2.1   生物学特性    2.1.1   水凝胶的定义与特性   水凝胶是一种由亲水性聚合物构成的三维网络结构，其聚合物链上含有大量的亲水基团，如羟基、羧基等，可以与水分子形成氢键，从而吸引大量的水分子进入凝胶内部[9]。除了吸水能力外，水凝胶还具有优异的生物相容性，为细胞的生长和分化提供适宜的条件[10]。水凝胶按原料可分为天然水凝胶和合成水凝胶。天然水凝胶有蛋白质水凝胶、多糖水凝胶、DNA水凝胶、脱细胞基质水凝胶等；合成水凝胶有聚乙烯醇水凝胶、聚丙烯酸水凝胶、丙烯酸酯基水凝胶等[11]。源自各种单体的水凝胶具有独特的理化性质和生物学特性，在组织工程和再生医学领域具有广泛的应用前景，可以应用于药物递送、组织工程、伤口敷料等多个方面[8]。 2.1.2   外泌体的来源与功能   外泌体是细胞在静止或应激条件下释放到细胞外空间的脂质双层膜结合囊泡，直径通常在30-150 nm之间[12]。外泌体可以由大多数类型的细胞释放，如间充质干细胞、T细胞、肿瘤细胞和上皮细胞等[13]。外泌体能够携带蛋白质、mRNA和miRNA等多种生物活性分子，在细胞间通讯和信号传递中发挥着重要作用，并可以被工程改造为治疗分子递送至靶细胞和组织，为疾病治疗提供了一种新的策略[7]。此外，外泌体已被证明在各种疾病中发生改变，并能够作为诊断和预后疾病的潜在生物标志物。 2.1.3   外泌体与水凝胶组合：组织工程创新，再生医学的新兴潜力   外泌体在组织修复过程中的细胞间通讯、细胞增殖和免疫调节中发挥着关键作用，已成为临床应用中“无细胞疗法”的有前途的途径[6]。然而外泌体的应用确实有一定的局限性，如半衰期相对较短、蓄积性差、难以靶向特定组织以及与大规模制备相关的挑战会影响其治疗效果，并阻碍其在实际环境中的广泛应用。因此，近年来的一个突出研究领域是将外泌体与水凝胶等生物材料的整合[11]。水凝胶能够有效地将外泌体输送到单个细胞，从而延长在组织损伤部位的保留时间，同时结合了水凝胶的良好生物相容性、可降解性、可调节性，在组织工程和再生修复如皮肤、骨骼、软骨、神经和肌腱的组织再生中发挥重要作用[7]。外泌体的发展及其与水凝胶联合应用见图3。"

2.2   负载外泌体的水凝胶在神经损伤修复中的应用    2.2.1   神经损伤修复的现状   神经损伤是一个紧迫的公共卫生问题，据估计每年约有数百万人受到神经损伤的影响，导致巨大的全球经济负担，其主要原因包括身体损伤、重大感染、自身免疫性疾病、手术干预等。神经损伤会造成神经的感觉和运动功能受损，并可能使患者终身残疾[14-15]。  根据神经损伤的程度不同，可采用不同的修复方法。非手术治疗方法有物理和药物治疗，主要包括电刺激和口服或静脉注射神经营养药物[16]。然而物理治疗的效果仍远未达到理想状态，全身给药会导致功能康复不足，因为不能在损伤部位提供有效的浓度。在间隙缺损的神经手术治疗中，显微缝合或自体神经移植是常用的修复策略。目前对于短神经修复，手术缝合通常被认为是最佳修复方法。然而，对于较大的神经缺陷直接缝合常导致过度张力和无效再生，因此这类缺陷通常需要神经移植，尤其是自体神经移植，是目前大型周围神经修复的主流治疗选择[17]。自体神经移植具有再生效果好(血管化程度高、吻合程度高)、免疫排斥反应小等优点，但也存在许多局限性和风险因素，包括供体部位发病率高、移植物大小不匹配、需要多次手术以及缺乏移植物来源等，这些局限性限制了自体移植物的结局和预后，促使需要开发人工替代品[18-21]。近年来，随着组织工程研究的进步，组织工程神经移植物被认为是自体神经移植物有前途的替代品，水凝胶与封装的外泌体相结合的方式修复神经组织损伤也得到了广泛关注，水凝胶的三维网络结构为外泌体提供了一个稳定的释放平台，使得外泌体能够持续、缓慢地释放其内部的生物活性物质，从而改善神经功能损伤、减少炎症和增强神经元再生[22-23]，神经损伤的修复类型见图4。"

