设计:动物实验观察。
时间及地点:实验于2012年6月至2013年2月在湖南中医药大学实验动物中心,经穴与脏腑相关重点研究室完成。
材料:
实验动物:雌性SD大鼠40只,SPF级,体质量250-280 g,由湖南中医药大学实验动物中心提供,实验动物许可证号:scxk(湘)2011-0003。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
电针对尿潴留大鼠膀胱容量及其组织形态学影响的主要仪器:
实验方法:
实验分组:大鼠常规饲养20 d后编号,随机选取10只作为空白组,其余30只制备骶髓完全横断性损伤模型,待造模成功后,采用随机摸球法均分为3组(n=10):模型组、电针穴位组、电针穴位对照点组。
动物模型制备:采用Hassan Shaker[16]脊髓横断法并参照相关文献[17]加以改良,制作大鼠骶髓横断模型及进行相关术后护理[16]。具体操作方法如下:除空白组外,其余30只大鼠禁食不禁水12 h后造模。造模前1 h腹腔注射青霉素20×104 U以预防感染,实验时予10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉[18],将大鼠俯卧固定于鼠板上,剔除腰骶部鼠毛,络合碘消毒术区皮肤,铺巾。大鼠骶髓损伤在S2-S4节段(对应椎体L2-L4)的任意部位[7],这次实验以L2-L3椎间隙为中心点(尾骨与骶骨相连的连接为第4骶椎下[19]),纵向切开皮肤约2 cm,逐层钝性分离。显露L2-L4的棘突和椎板,找到L2-L3椎间隙,切断棘间韧带,左手持弯止血钳夹住L3棘突,右手用蚊式钳将L2或和L3全椎板咬除,显露脊髓。右手用牙科探针大弯端从腹侧穿过,挑起脊髓,用眼科剪剪断或手术刀沿牙科探针切断脊髓,探针自然脱出即可。然后于横断处尾端切除2 mm,为保证脊髓全切,再用探针大弯端在脊髓横断处反复钩刮,随后止血、缝合,络合碘消毒伤口。皮下注射乳酸钠林格液2 mL以防止术后电解质紊乱。大鼠置于37 ℃恒温电热毯单笼饲养,观察术后大鼠肛温。自由进食、水,必要时滴管喂糖盐水,cred’s手法协助排尿、排便,3次/d,予青霉素20×104 U腹腔注射以防止伤口及尿路感染[20-21],前3 d每天2次,第4-7天1次/d,连用7 d后停用。
在动物脊髓休克期后,如果只有前肢参与行走,后肢在前肢行走时处于拖动状态,且在大鼠耻骨联合上缘触及胀大的膀胱,表示出现尿潴留的症状则认为是成功的骶髓损伤后神经源性尿潴留大鼠模型。
电针方法:
穴位定取:根据李忠仁主编《实验针灸学》及华兴邦制定的《实验动物图谱》提供的方法,并模拟人体腧穴骨度分寸法量取。①电针穴位组由“次髎”、“中极”、“三阴交”组成。次髎:在骶部髂后上棘内下方,第2骶后孔处,直刺约为15 mm;中极:下腹部前正中线上,神阙穴与耻骨联合上缘连线的上4/5与下1/5交点处,平刺5 mm(注:神阙穴为胸锁联合与耻骨的连线下1/4与3/4交点处[22]);三阴交:后肢内踝尖直上方1 cm处,直刺5 mm。②对照点组均为穴外侧旁开0.3 cm处取穴(中极取左侧),刺法同穴位组。
电针操作方法:造模后第15天起,除空白组大鼠外,均束缚于大铁笼盖上按组进行治疗:模型组只捆绑不电针;穴位组针刺后取双次髎为一组,左侧接正极,右侧接负极;中极,三阴交为一组,分别接负极、正极,三阴交穴隔日左右交替取穴,即治疗第1,3,5,7天取左侧三阴交,第2,4,6天取右侧三阴交。对照点组电针操作方法与穴位组相同。电针时间20 min,疏密波(10/50 Hz),强度以肢体轻微颤抖为度,1次/d,共7次。
治疗前后最大膀胱容量变化:所有大鼠均于造模后第14天和治疗7次后1天(即第22天),在大鼠清醒状态下所测的膀胱容量值分别作为治疗前、后最大膀胱容量。方法:①大鼠仰卧位绑于鼠板上,络合碘消毒大鼠尿道口、会阴部及腹股沟区。②参照相关文献[7]采用双管法,将1根事先充满生理盐水的且用灭菌石蜡油润滑的无菌3F导尿管(红色)插入尿道;按压膀胱,使膀胱内的残尿经红色导尿管尽量排净,并按同样的方法将黑色导尿管(注水管)导入膀胱。③然后用1 mL注射器向黑色导尿管内推注生理盐水,速度0.05 mL/s,注意使注射器与注水导尿管接合紧密,一边注射一边体会手下是否有阻力,观察出水管口是否有水滴溢出,若有溢出,此时的注水量即为膀胱的最大容量。④测量完毕,拔出注水管。将注入膀胱的生理盐水通过出水导尿管排净,络合碘消毒尿道口及会阴部。
光镜下观察膀胱组织细胞形态学变化:膀胱容量测定后(造模后第22天),所有大鼠予10%(5 mL/kg)水合氯醛腹腔过量麻醉,迅速剖腹取膀胱,冰生理盐水冲洗后于冰上分离。在膀胱颈、膀胱体和膀胱三角取 1 cm×1 cm组织块,40 g/L多聚甲醛室温下固定 24-48 h后,石蜡包埋,切片,进行苏木精-伊红染色并在光镜下观察膀胱组织形态,并用 Bx-70显微成像系统采集电脑图像。
主要观察指标:观察电针治疗前后各组大鼠最大膀胱容量、膀胱容量差值(d值)及光镜下膀胱组织细胞形态学特征。
统计学分析:采用SPSS 16.0进行数据分析,数据用x±s表示。所有资料均进行正态性检验;多组计量资料采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。自身前后对照采用配对设计均数比较,配对成功且子差值服从正态分布者采用配对t 检验。