arc oxidation technique in an electrolytic solution containing 0.02 mol/L sodium β-glycerophosphate and 0.2 mol/L calcium acetate; while the discs of the control group was machine-polished. The surface appearance of the discs was observed by a scanning electron microscopy, the ratio of calcium to phosphorus on the coating surface was detected by X-ray spectroscopy, and the crystalline phase composition of the coating was detected by X-ray diffraction analysis. Cellular morphology in the process of attachment was observed under the scanning electron microscope. Cell proliferation was determined by cell counting kit-8 at 2, 4, 74 days, while alkaline phosphatase activity were determined at 7 and 14 days.
RESULTS AND CONCLUSION: After micro-arc oxidation treatment, a rough and porous calcium-phosphate film was formed on the surface of titanium. The elements of micro-arc oxidation coating main mainly included Ca, P, O and Ti, and the micro-arc oxidation film was mainly composed of titanium oxide, calcium titanate, calcium phosphate and calcium metaphosphate. Under the scanning electron microscope, pseudopods appeared to grow out of the cells on the surface of micro-arc oxidation coating after 1 hour culture, and the typical morphology of the MC3T3-E1 cells could be observed at 4 hours. MC3T3-E1 proliferation (4 and 7 days of culture) and alkaline phosphatase activity (7 and 14 days of culture) were enhanced significantly in the micro-arc oxidation group compared with the control group. These findings indicate that the rough and porous calcium-phosphate coating produced by micro-arc oxidation technique on pure titanium surface could promote the early attachment, proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1.

Key words: biocompatible materials, titanium, osteoblasts, histocompatibility, cell proliferation, cell differentiation

中图分类号:

R318

吴穗丹，王焱，张辉，滕伟，宁成云，郑华德. 钛表面微弧氧化涂层的细胞生物活性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(47): 8169-8174.

Wu Sui-dan, Wang Yan, Zhang Hui, Teng Wei, Ning Cheng-yun, Zheng Hua-de. Cell bioactivity of micro-arc oxidation coating on the surface of pure titanium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(47): 8169-8174.

图/表（结果） 3

2.1 扫描电镜观察结果 对照组试件表面相对光滑，无孔洞结构，可见由机械抛光所产生的划痕，见图1A。微弧氧化处理后试件表面形成一层灰色的氧化膜，表面凹凸不平，呈多孔状，洞口清晰呈火山口状，见图1B，相邻大孔洞相互以搭桥的方式叠加、连接在一起，孔径大小不一，介于0.5-5.0 μm之间，见图1C。

2.2 X射线能谱分析结果 X射线能谱分析显示，实验条件下所获得的微弧氧化涂层主要元素为Ca，P，O， Ti，原子组成比钙元素为7.26%，磷元素为3.63%，氧元素为64.48%，钛元素为21.58%，Ca/P为2.01。

2.3 X射线衍射分析结果 X射线衍射结果显示微弧氧化膜层主要由氧化钛、钛酸钙、磷酸钙及偏磷酸钙构成，见图2。

2.4 试件表面粗糙度检测结果 对照组和实验组表面轮廓算术平均偏差Ra值分别为(0.046±0.003) μm和(1.823±0.127) μm，两者之间比较差异有显著性意义 (P < 0.05)。
2.5 扫描电镜观察成骨细胞早期黏附形态 见图3。

MC3T3-E1细胞接种1 h后，对照组表面细胞未见伸展，呈现类圆形体征，见图3A；实验组表面细胞已开始铺展，部分细胞已形成多角形，可观察到丝状伪足和板状伪足伸出，见图3E。与对照组比较，实验组表面部分仍呈类圆形体征的细胞已向膜层表面伸出丝状伪足，见图3B，F。接种2 h后，纯钛组表面细胞呈半球形，部分开始铺展，伸出伪足，见图3C；实验组大部分细胞已铺展，可见较长的伪足，见图3G。接种4 h后，两组试件表面细胞平坦，与试件紧密接触，实验组较对照组表面细胞铺展及伪足更为显著，细胞形态更为典型，见图3D，H。