2.2.2   负载外泌体的水凝胶在神经损伤修复中的作用   神经损伤的主要发病机制是缺血、氧化应激、炎症反应和凋亡途径[24]。新型外泌体-水凝胶联合疗法是一种很有前途的治疗策略，通过将外泌体直接输送到受伤部位并为组织修复提供支持支架，在神经修复中通过发挥抗炎、抗氧化和并刺激轴突生长和髓鞘再生作用，为神经损伤修复提供了一条有前途的途径[25-26]。 (1)抑制炎症反应及氧化应激水平：大量研究表明，神经损伤中早期炎症反应是有益的，因为它可以去除组织碎片并提高神经营养因子的水平。然而，当炎症反应持续存在时，炎症细胞将释放大量的炎性细胞因子、基质金属蛋白酶及活性氧，对周围的健康神经组织造成更多损害[27]。其中巨噬细胞是参与炎症反应的重要的效应细胞，损伤后募集的巨噬细胞将极化成 M1亚型，吞噬组织碎片和病原体参与炎症反应，随着炎症消退，它们将逐渐过渡到M2亚型，释放抗炎细胞因子，进而促进组织修复和再生[28]。此外，导致神经组织损伤的主要因素还有氧化损伤，活性氧的形成增加和随之而来的氧化应激是与神经组织损伤相关的关键事件。因此，降低炎症反应及氧化应激水平可以作为潜在的神经组织损伤的治疗策略。 NIE等[29]设计了一种纳米纤维支架透明质酸水凝胶贴片，以非侵入性方式将施万细胞来源的外泌体和甲泼尼龙释放到受伤的脊髓中，结果发现这种复合贴片显著改善了脊髓损伤后大鼠的功能和电生理性能；同时，在体外研究中发现这种复合贴片通过激活Toll样受体4/核因子κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路增加了M2型巨噬细胞的比例，从而抑制了炎症反应，减少了神经元凋亡。YANG等[30]设计了一种负载骨髓干细胞外泌体的电导水凝胶敷料，用于治疗糖尿病人群的周围神经损伤，结果表明这种电导水凝胶敷料通过激活核因子κB通路促进了M2巨噬细胞极化，进而减轻糖尿病周围神经的炎症性疼痛。另一项研究发现，与硬质水凝胶相比，加载人脐带间充质干细胞外泌体的光交联透明质酸/甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)软水凝胶通过抑制M1巨噬细胞中促炎因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的表达，可以更好地促进神经修复，这揭示了外泌体负载的水凝胶刚度通过调节外泌体释放行为在组织再生中起重要作用，为生物材料支架的临床应用提供了重要线索[31]。CHEN等[32]通过将含有芦丁的槐米外泌体封装在聚多巴胺修饰的水凝胶中，构建了用于脊髓损伤治疗的局部植入系统，研究表明这种水凝胶通过调节脊柱的炎症和氧化状况显著改善了受损的运动功能。LI等[33]用负载人类间充质干细胞外泌体的肽修饰的黏附水凝胶建立了一种创新的植入策略来修复脊髓损伤，结果显示这种水凝胶通过减轻炎症反应和氧化应激，显著促进了脊髓损伤的修复。 (2)促进轴突生长和髓鞘再生：神经元是神经系统最基本的结构和功能单位，主要通过神经轴突传递冲动信号而实现机体感觉及运动等功能[34]。髓鞘是围绕轴突的保护鞘，它促进了沿着神经元投射传播的神经冲动的传导，并允许细胞信号传导[35]。因此，促进损伤神经元轴突和髓鞘的再生和伸长，恢复神经冲动传递是促进神经功能恢复的关键。 LIU等[36]将人脂肪间充质干细胞衍生的外泌体包覆在基于聚乙烯亚胺和脱细胞猪神经的多重水凝胶上，以修复受损的小鼠坐骨神经，结果表明与单纯外泌体组和多重水凝胶组相比，负载脂肪间充质干细胞外泌体的多重水凝胶组促进了受损神经的感觉和运动功能恢复，并增强了髓鞘再生；进一步的研究揭示这一过程可能与下调集落刺激因子 1(colony-stimulating factor，CSF-1)/CSF-1受体轴相关联。