2.6 细胞增殖检测结果 在细胞接种于材料2 d时，对照组A值略高于实验组(t=8.152，P < 0.05)，4 d和7 d时则实验组A值高于对照组，组间比较差异有显著性意义 (t_{4 d}=-4.409，P < 0.05；t_{7 d}=-12.014，P < 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

设计：对比观察性实验。

时间及地点：于2011年3月至2013年2月在中山大学光华口腔医学院•口腔医学研究所完成。

材料：

实验方法：

试件制备：制作直径10 mm、厚度2 mm圆盘状纯钛试件46个，等量分为抛光对照组和微弧氧化实验组。试件表面预先以碳化硅砂纸从200^#到1 000^#逐级打磨，丙酮、无水乙醇及去离子水超声清洗15 min，干燥箱中烘干。将实验组试件置于含0.2 mol/L乙酸钙和0.02 mol/L的β-甘油磷酸二钠盐电解液的微弧氧化装置中进行表面微弧氧化处理。电压420 V，占空比30%，频率100 Hz，处理时间5 min。反应结束后将试样取出，去离子水清洗，干燥备用。所有试件均在同一条件下完成，制作完成后经光学显微观察，确认表面致密均匀，无气孔，剥脱等现象。

表面性能检测：试件表面经喷金180 s处理，扫描电子显微镜观察表面形貌，同时由扫描电镜附带的能谱仪分析实验组涂层表面元素构成；利用X射线衍射仪分析实验组试件微弧氧化膜层的相结构，衍射角2θ取5°-80°；Surfcom 1400D二维粗糙度测试仪检测两组试件表面粗糙度，对照组和实验组各取3个试件，每个试件随机选取3个位置，每个位置测量3次，取样长度 2 mm，记录轮廓算术平均偏差Ra值。

细胞生物活性检测：

成骨细胞培养：用含体积分数10%胎牛血清，1%双抗的α-MEM培养基，在37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度条件下培养MC3T3-E1细胞，每3 d更换培养液，待细胞融合至80%-90%时进行传代。将对数生长期的细胞用胰酶消化，制备成细胞悬液，按一定密度分别接种于试件表面。

成骨细胞早期黏附形态观察：将两组钛片置于24孔培养板内，将MC3T3-E1细胞按2×10⁴/cm²的密度接种在试件表面，每孔加入培养液至1 mL。在体积分数 5%CO₂及37 ℃饱和湿度的恒温孵育箱中密闭培养。培养1，2，4 h后分别取出试件，PBS冲洗3次，2.5%戊二醛固定3 h，PBS冲洗，体积分数30%，50%，75%，80%，95%，100%乙醇逐级脱水，置于干燥箱中干燥。试件表面经喷金180 s处理，采用扫描电子显微镜观察试件表面细胞形态。

成骨细胞增殖检测：将两组钛片置于24孔培养板内，将MC3T3-E1细胞按2×10⁴/cm²的密度接种在试件表面，每孔加入培养液至1 mL。接种2，4，7 d后终止细胞培养，用PBS漂洗3次，每孔加入CCK-8 45 μL和无血清DMEM 455 μL，37 ℃孵育2 h后每孔取100 μL移入96孔培养板，在490 nm波长下用酶标仪检测吸光度A值。

成骨细胞碱性磷酸酶活性检测：将两组钛片置于24孔培养板内，将MC3T3-E1细胞按2×10⁴/cm²的密度接种在试件表面，每孔加入培养液至1 mL。细胞接种3 d时成骨诱导，7 d和14 d终止细胞培养，吸弃培养液，PBS漂洗3次。每孔加入0.1 % Triton X-100 150 μL， 4 ℃放置过夜。按碱性磷酸酶试剂盒说明书进行碱性磷酸酶活性测定。

主要观察指标：纯钛表面微弧氧化涂层的表面性能及对MC3T3-E1细胞早期黏附、增殖及成骨能力的影响。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 17.0进行统计分析，对实验组和对照组的粗糙度、细胞增殖A值及碱性磷酸酶活性测定的A值分别进行两组独立样本均数比较t 检验，以α=0.05为检验水准。