AFSARTALA等[37]研究发现，与对照组(未经治疗的脊髓损伤大鼠)相比，封装在胶原蛋白和纤维蛋白水凝胶的脂肪间充质干细胞外泌体组可以改善大鼠脊髓损伤诱导的脊髓灰质炎和白质骨髓软化症，并促进神经丝及神经丝轻链多肽基因的mRNA表达显著升高。神经丝是成熟神经元中最丰富的成分，它与肌动蛋白和微管相互连接以形成细胞骨架。神经丝轻链多肽基因通过编码对神经丝形成至关重要的神经元蛋白，最近被证明是脊髓损伤轴突再生路径中第一个表达的神经丝基因，在轴突转运和神经传导速度中发挥重要作用[38]。另一项研究也发现了包覆人骨髓间充质干细胞外泌体的GelMA/LAPs水凝胶通过增加神经丝和突触素的表达，促进了脊髓损伤后的轴突再生。同时体外实验也证明了经这种水凝胶处理后显著增强了轴突延伸距离和背根神经节轴突的分支数量，进一步研究揭示了这是由于miR-431-3p/RGMA轴的关键参与[39]。LIU等[40]构建了一种透明质酸-胶原蛋白水凝胶，模拟了大脑细胞外基质环境，当与骨髓间充质干细胞外泌体结合使用时，该水凝胶可以促进病变血管生成，实现轴突再生、髓鞘再生、突触形成，甚至脑结构重塑，来修复创伤性脑损伤。 综上所述，负载各种来源干细胞外泌体的水凝胶通过抑制炎症反应及氧化应激，促进轴突及髓鞘再生等在神经损伤修复中发挥了重要作用，见表1，图5。"

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2.3   负载外泌体的水凝胶在创面修复中的应用    2.3.1   创面修复的现状   作为人体最大的器官，皮肤由各种细胞组成，维持体内平衡。伤口愈合对于维持和恢复皮肤损伤后表皮屏障的完整性至关重要。一般来说，伤口愈合会经历4个典型阶段，包括止血、炎症、增殖和组织重塑。然而，患者的伤口愈合受到许多因素的影响，特别是在糖尿病、高血压、风湿病和炎症性疾病患者中[41]。以糖尿病伤口为例，全世界有数亿糖尿病患者，其中10%-25%的糖尿病患者面临伤口愈合缓慢或糖尿病足溃疡。高血糖诱发的微血管功能障碍、周围神经病变和持续性炎症可能是延迟愈合的主要原因[42]。因此，递送生长因子、诱导新生血管形成、抑制炎症和氧化应激、招募活性细胞和抑制细菌活性构成了可用于糖尿病伤口管理的治疗方法[43]。 伤口愈合的临床治疗包括手术清创、移植物移植、伤口敷料、物理高压氧治疗等，然而这些方法的缺点，如愈合时间长、成本高、免疫排斥、易感染等，限制了它们的应用，因此，寻找一种更为高效、安全的创面修复方法成为了医学研究的热点之一。近年来，随着组织工程和再生医学的快速发展，负载外泌体的水凝胶作为一种新型的创面修复材料备受关注。间充质干细胞衍生的外泌体富含多种生物活性蛋白和RNA，通过抑制过度炎症反应、促进皮肤细胞增殖和迁移、增强血管生成，在加速伤口愈合和抑制瘢痕形成方面发挥双重作用[44]。而水凝胶作为一种具有优异生物相容性和可降解性的高分子材料，模仿天然细胞外基质的结构[45]，由水凝胶和外泌体组成的复合物可以作为缓释系统，发挥持久的治疗效果，为创面修复提供新的解决方案[46]。 2.3.2   负载外泌体的水凝胶在创面修复中的作用   负载外泌体的水凝胶具有良好的生物相容性和可降解性，能够减少免疫排斥和炎症反应，加速皮肤细胞增殖和迁移及胶原蛋白表达及促进血管形成，进而在创面修复中发挥着非常重要的作用。 (1)抑制炎症反应及氧化应激水平：炎症阶段对皮肤再生至关重要，炎症反应的开始和消失是皮肤再生的主要部分，也是决定愈合质量和时间的关键。巨噬细胞是重要的效应细胞，大致分为M1型和M2型，在伤口愈合过程的不同阶段发挥着关键作用。巨噬细胞当炎症表型M1转变为伤口愈合/纤维化促进表型M2时，炎症从炎症期转变为组织修复期[47]。此外，导致伤口愈合延迟的主要因素之一还有氧化损伤，这是由活性氧的过量产生引发的，通过对细胞成分造成损害、延迟愈合的炎症阶段和抑制新血管的形成来损害伤口愈合[48]。 SHI等[49]研究发现，负载于壳聚糖-没食子酸和氧化透明质酸多功能水凝胶的缺氧间充质干细胞外泌体通过调节巨噬细胞向M2表型极化，加速了糖尿病患者伤口的愈合，这可能是因为外泌体中的miR-4645-5p和水凝胶的抗氧化特性协同抑制了巨噬细胞中的SREBP2活性所导致。GENG等[50]设计了一种新型骨髓间充质干细胞衍生外泌体负载于羧乙基壳聚糖-二醛羧甲基纤维素水凝胶，用于慢性糖尿病伤口愈合，结果表明该复合水凝胶不仅促进了创面中血管的生成，还增强了M1型巨噬细胞向M2型的转化，从而降低了炎症反应，加速了糖尿病伤口愈合。ZHOU等[51]将脂肪间充质干细胞来源的外泌体封装在多元 F127水凝胶，结果发现，与仅使用脂肪间充质干细胞外泌体组或多元F-127水凝胶组相比，封装在多元 F127水凝胶的外泌体有效促进了伤口愈合，这主要是通过下调肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、CD68等炎症因子的表达和上调CD206(M2样巨噬细胞的标志物)的表达来实现的。另一项研究证明了使用丝素蛋白和丝胶形成的复合水凝胶递送的人脐带间充质干细胞外泌体能够促进伤口愈合，这主要是通过减少巨噬细胞的炎症和肿瘤坏死因子α炎性因子的分泌来抑制炎症反应[52]。 除了在炎症反应中发挥抑制作用，负载外泌体的水凝胶还可以通过降低氧化应激水平来促进伤口的愈合。XIANG等[53]研究发现含有人脐静脉内皮细胞外泌体的多功能脱细胞真皮基质水凝胶可以用于糖尿病的创口愈合，这主要通过降低糖尿病伤口的活性氧水平来实现的。JIANG等[54]利用负载脂肪间充质干细胞外泌体的MMP-PEG智能水凝胶治疗糖尿病伤口，在全层皮肤损伤后0，7和14 d记录伤口愈合区域，与对照组相比，单纯MMP-PEG水凝胶组和负载脂肪间充质干细胞外泌体的MMP-PEG智能水凝胶组均可加速糖尿病伤口修复，但负载脂肪间充质干细胞外泌体的MMP-PEG智能水凝胶组的愈合效率远高于MMP-PEG水凝胶，并且负载脂肪间充质干细胞外泌体的MMP-PEG智能水凝胶可以降低活性氧水平。  (2)加速皮肤细胞增殖和迁移及胶原蛋白表达：皮肤创口愈合的不同阶段可以驱动许多细胞协助活动，包括角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞等，以确保创面愈合[55]。此外皮肤中还有两种最丰富的蛋白质分别是胶原蛋白和弹性蛋白，胶原蛋白占外皮的50%-90%，具有多种类型，是健康皮肤结构和功能的重要成分之一，也是重塑受伤皮肤组织的重要标志。皮肤损伤后，蛋白质和细胞会受损和丢失，但会发生一连串高度调节和复杂的修复过程，以更新皮肤的完整性和结构，并维持外皮的稳态[56]。 一项研究表明脂肪干细胞外泌体通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/AKT/SREBP-1通路增强了皮脂细胞的增殖和迁移，从而加速了伤口愈合。皮脂细胞是皮脂腺中产生皮脂的主要细胞类型，损伤后的皮脂细胞再生被认为是功能性皮肤修复的关键要素[57]。JIANG等[54]研究发现，负载脂肪间充质干细胞外泌体的MMP-PEG智能水凝胶可以加速糖尿病伤口修复，它主要是促进了再上皮化、胶原沉积以及皮肤附属物重新生长，通过Western Blot分析证明，这种智能水凝胶改善了AKT的磷酸化，AKT是一种众所周知的增殖相关蛋白，所以水凝胶可以通过AKT途径改善细胞的增殖和迁移。LIU等[58]研究发现负载脂肪间充质干细胞外泌体的β-几丁质纳米纤维水凝胶显著加速伤口闭合，特别是促进了再上皮化及胶原蛋白表达；80和160 μg/mL脂肪间充质干细胞外泌体还可以促进小鼠成纤维细胞的增殖和迁移；此外，转录组学和蛋白质组学研究揭示了18个基因、516个转录本和250个蛋白质的表达变化，代谢通路、紧密连接、核因子κB信号通路在KEGG通路中富集。