讨论

种植体植入骨内后与骨组织形成“骨结合”是保证种植体修复远期成功率的前提条件^[7]。表面改性处理通过一定的处理工艺，改变材料表面的化学成分或组织结构等表面特性，增加材料-骨结合面积，获得具有骨结合、骨传导或骨诱导能力的表面，实现与骨的化学结合。微弧氧化技术是新兴的表面改性技术，较等离子喷涂、酸蚀处理、热喷涂等技术而言，其获得的涂层结构致密，与基底结合性能好，化学稳定性高^[8-10]。另外，膜的可设计性是微弧氧化技术的一大优点^[11-12]，它可通过特殊的含钙磷的电解液配方，使其中的钙、磷离子直接参与反应，在钛金属表面形成钙磷比例合适的表面涂层结构，增加其生物活性^[13]；还可以通过电化学参数，如氧化电压、频率、时间等，改变涂层的孔径大小、表面粗糙度等表面特性^[14-15]。以往研究表明，种植体表面的形貌、粗糙度及化学组成等对其表面细胞的早期黏附、增殖及分化起着重要的作用^[16-18]。

X射线能谱分析结果显示，膜层主要由钙、磷、碳和氧等元素组成，说明微弧氧化技术有效的将钙、磷元素带进膜层中。研究表明，种植体表面钙磷元素的出现对其表面性能和生物活性有着重要的影响，可以有效的促进种植体周围组织液发生离子交换，形成磷灰石层沉积。钙磷灰石层在化学成分与晶体结构上与骨的矿化接近，从而促进直接成骨和间接成骨的发生^[19]。钙离子还能够有效的促进细胞的生长^[7]。X射线衍射分析结果显示，膜层中出现磷酸钙、碳酸钙和钛酸钙相。Ca²⁺和PO₄^3-活性基团和蛋白的阴离子结合，还可以作为亲水成分增加表面润湿性，促进钛表面的水合作用^[20-23]，影响种植体表面蛋白质的构型和构象，促进细胞早期附着、增殖和分化^[24-27]；表面润湿性的增加还可以通过种植体表面和周围细胞间产生的离子力直接影响细胞的黏附，或者通过调节表面分子的吸收间接影响细胞的黏附^{[23, 28]}。另一方面，实验经微弧氧化处理所形成的膜层为粗糙多孔的表面，形态不规则，孔径介于0.5-5.0 μm之间。这种不规则的微米级的粗糙表面能，有利于机械嵌合，同时促进骨组织的附着^{[17, 28]}。研究表明，多孔结构有利于细胞的附着与增殖，可以诱导骨组织向孔内生长，从而提高种植体与周围骨组织的结合力^[29-30]。另外，膜层粗糙度轮廓算术平均偏差Ra值为(1.823± 0.127) μm明显大于机械抛光纯钛表面的对应值(0.046±0.003) μm。以往研究显示，粗糙表面可以增大种植体的比表面积，随着种植体表面粗糙度的上升，与骨结合的表面积增大，细胞增殖率也显著增加^[31]。这些研究结果与本实验中微弧氧化膜层细胞活性检测的结果大致相同。细胞实验结果显示，较对照组而言，细胞在微弧氧化涂层表面黏附及成形更早：1 h后已开始伸出伪足，2 h大部分已呈现多角形，4 h伪足较长且显著，细胞形态也更为典型；另外，CCK-8结果显示在4， 7 d，实验组的MC3T3-E1细胞的增殖活性大于对照组，在7，14 d 微弧氧化实验组表面细胞碱性磷酸酶活性显著高于抛光对照组，这充分证实了含有钙、磷成分的粗糙多孔的微弧氧化膜层能显著促进细胞的早期黏附与增殖，提高材料的生物活性，提示微弧氧化技术是一种有效的钛金属表面处理技术。

实验从细胞水平证实了微弧氧化技术能够显著提高钛种植体的生物活性，并初步探讨了其可能的相关原因，但对于微弧氧化膜层的表面特性，包括其孔径、孔隙、粗糙度、化学组成等对细胞生物活性影响的作用机制尚未深入研究，今后将从基因、分子水平及体外实验进一步深入探讨。