ZHENG等[59]发现负载人脐带间充质干细胞外泌体的Cu2+脱细胞细胞外基质水凝胶，在正常的动物伤口模型中可以增强成纤维细胞增殖和迁移、血管生成和胶原蛋白沉积。SHANG等[60]用人脐带间充质干细胞外泌体包封羧甲基壳聚糖、壳聚糖纳米颗粒、生物活性玻璃和TiO2为原料合成了复合水凝胶敷料，用于初步评估其对治疗全层皮肤缺损、糖尿病伤口和烧伤引起的烧伤皮肤损伤的影响。体内实验结果表明，复合水凝胶敷料加速了伤口愈合的效果，并增加了表皮厚度和胶原蛋白的沉积和抗炎因子的表达，这种创新的复合水凝胶敷料作为一种潜在的临床疗法，利用生物活性材料，有望作为一种潜在的临床疗法，旨在促进急性和慢性损伤皮肤组织的再生。  (3)促进血管形成：血管生成是伤口愈合的重要过程，可以将氧气和其他物质输送到伤口，从而促进细胞增殖、组织生长和修复。引起血管生成的最重要因素是血管内皮生长因子，这是一种促血管生成因子，可以控制内皮细胞迁移和分化，并增强内皮细胞募集，促进伤口组织的血管生成和内皮化。在修复和再生过程中，建立新的血管系统是完全愈合不可或缺的阶段[61]。 二甲双胍是一种常用的糖尿病药物，在高糖环境中起着重要的微血管保护作用。ZHANG等[62]研究发现外泌体/二甲双胍负载的自愈导电水凝胶通过干扰线粒体裂变、减少活性氧产生和维持F-肌动蛋白稳态来促进人脐静脉内皮细胞迁移和新生血管形成，从而加速慢性糖尿病小鼠的伤口愈合。F-肌动蛋白是内皮细胞动员的关键应激纤维，高糖环境中血管内皮细胞迁移受损与F-肌动蛋白稳态失调密切相关。缺氧预处理的脂肪干细胞外泌体包埋GelMA水凝胶通过激活 miR-144-3p/NFE2L2/缺氧诱导因子1α信号传导促进了血管生成并加速糖尿病伤口愈合，这主要是因为外泌体中的circ-Snhg11增加了血管内皮细胞的迁移、增殖和血管再生潜力[63]。另一项研究将表皮干细胞衍生的细胞外囊泡也负载了这种VH298小分子化合物，并进一步制备了用于VH298-细胞外囊泡持续释放的GelMA水凝胶，结果发现这种水凝胶通过激活缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子A信号通路增强了创面的血液供应和血管生成，有效促进了伤口愈合[64]。LI等[65]将含有miR-126-3p的过表达滑膜间充质干细胞外泌体封装在羟基磷灰石/壳聚糖复合水凝胶中作为伤口敷料，结果表明这种伤口敷料通过激活MAPK/ERK和PI3K/AKT刺激人真皮成纤维细胞和人真皮微血管内皮细胞的增殖和迁移；同时体内测试也表明，这种水凝胶成功促进了伤口表面再上皮化、加速血管生成并加速胶原成熟。血浆外泌体被认为是纳米级治疗剂，在促进糖尿病伤口愈合方面显示出治疗功效。SHI等[61]制备了血浆外泌体负载的pH响应性羧甲基纤维素水凝胶，以研究其加速糖尿病伤口愈合的能力并探索潜在机制，结果表明这种水凝胶促进了糖尿病1型小鼠的局部伤口愈合过程，主要是通过激活血管内皮生长因子介导的血管生成相关途径增强了血管生成和再上皮化。一项研究将PF-127水凝胶和含miR-148a-3p的人脂肪间充质干细胞外泌体联合应用以研究对组织修复的影响，并使用体外和体内实验探索潜在机制，miR-148a-3p是人脂肪间充质干细胞外泌体中表达最多的 microRNA，结果显示外泌体与PF-127水凝胶联合使用比单独使用外泌体具有更好的疗效，并且将miR-148a-3p敲低降低了其疗效；进一步研究证明了miR-148a-3p对人脂肪间充质干细胞外泌体的影响是通过预防PTEN和PI3K/AKT信号传导来实现的[66]。 综上所述，负载外泌体的水凝胶在创面修复中展现出了独特的机制，通过提供适宜的生长环境、促进细胞迁移和增殖以及调控创面微环境，显著加速创面的愈合过程，提高愈合质量。见表2，图6。"

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