结论：在实验条件下，通过微弧氧化技术可在纯钛表面形成含有钙、磷成分粗糙多孔的氧化膜，该膜层有利于MC3T3-E1细胞在其表面的早期黏附，提高了细胞的增殖、分化及早期成骨能力，具有良好的生物活性。

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延伸阅读

骨是由无机盐、有机成分和水所构成。无机盐约占骨干质量的70%，由含碳酸根的羟基磷灰石晶体组成。羟基磷灰石是碳酸钙的氢氧化物，植入体内后钙和磷会游离出材料表面被组织吸收。因此，常用于制备生物活性涂层的无机物主要是磷酸钙盐。实验在电压420 V、占空比30%、频率100 Hz、处理时间5 min的条件下中制备微弧氧化膜层；电解液配方为0.2 mol/L乙酸钙、0.02 mol/Lβ-甘油磷酸二钠盐。乙酸钙为可溶性的弱酸盐，可与电解液中的β-甘油磷酸二钠盐反应生成含磷酸钙盐及磷酸氢钙盐的溶液。在微弧氧化进程中电解液中带有负电荷的磷酸钙、磷酸氢钙及磷酸根，在电场力的作用下移动到作为阳极的纯钛试件表面，从而有利于钛表面生成钙磷膜层。X射线能谱分析结果显示，膜层主要由钙、磷、碳和氧等元素组成，说明微弧氧化技术有效的将钙、磷元素带进膜层中。研究表明，种植体表面钙磷元素的出现对其表面性能和生物活性有着重要的影响，可以有效的促进种植体周围组织液发生离子交换，形成磷灰石层沉积。钙磷灰石层在化学成分与晶体结构上与骨的矿化接近，从而促进直接成骨和间接成骨的发生。钙离子还能够有效的促进细胞的生长。X射线衍射分析结果显示，膜层中出现磷酸钙、碳酸钙和钛酸钙相。Ca²⁺和PO₄³^－活性基团和蛋白的阴离子结合，还可以作为亲水成分增加表面润湿性，促进钛表面的水合作用，影响种植体表面蛋白质的构型和构象，促进细胞早期附着、增殖和分化；表面润湿性的增加还可以通过种植体表面和周围细胞间产生的离子力直接影响细胞的黏附，或者通过调节表面分子的吸收间接影响细胞的黏附。另一方面，实验经微弧氧化处理所形成的膜层为粗糙多孔的表面，形态不规则，孔径介于0.5-5.0 μm之间。这种不规则的微米级的粗糙表面能，有利于机械嵌合，同时促进骨组织的附着。研究表明，多孔结构有利于细胞的附着与增殖，可以诱导骨组织向孔内生长，从而提高种植体与周围骨组织的结合力。另外，膜层粗糙度轮廓算术平均偏差Ra值为（1.823±0.127）μm明显大于机械抛光纯钛表面的对应值（0.046±0.003）μm。以往研究显示，粗糙表面可以增大种植体的比表面积，随着种植体表面粗糙度的上升，与骨结合的表面积增大，细胞增殖率也显著增加。这些研究结果与本实验中微弧氧化膜层细胞活性检测的结果大致相同。细胞实验结果显示，较对照组而言，细胞在微弧氧化涂层表面黏附及成形更早：1 h后已开始伸出伪足，2 h大部分已呈现多角形，4 h伪足较长且显著，细胞形态也更为典型；另外，CCK－8结果显示在4，7 d，实验组的MC3T3-E1细胞的增殖活性大于对照组，在7，14d 微弧氧化实验组表面细胞碱性磷酸酶活性显著高于抛光对照组，这充分证实了含有钙、磷成分的粗糙多孔的微弧氧化膜层能显著促进细胞的早期黏附与增殖，提高材料的生物活性，提示微弧氧化技术是一种有效的钛金属表面处理技术。

钛表面微弧氧化涂层的细胞生物活性

Cell bioactivity of micro-arc oxidation coating on the surface of pure titanium

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